邱 慧，毛盛芳

（南昌市洪都中醫(yī)院，江西 南昌 330000）

磷酸二酯酶5（phosphodiesterase 5，PDE5）型抑制劑是一種通過抑制PDE活性治療男性陽痿和勃起功能障礙的藥物。主要有西地那非、伐地那非、他達那非等，當(dāng)服用較大劑量的PDE5型抑制劑時會引起頭疼、消化不良、頭暈、皮疹等不良反應(yīng)，且PDE5還會作用于任何一種長效或短效的硝酸酯類藥物，使其降壓作用增強，可能會引發(fā)致命性的低血糖，甚至導(dǎo)致死亡[1-2]。為了使含中藥材的性保健品具有速效功能，一些不法商家從中添加PDE5型抑制劑，消費者購買后如果超劑量服用，會導(dǎo)致嚴重的不良反應(yīng)，給社會帶來危害。

目前已有多種方法用于非法添加PDE5型抑制劑的檢測，如薄層色譜法、高效液相色譜法（紫外檢測器）及高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[3-6]，但有的方法檢測品種有限，有的方法僅能用于定性檢測。作為已有方法的補充，本文建立一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）同時測定性保健品中6種常見的PDE5型非法添加物，以期對宣稱具有補腎壯陽功效的性保健品進行監(jiān)督檢測，同時為打擊不法商家非法添加PDE5型抑制劑提供有效的技術(shù)支撐。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

4000 QTRAP型電噴霧解離三重串聯(lián)四級桿線性離子阱質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX公司）；Ekspert UltraLC100型超高效液相色譜儀（美國AB SCIEX公司）；ME204E型電子分析天平（瑞士梅特勒公司，精度為0.0001 g）；XS105 DualRange型電子分析天平（瑞士梅特勒公司，精度分別為0.01 mg/0.1 mg）；KQ-250DB型數(shù)控超聲清洗器（昆山超聲儀器公司）；FST-RO-10型超純水機（上海普利菲爾公司）。

1.2 試藥

實測樣品來自南昌市食品藥品監(jiān)督管理局抽檢樣品（A公司，批號：170302-005，規(guī)格：3800 mg/片）；西地那非（批號：510068-201401，純度99.9 %），偽伐地那非（批號：520041-201401，純度99.0 %），氨基他達拉非（批號：520042-201401，純度99.8 %）均購自中國食品藥品檢定研究院；伐地那非鹽酸鹽（批號：1132-035A1，純度99.3 %，上海安普）；他達拉非（批號：AM150322-12，純度99.02 %，美國斯坦?；瘜W(xué)有限公司）；那莫西地那非（批號：1646-055A2，純度99.9 %，加拿大TLC PharmaChem公司）。甲醇，乙腈為色譜純（購自德國Merck公司）；其余試劑均為分析純；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相A為0.02 mol/L乙酸銨溶液（含0.1 %乙酸），流動相B為甲醇；梯度洗脫程序：0～2 min，55 %B；2～20 min，55 %～90 %B。柱溫35 ℃；流速0.25 ml/min；進樣量10 μl。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子化正離子模式（ESI+）；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；氣簾氣（curtain gas）壓力：35 psi；電噴霧電壓（ionspray voltage，IS）：5500 V；霧化器壓力（GS1）：45 psi；輔助氣壓力（GS2）：55 psi；離子源溫度（TEM）：500 ℃；碰撞活化解離能（CAD）：中（medium）。根據(jù)6種PDE5型化合物的結(jié)構(gòu)與二級質(zhì)譜碎片信息（見圖1），并結(jié)合質(zhì)譜響應(yīng)大小，最終確定6種PDE5型化合物的質(zhì)譜參數(shù)，見表1。

圖1 6種PDE5型化合物的結(jié)構(gòu)圖和二級質(zhì)譜碎片信息

表1 質(zhì)譜條件

上述條件下獲得的6種PDE5型化合物總離子 流色譜圖（TIC）見圖2。

圖2 6種成分的總離子流色譜圖

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品儲備溶液的制備 取西地那非、偽伐地那非、氨基他達拉非、伐地那非、他達拉非、那莫西地那非對照品各約10 mg，精密稱定，置入100 ml量瓶，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，封口，于5 ℃冰箱冷藏保存，作為對照品儲備液（100 μg/ml）。

2.3.2 混合對照品溶液的制備 分別取對照品儲備液適量，置入100 ml量瓶，加50 %甲醇稀釋至刻度，制成濃度分別為20，40，80，120，160，200 ng/ml的系列溶液，搖勻，濾過，作為混合對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取本品，研細，稱取約0.1 g，精密稱定，置入50 ml量瓶，加乙腈約40 ml，超聲處理（功率250 W，頻率55 kHz）15 min，冷卻至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密移取續(xù)濾液適量，用50 %甲醇稀釋至指標(biāo)成分線性濃度范圍內(nèi)，搖勻，濾過，即得。

2.4 專屬性試驗

取2.3.3項下供試品溶液，按2.2項條件進行質(zhì)譜掃描，將掃描的色譜圖與對照品溶液進行比對，結(jié)果顯示匹配度98 %，表明樣品中的相關(guān)物質(zhì)對目標(biāo)物的測定不產(chǎn)生干擾，該方法專屬性良好。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)考察

為考察基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）的影響，分別使用50 %甲醇水溶液和空白基質(zhì)溶液配制混合對照品溶液，按2.1、2.2項色譜與質(zhì)譜條件進行測定（吸收度分別為Asi、Ami），并按下式計算ME值，結(jié)果ME值在98 %～103 %范圍內(nèi)浮動，表明可忽略ME對樣品測定的影響。

ME=Asi/Ami

2.6 線性關(guān)系與檢出限

取2.3.2項下混合對照品溶液，按2.1、2.2項下色譜與質(zhì)譜條件進行測定，以各組分峰面積y對質(zhì)量濃度x（ng/ml）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)見表2。結(jié)果表明，6種指標(biāo)成分在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系均較好，相關(guān)系數(shù)均大于0.995。

取2.3.2項下最低濃度的混合對照品溶液，倍比稀釋，按2.1、2.2項下條件測定，以信噪比為3:1時為檢出限（LOD），結(jié)果見表2。6種成分檢出限均在1.0 ng/ml以下，表明該方法具有較高的靈敏度，能滿足非法添加化學(xué)藥物的檢測要求。

表2 6種PDE5型化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限

表3 6種PDE5型化合物的精密度結(jié)果

2.7 中間精密度試驗

取對照品儲備液適量，用50 %甲醇配制成濃度分別為25，100，175 ng/ml的質(zhì)量控制（QC）樣品，每個質(zhì)量濃度平行制備6份，并連續(xù)測定3 d，記錄峰面積，代入當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算質(zhì)量濃度，計算本方法的精密度，結(jié)果見表3。結(jié)果表明本方法的精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取空白樣品（批號：170302-005）適量，研細，稱取約0.1 g，精密加入對照品儲備溶液（100 μg/ml）60 μl，按2.3.3項方法制成供試品溶液，室溫放置，按2.1、2.2項下條件分別于0，2，4，6，8，10，12 h進樣測定。結(jié)果西地那非、偽伐地那非、氨基他達拉非、伐地那非、他達拉非、那莫西地那非峰面積的RSD分別為2.55 %，2.14 %，3.43 %，2.38 %，3.19 %，2.26 %，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗

取空白樣品（批號：170302-005）適量，研細，稱取約0.1 g，精密加入對照品儲備溶液（100 μg/ml）60 μl，按2.3.3項方法制成供試品溶液，共6份，按2.1、2.2項下方法進行測定。結(jié)果西地那非、偽伐地那非、氨基他達拉非、伐地那非鹽酸鹽、他達拉非、那莫西地那非峰面積的RSD分別為2.86 %，3.05 %，3.71 %，4.25 %，2.89 %，4.12 %，表明方法重復(fù)性良好。

2.10 加標(biāo)回收率試驗

取空白樣品適量，研細，稱取約0.5 g，精密稱定，置入50 ml量瓶，精密加入對照品儲備液適量，制成低、中、高3種濃度的加標(biāo)樣品，每種濃度水平各3份，按2.3.3項下方法制成加標(biāo)供試品溶液，并按2.1、2.2項下色譜與質(zhì)譜條件進行測定。測得6種化合物的加標(biāo)回收率（見表4）在90 %～115 %之間。RSD均小于5 %。表明本方法回收率較好。

表4 6種PDE5型化合物回收率試驗結(jié)果

2.11 耐用性實驗

取濃度水平為100 ng/ml的混合對照品溶液，分別考察流動相的流速（0.2，0.25，0.3 ml/min）、色譜柱柱溫（30，35，40 ℃）、離子源溫度（500，550，600 ℃）及色譜柱（Shimadzu Shim-pack VP-ODS，150 mm×2.0 mm，5 μm；Agilent Zorbax-C18，150 mm×2.1 mm，3.5 μm）等因素對測定物質(zhì)的影響，結(jié)果表明以上因素對測定無影響，該方法的耐用性良好。

2.12 樣品測定

采用本方法對市售的20批宣稱具有補腎壯陽功能的食品進行測定，其中在17批檢品中檢出西地那非，含量為12～31 mg/g，檢出率為70 %，這其中僅有兩批同時檢出少量他達拉非，含量為10 mg/g；另外3批均未檢出所測指標(biāo)成分。

3 討論

3.1 提取方法的優(yōu)化

本研究考察了提取溶劑（50 %甲醇、100 %甲醇、50 %乙腈、100 %乙腈）和超聲時間（15，30，45 min）對提取效率的影響，結(jié)果表明100 %乙腈為提取溶劑時提取效率最佳，超聲時間對提取效率的影響較小，因此從節(jié)省時間的角度考慮，本實驗最終選取100 %乙腈超聲提取15 min為提取方法。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

實驗考察了甲醇-含0.1 %乙酸的0.02 mol/L乙酸銨溶液、甲醇-0.02 mol/L乙酸銨溶液、甲醇-0.1 %乙酸溶液對分離效果及質(zhì)譜響應(yīng)的影響。結(jié)果表明，含乙酸銨的流動相色譜峰峰形更好，含0.1 %乙酸的流動相質(zhì)譜響應(yīng)更強，因此本實驗最終采用甲醇-含0.1 %乙酸的0.02 mol/L乙酸銨溶液為流動相。

3.3 MS條件的優(yōu)化

根據(jù)化合物自身特點，其為含N的生物堿類成分，易結(jié)合H+形成正離子，因此本文采用ESI+模式進行電離檢測。采用一級全掃描（Q1 Scan）、二級產(chǎn)物離子掃描模式（PI Scan）選擇備用離子對，然后進行去簇電壓（DP）、碰撞電壓（CE）優(yōu)化，選取豐度較強、干擾小的兩個離子對分別作為定性、定量離子對。

4 結(jié)論

本文首次建立了UPLC-MS/MS定量分析性保健食品中6種PDE5型非法添加物的方法。該法前處理簡單、快速，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確。檢測范圍覆蓋市場上常見的PDE5型化合物?？蔀楸O(jiān)管部門打擊不法商家在性性保健食品中進行非法添加提供技術(shù)支撐。