莊偉香，李 輝，黃木土，李 冬，劉 珊，李 健

（1.中國(guó)人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科；2.廣州市老年慢病患者合理用藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510010）

胃潰瘍是臨床常見的消化系統(tǒng)疾病，致病因素較多，病理機(jī)制迄今尚未完全清楚[1-2]，近年消化性潰瘍的發(fā)病率逐年增長(zhǎng)。中醫(yī)藥在治療胃潰瘍方面有淵源深厚的理論基礎(chǔ)和大量豐富的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，可發(fā)揮中藥多成分多靶點(diǎn)的作用優(yōu)勢(shì)[3]。胃康散在我院一五七臨床部臨床應(yīng)用多年，療效顯著，是由海螵蛸、白礬、白及、鐘乳石（煅）、兩面針、延胡索、甘草等藥材組成，出自《廣州部隊(duì)醫(yī)院制劑選編（1989）》，又名復(fù)方入地金牛散，主要用于制酸止痛，止血生肌，是治療活動(dòng)性胃潰瘍的中藥制劑。處方中海螵蛸為君藥；白及為臣藥；兩面針、延胡索為佐藥，甘草為使藥。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅包括顯微鑒別法和化學(xué)反應(yīng)法，處方中碳酸鈣等其他礦物質(zhì)成分較多，不能追蹤該成分從藥材到制劑的轉(zhuǎn)移過程，而氯化兩面針堿僅存于兩面針中，其轉(zhuǎn)移過程易追蹤。因此，本實(shí)驗(yàn)擬建新的質(zhì)量控制方法，對(duì)處方中白及、延胡索、甘草進(jìn)行薄層色譜（TLC）定性鑒別，采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定處方中氯化兩面針堿的含量，為其進(jìn)一步開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Agilent 1260系列，包括二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣裝置、DAD檢測(cè)器、柱溫箱等），（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）水循環(huán)式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；HWS-28型恒溫電熱水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；KP03型超聲儀（廣州市科普超聲電子技術(shù)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

胃康散（中國(guó)人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院自制制劑，批號(hào)：171130，170331，180424。規(guī)格：3 g）；白及對(duì)照藥材（批號(hào)：121262-201405），甘草對(duì)照藥材（批號(hào)：120904-201519），延胡索乙素對(duì)照品（批號(hào)：120928-201006），氯化兩面針堿對(duì)照品（批號(hào)：110848-200603）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；硅膠G薄層板（美國(guó)默克公司）；水為兩重蒸餾水，甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性分析

2.1.1 延胡索的鑒別 取胃康散3 g，加甲醇50 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 ml溶解，加濃氨試液調(diào)至pH 11～12[4-5]，用乙醚振搖提取3次，每次10 ml，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液[6]。另取延胡索乙素對(duì)照品適量，加適當(dāng)甲醇制成1 mg/ml的對(duì)照品溶液。再按制備工藝，配制不含延胡索的陰性樣品，同供試品溶液配制方法制成陰性對(duì)照液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502）試驗(yàn)[7]，吸取樣品溶液和陰性對(duì)照液各10 μl，對(duì)照品溶液2 μl，分別依次點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-三氯甲烷-甲醇（7.5:3.5:1）為展開劑（充分預(yù)飽和），室溫展開，上展約8 cm處，取出。晾干后置碘缸熏至斑點(diǎn)顯色清晰，約6 h后揮去板上吸附的碘后，置紫外燈（365 nm）下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同綠色熒光主斑點(diǎn)。陰性對(duì)照無(wú)干擾。見圖1。

圖1 延胡索TLC圖 （紫外燈下觀察）

2.1.2 白及的鑒別 取胃康散9 g，加70 %甲醇80 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 ml使溶解，用乙醚振搖提取2次，每次20 ml，合并乙醚液，揮至1 ml，作為供試品溶液[8]。取白及對(duì)照藥材0.5 g及缺白及藥材的陰性供試品9 g，同法制得白及對(duì)照藥材溶液和缺白及的陰性供試品溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502）試驗(yàn)[7]，吸取上述3種溶液各15 μl，依次點(diǎn)于同一硅膠G薄層板相應(yīng)位置上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇（6:2.5:1）為展開劑，室溫展開，取出，晾干后噴以10 %硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，并且室溫放置數(shù)小時(shí)。供試品色譜中，日光下檢視在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的黃色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。見圖2。

圖2 白及TLC圖

2.1.3 甘草的鑒別 取胃康散5 g，加乙醇20 ml，超聲處理30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? ml使溶解，作為供試品溶液[9-11]。取甘草對(duì)照藥材2 g及缺甘草的陰性供試品5 g，同上法制得甘草對(duì)照藥材溶液和缺甘草的陰性供試品溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502）試驗(yàn)[7]。吸取供試品溶液和缺甘草的陰性供試品溶液各10 μl、甘草對(duì)照藥材溶液5 μl，分別依次點(diǎn)于同一硅膠G薄層板相應(yīng)位置上，以三氯甲烷－甲醇－水（40:10:1）為展開劑（充分預(yù)飽和），室溫展開，取出。晾干后噴以10 %硫酸乙醇溶液，并在105 ℃條件下加熱至斑點(diǎn)清晰。供試品色譜中，日光下檢視在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相黃色的主斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。見圖3。

圖3 甘草TLC圖

2.2 氯化兩面針堿的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Agilent 5 TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1 %磷酸（用N,N-二乙基乙胺調(diào)pH值6.0）（60:40）；檢測(cè)波長(zhǎng)：273 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量10 μl[12]。

2.2.2 對(duì)照品溶液 取氯化兩面針堿適量，精密稱定，置200 ml量瓶，加80 %甲醇制成76.1 μg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。用移液管精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液5 ml至20 ml量瓶，加80 %甲醇稀釋至刻度，即得。

2.2.3 供試品溶液 取胃康散精密稱約10.0 g，樣品置100 ml錐形瓶，加入80 %甲醇30 ml，超聲處理30 min，室溫放冷，濾過至50 ml量瓶，并用80 %甲醇適量3次潤(rùn)洗錐形瓶和濾紙，并定溶至刻度，搖勻后用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液 按處方量配制不含兩面針的陰性樣品，再按2.2.3項(xiàng)下方處理，即得。

2.2.5 專屬性考察 分別取對(duì)照品、供試品和陰性樣品溶液各10 μl，以2.2.1項(xiàng)下條件進(jìn)樣，結(jié)果見圖4，氯化兩面針堿約在6.3 min出峰，在該測(cè)定條件下，供試品中氯化兩面針堿峰與雜質(zhì)分離度良好，陰性樣品中氯化兩面針堿出峰位置無(wú)雜質(zhì)峰的干擾，方法專屬性好。

圖4 胃康散專屬性色譜圖

2.2.6 線性關(guān)系考察 分別精密取貯備液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 ml，置入10 ml量瓶，加80 %甲醇定容至刻度，得濃度依次為7.61，15.22，30.44，45.66，60.88，76.1 μg/ml的對(duì)照品溶液[13]。按2.2.1項(xiàng)下條件，精密吸取上述系列溶液各10 μl順次注入液相色譜儀。進(jìn)行線性回歸分析，以氯化兩面針堿質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=54.67X-2.335，r=0.9995 （n=6），氯化兩面針堿在7.6～76.1 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，精密吸取2.2.6項(xiàng)下濃度為45.66 μg/ml的氯化兩面針堿對(duì)照品溶液10 μl注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。其RSD為0.57 %，表明該系統(tǒng)及方法精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取胃康散（批號(hào)：171130）適量，按2.2.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，分別放置于第0，2，4、6，8，10，12，14，16，18 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積并計(jì)算含量，得氯化兩面針堿峰面積RSD為0.93 %，表明樣品溶液在室溫放置條件下18 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取胃康散（批號(hào)：171130）6份，精密稱定每份10.0 g，按2.2.3項(xiàng)下方法操作。再按2.2.1項(xiàng)下方法平行操作6次，該批號(hào)氯化兩面針堿的平均含量為82.73 μg/g，RSD為2.1 %，表明該系統(tǒng)和方法的重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取胃康散（批號(hào)：171130）9份，每份約5.0 g，精密加入對(duì)照品貯備溶液適量，按2.2.3項(xiàng)下操作方法提取，再按2.2.1項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算平均加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 氯化兩面針堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.2.11 樣品含量測(cè)定 精密稱取胃康散3批（批號(hào)：171130、170331、180424）各適量，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，然后按所建方法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品中氯化兩面針堿含量分別為0.2440，0.2972，0.2676 mg/袋。

3 討論

3.1 薄層鑒別

延胡索薄層色譜鑒別中，筆者參考《中國(guó)藥典》2015年版一部延胡索藥材薄層鑒別項(xiàng)下方法，發(fā)現(xiàn)上述條件展開效果尚可，但主斑點(diǎn)的分離效果欠佳，背景太深。隨后筆者比較了不同的展開劑系統(tǒng)正己烷-三氯甲烷-甲醇（7.5:3.5:1）、環(huán)己烷-乙醚-甲醇（3:5:0.5），結(jié)果以正己烷-三氯甲烷-甲醇（7.5:3.5:1）為展開劑，用碘蒸氣熏至各斑點(diǎn)顯色清晰，數(shù)小時(shí)（約6 h）揮盡板上吸附的碘后，在紫外燈（365 nm）下檢視，其斑點(diǎn)顯色清晰，且陰性樣品無(wú)干擾。白及的鑒別采用了《中國(guó)藥典》（2015年版）一部白及藥材的薄層鑒別方法，本次未加修改，其色譜圖中黃色斑點(diǎn)（比移值約0.385）為主斑點(diǎn)，陰性對(duì)照樣品也無(wú)干擾。本次甘草鑒別，其樣品采取超聲的方式進(jìn)行提取，最后噴以10%硫酸乙醇溶液，并在105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰，立即置日光下檢視，樣品與甘草對(duì)照藥材色譜中的2個(gè)黃色斑點(diǎn)（比移值約0.255、0.375）為主斑點(diǎn)，其陰性對(duì)照樣品也無(wú)干擾。

3.2 HPLC含量測(cè)定溶劑提取的選擇

根據(jù)氯化兩面針堿[14-16]的化學(xué)性質(zhì)，實(shí)驗(yàn)中分別考察了（20 %、50 %、80 %）甲醇、乙醇，也嘗試了利用濃氨試液-甲醇（1:20）混合提取氯化兩面針堿[17]。結(jié)果以80 %甲醇、乙醇超聲處理30 min提取氯化兩面針堿，測(cè)定峰面積較大。綜合考慮，最終選定了80 %甲醇作為提取溶劑，其色譜圖雜質(zhì)峰較少，與相鄰的色譜峰有很好的分離度。

3.3 HPLC含量測(cè)定中檢測(cè)波長(zhǎng)及流動(dòng)相的選擇

本研究的檢測(cè)波長(zhǎng)，直接選擇了《中國(guó)藥典》2015年版一部?jī)擅驷標(biāo)幉暮繙y(cè)定項(xiàng)下的檢測(cè)波長(zhǎng)。流動(dòng)相先后考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1 %磷酸水溶液、甲醇-0.1 %磷酸水溶液系統(tǒng)[18-21]，試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，氯化兩面針堿峰型較寬，存在拖尾現(xiàn)象，只有選擇甲醇-0.1 %磷酸溶液用作流動(dòng)相，拖尾現(xiàn)象得以解決，分離效果好，但峰型較寬。隨后筆者將0.1 %磷酸水溶液pH值用N,N-二乙基乙胺調(diào)為6.0時(shí)，其色譜峰與其他雜質(zhì)峰分離度最好，保留時(shí)間適中，峰形好，故本試驗(yàn)流動(dòng)相得以確定。