紀(jì) 超，馬炬雷，舒 鵬

寧波市北侖區(qū)人民醫(yī)院 浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院北侖分院 1檢驗(yàn)科 2手足外科 3分子實(shí)驗(yàn)室，浙江寧波 315800

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是骨髓中漿細(xì)胞異常增生的一種惡性腫瘤，屬于成熟B細(xì)胞腫瘤，其特征是單克隆漿細(xì)胞過(guò)度增生(超長(zhǎng)增生)，并產(chǎn)生單克隆免疫球蛋白，骨髓中單克隆漿細(xì)胞的異常增生及侵犯骨髓，引起骨骼破壞、骨痛或骨折、貧血、高鈣血癥、腎功能不全及免疫功能異常。MM的預(yù)后極差，復(fù)發(fā)率極高，被認(rèn)為是一種不可治愈的疾病[1]。MM依賴的信號(hào)通路十分復(fù)雜，其中重要的信號(hào)通路為核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)通路，在MM中有50%～70%患者存在NF-kB信號(hào)通路的持續(xù)異常激活[2]，同時(shí)NF-κB通路的抑制與MM細(xì)胞活性密切相關(guān)[3]，因此運(yùn)用靶向治療藥物硼替佐米抑制NF-κB通路能夠收到很好的效果，但隨著靶向治療藥物不斷地運(yùn)用于治療，腫瘤的耐藥以及腫瘤的復(fù)發(fā)成為亟待解決的問(wèn)題[4]，MM的耐藥中，泛素化通路至關(guān)重要，泛素是存在于細(xì)胞中的一種小分子，泛素分子能夠通過(guò)泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3等一系列酶的催化從而結(jié)合到靶蛋白，同時(shí)泛素的解離主要通過(guò)去泛素化酶完成[5]，泛素與靶蛋白的結(jié)合最早被認(rèn)為通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解靶蛋白，隨著研究的深入，泛素被認(rèn)為是一種重要的翻譯后修飾方式，參與了蛋白的定位、細(xì)胞周期等過(guò)程[6]，泛素化通路對(duì)于MM耐藥的研究主要集中于泛素連接酶E3與去泛素化酶，其中泛素連接酶E3 Pirh2可通過(guò)c-myc、p53參與硼替佐米誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、凋亡和周期調(diào)控[7]，去泛素化酶USP7抑制劑則已投入到臨床的使用中，泛素E3連接酶(denticleless E3 ubiquitin protein ligase，DTL)則屬于泛素連接酶E3的一種[8]，其在MM中的表達(dá)研究較少。本研究主要闡述DTL在多發(fā)性骨髓瘤患者中的表達(dá)及其相應(yīng)的生物學(xué)意義，并簡(jiǎn)要探討其相關(guān)機(jī)制。

材料和方法

材料1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基(貨號(hào)：11875127)與胎牛血清(貨號(hào)：11573397)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊锛夹g(shù)有限公司(貨號(hào)：LTS1077N)，CD138+細(xì)胞磁珠分選試劑盒購(gòu)自美國(guó)Stem cell公司(貨號(hào)：18000)，人MM細(xì)胞系RPMI8226購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)，對(duì)照(control，CON)組與DTL敲低(DTL-short hairpin RNA，DTL-shRNA)組慢病毒載體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，CCK8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所(貨號(hào)：CK04)，甲基纖維素粉末購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(貨號(hào)：M0512)，實(shí)時(shí)定量PCR引物由北京奧克鼎盛公司合成，DTL一抗購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司(貨號(hào)：PA5- 42842)，P65(貨號(hào)：8242)、磷酸化P65(貨號(hào)：3033)、抑制因子κBα(inhibitory subunit-κBα，IκBα)(貨號(hào)：5209)、磷酸化IκBα(貨號(hào)：2859)、GAPDH(貨號(hào)：5174)、β-actin(貨號(hào)：3700)一抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Signal Technology，相應(yīng)二抗均購(gòu)自北京中杉金橋公司，所有一抗二抗均為單抗，ECL發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)賽默飛司(貨號(hào)：NCI5080)，膜聯(lián)蛋白 V別藻藍(lán)素/碘化丙啶雙染試劑盒購(gòu)自天津三箭生物公司(貨號(hào)：AO2001- 11P-G)，細(xì)胞周期中高濃度碘化丙啶染料購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(貨號(hào)：P4170)，核蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司(貨號(hào)：C500009)，NF-κB與有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白- 1對(duì)照生物素標(biāo)記探針購(gòu)自碧云天公司，序列為NF-κB 正向：5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC- 3’ NF-κB 反向：5’-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG- 3’；有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白- 1 正向：5’-TGTCGAATGCAAATCACTAGAA- 3’，反向：5’-ACAG-CTTACGTTTAGTGATCTT- 3’。

細(xì)胞培養(yǎng)與分組初發(fā)MM患者與健康志愿者骨髓標(biāo)本來(lái)自寧波市北侖區(qū)人民醫(yī)院，RPMI8226 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)于1640+10% 胎牛血清，RPMI8226分別分為CON與DTL-shRNA組，分別感染10感染復(fù)數(shù)(病毒∶細(xì)胞=10∶1)的CON與DTL-shRNA慢病毒。

CD138+細(xì)胞分離提取健康志愿者和骨髓瘤患者骨髓標(biāo)本使用PBS溶液稀釋4倍后，加入到等體積的淋巴細(xì)胞分離液中，1500 r/min(轉(zhuǎn)子半徑116 mm)密度梯度離心后，吸取位于中間的淋巴細(xì)胞層，從而得到單個(gè)核細(xì)胞，骨髓瘤標(biāo)本單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)一步CD138+細(xì)胞磁珠分選試劑盒分離提取CD138+細(xì)胞，操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

CON與DTL-shRNA慢病毒包裝純化CON與DTL-shRNA慢病毒包裝采用Addgene第3代慢病毒包裝系統(tǒng)：VSV-G包膜質(zhì)?！肏IV- 1病毒骨架質(zhì)粒∶目的質(zhì)粒=1∶3∶4轉(zhuǎn)染至293t細(xì)胞中，分別收取36、48、72 h病毒上清，聚乙二醇沉淀純化并分裝。

CCK8檢測(cè)骨髓瘤細(xì)胞增殖骨髓瘤細(xì)胞系RPMI8226感染CON與DTL-shRNA慢病毒48 h后，分別種于96孔板中，每孔3000細(xì)胞，設(shè)立副孔，加入1/10體積的CCK8試劑，37 ℃孵育3 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm吸光度，分別在0、24、48、72、96 h檢測(cè)，并以0 h為對(duì)照，分別計(jì)算24、48、72、96 h與0 h的比值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值以判定細(xì)胞增殖的變化。

克隆形成實(shí)驗(yàn)(1)取4000個(gè)CON與DTL-shRNA RPMI8226細(xì)胞置于2 ml完全培養(yǎng)基中，并加入白介素- 6使終濃度為40 ng/ml。(2)細(xì)胞懸液與2 ml 甲基纖維素1640溶液混合。2 ml 甲基纖維素1640溶液配制：8 g甲基纖維素粉末加入200 ml超純水中，轉(zhuǎn)子攪拌至甲基纖維素溶解，將1640粉末按2倍的量加入到100 ml超純水中，二者等體積混合得到2 ml 甲纖1640溶液。(3)將上述混合液加入到24孔板中，每孔1 ml，即設(shè)立3副孔。(4)10 d后倒置相差顯微鏡觀察克隆形成情況，大于50個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞群即認(rèn)為是克隆。

實(shí)時(shí)定量PCR細(xì)胞總RNA使用RNA提取試劑盒提取，使用 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)兩組細(xì)胞中DTL mRNA的表達(dá)水平，DTL 正向：5’-ATTGCTACCTGTTCTGATGA- 3’，DTL 反向：5’-CTGGCTACTCGTTACTGTT- 3’；GAPDH 正向 5’-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG- 3’，反向5’-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA- 3’ 。按染料法熒光定量試劑盒反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，并采用2-△△Ct法計(jì)算DTL在mRNA的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

免疫印跡采用Western blot法，CON與DTL-shRNA RPMI8226細(xì)胞放射免疫沉淀法緩沖液細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，加入相應(yīng)體積的蛋白上樣緩沖液，煮沸10～15 min后得到Western blot樣本，按照30 μg的量加入Western blot預(yù)制膠，50 V恒壓待樣本溴酚藍(lán)至積層膠與分離膠分界線時(shí)，切換至120 V恒壓，溴酚藍(lán)至膠板底部時(shí)，400 mA恒流將蛋白樣本轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，加DTL(1∶1000)、P65(1∶1000)、磷酸化-P65(1∶1000)、IκBα(1∶1000)、磷酸化-IκBα(1∶1000)、β-actin(1∶1000)一抗，37 ℃孵育4 h，孵育相應(yīng)二抗(1∶5000)，電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定液顯影，Quantity One 1-D分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)印跡條帶進(jìn)行定量。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白測(cè)定值/ GAPDH，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值。

凝膠遷移實(shí)驗(yàn)

RPMI8226骨髓瘤細(xì)胞核蛋白提?。菏褂蒙虾Ｉど锕こ坦煞萦邢薰竞说鞍滋崛≡噭┖?，操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

凝膠遷移實(shí)驗(yàn)：(1)生物素標(biāo)記探針與核蛋白結(jié)合后，按照8 μg的上樣量加入到凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)膠中，60 V恒壓，待溴酚藍(lán)至膠板底部時(shí)，中止電泳。(2)安裝轉(zhuǎn)膜三明治，將核蛋白轉(zhuǎn)至尼龍膜上，使用紫外燈在距膜5～10 cm處照射10 min進(jìn)行紫外交聯(lián)反應(yīng)。(3)樣本使用封閉液封閉15 min，洗滌液洗3次后，加入電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定發(fā)光液，后續(xù)步驟同Western曝光。

細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)RPMI8226 CON和shRNA細(xì)胞在感染病毒48 h后，選取20 萬(wàn)細(xì)胞，使用PBS洗兩次，并使用凋亡試劑盒中結(jié)合緩沖液洗1次，100 μl結(jié)合緩沖液 重懸后，加入 5 μl 膜聯(lián)蛋白 V 別藻藍(lán)素和5 μl 碘化丙啶染料，冰上標(biāo)記10 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化，凋亡細(xì)胞的比例即為膜聯(lián)蛋白 V陽(yáng)性細(xì)胞的比例。

細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)RPMI8226 CON和shRNA細(xì)胞在感染病毒48 h后，選取100萬(wàn)細(xì)胞，使用PBS洗兩次后，使用300 μl 5%胎牛血清的PBS重懸，并加入700 μl無(wú)水乙醇(最終比例為70%)固定過(guò)夜，PBS洗兩次后，加入終濃度為1 μg/ml的RNA酶，37 ℃水浴30 min，加入終濃度為50 μg/ml的碘化丙啶染料，避光室溫孵育20 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)于重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)，使用重復(fù)測(cè)量方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本研究全部流式數(shù)據(jù)使用FLOWJO 7.6.1軟件進(jìn)行分析[9]。

結(jié) 果

DTL在骨髓瘤患者CD138+細(xì)胞中的表達(dá)選取14例健康志愿者骨髓單個(gè)核細(xì)胞以及34例初發(fā)骨髓瘤患者CD138+細(xì)胞，34例多發(fā)性骨髓瘤患者中，年齡平均(68.43±10.29)歲，其中男28例、女6例，CD138+細(xì)胞比例為(38.21±26.47)%，M蛋白為(36.63±15.85)g/L，14例健康志愿者骨髓單個(gè)核細(xì)胞與34例骨髓瘤患者CD138+細(xì)胞中，DTL的表達(dá)量分別為1.00±0.12 和 9.36±3.71(t=3.65，P=0.0024)，并同時(shí)選取其中12例骨髓瘤樣本，以2例健康志愿者骨髓單個(gè)核細(xì)胞為對(duì)照，Western blot檢測(cè)DTL在骨髓瘤樣本中的蛋白水平的表達(dá)，結(jié)果顯示相對(duì)于健康志愿者骨髓單個(gè)核細(xì)胞，DTL在骨髓瘤患者中的表達(dá)顯著提高。

DTL-shRNA慢病毒感染效率與敲低水平CON與DTL-shRNA組RPMI8226骨髓瘤細(xì)胞系感染病毒48 h后，首先使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光蛋白陽(yáng)性細(xì)胞的比率，結(jié)果顯示兩種病毒對(duì)于骨髓瘤細(xì)胞系的感染效率均為90%(圖1A)，使用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)DTL在RNA水平的改變后顯示，CON組與DTL-shRNA組的DTL相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.01 和 0.21±0.04(t=33.19，P<0.0001)，使用Western blot檢測(cè)DTL在蛋白水平的改變后顯示，CON組與DTL-shRNA組的DTL相對(duì)表達(dá)量分別為0.52±0.13 和 0.11±0.02(t=5.399，P=0.0057)(圖1B)。

CON：對(duì)照組；DTL-shRNA：DTL泛素E3連接酶敲低組；Mr：相對(duì)分子質(zhì)量

CON：control group；DTL-shRNA：denticleless E3 ubiquitin protein ligase-short hairpin RNA group；Mr：relative molecular mass

A.流式細(xì)胞儀檢測(cè)感染效率；B.Western blot檢測(cè)在蛋白水平的敲除效率

A.detection of the infection efficiency by flow cytometry；B.detection of kock-down efficicency at protein level by Western blot

圖1RPMI8226感染10 感染復(fù)數(shù) CON和DTL-shRNA組慢病毒48 h后DTL-shRNA對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系RPMI8226感染及敲除效率

Fig1DTL-shRNA infection and knock-down efficiencies in human multiple myeloma cell line RPMI8226 after RPMI8226 is infected by 10 folds of CON and DTL-shRNA lentivirus for 48 hours

骨髓瘤DTL的下調(diào)抑制細(xì)胞增殖和細(xì)胞克隆形成，并促進(jìn)凋亡與細(xì)胞周期阻滯CON與DTL-shRNA組 0、24、48、72、96 h的細(xì)胞相對(duì)數(shù)量分別為1.00±0.03比 1.00±0.02、2.19±0.28 比 1.47±0.13、3.50±0.14 比 2.24±0.19、5.43±0.41比 3.08±0.14、7.42±0.17 比 4.29±0.13，Mauchly球形檢驗(yàn)P=0.006，因此采用多變量方差分析方法，結(jié)果顯示不同組之間隨時(shí)間變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.58，P=0.001)。將CON與DTL-shRNA細(xì)胞分別培養(yǎng)于半固體培養(yǎng)基中10 d，倒置相差顯微鏡檢測(cè)克隆形成后發(fā)現(xiàn)，CON組細(xì)胞克隆形成能力正常，視野中有大于50個(gè)細(xì)胞的克隆形成(白色箭頭處)，而DTL-shRNA組細(xì)胞的克隆形成能力受到完全抑制，鏡下大于50個(gè)細(xì)胞的克隆不可見(jiàn)，同時(shí)凋亡形態(tài)細(xì)胞顯著增加(白色箭頭處)(圖2A)，而CON與DTL-shRNA克隆形成數(shù)量分別為76±4比0(P<0.01)。同時(shí)檢測(cè)CON與DTL-shRNA 細(xì)胞周期的變化，結(jié)果顯示CON與DTL-shRNA組G1期細(xì)胞比例為(28.61±8.64)%比(57.25±10.37)%(t=3.675，P=0.0213)(圖2B)，在細(xì)胞凋亡中，CON與DTL-shRNA組膜聯(lián)蛋白 V+細(xì)胞比例為(3.21±0.89)%比(34.71±18.68)%(t=2.895，P=0.0443)(圖2C)。

DTL-shRNA對(duì)增殖、克隆形成的抑制與NF-κB通路的下調(diào)RPMI8226感染10感染復(fù)數(shù) CON與DTL-shRNA慢病毒48 h后，使用Western blot檢測(cè)NF-κB通路P65亞基磷酸化的水平后顯示，CON與DTL-shRNA組磷酸化-P65相對(duì)表達(dá)量分別為1.52±0.14 和 0.82±0.11(t=6.81，P=0.0024)，而P65的表達(dá)分別為0.25±0.04和0.24±0.08(t=0.19，P=0.85)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CON與DTL-shRNA組磷酸化-IκBα的相對(duì)表達(dá)量分別為0.19±0.03 和 0.13±0.02(t=2.882，P=0.0449)，而IκBα的相對(duì)表達(dá)量分別為0.22±0.05和1.01±0.06(t=17.52，P<0.0001)(圖3A)。以有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白- 1探針為對(duì)照，進(jìn)一步使用EMSA檢測(cè)DTL-shRNA NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的變化，結(jié)果表明DTL-shRNA組NF-κB轉(zhuǎn)錄活性顯著下調(diào)(圖3B)。

A.半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d倒置相差顯微鏡觀察克隆形成(白色箭頭處：典型克隆或凋亡細(xì)胞)(×100)；B.碘化丙啶染色法檢測(cè)細(xì)胞周期的變化；C.膜聯(lián)蛋白 V/碘化丙啶雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化

A.culture in semisolid medium for 10 days and detection of the change of colone formation using inverted phase contrast microscope(white arrow：classic colone or apoptosis cells)；B.detection of the change of cell cycle by propidium iodide staining；C.detection of the change of cell apoptosis by annexin V/propidium iodide double staining

圖2RPMI8226感染10 感染復(fù)數(shù) CON和DTL-shRNA慢病毒48 h后，DTL-shRNA抑制RPMI8226增殖、克隆形成，促進(jìn)凋亡與細(xì)胞周期阻滯

Fig2DTL-shRNA inhibits RPMI8226 proliferation and colone formation and induces apoptosis and cell cycle arrest after RPMI8226 is infected by CON and DTL-shRNA lentivirus for 48 hours

NF-κB：核因子-κB；P-P65：磷酸化P65;IκBα：抑制因子κBα；P-IκBα：磷酸化IκBα；EMSA：凝膠遷移實(shí)驗(yàn)；OCT- 1：有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白- 1

NF-κB：nuclear factor-κB；P-P65：phosphorylation P65；IκBα：inhibitory subunit-κBα；P-IκBα：phosphorylation IκBα；EMSA：electrophoretic mobility shift assay；OCT- 1：organic cation transporter- 1

A.使用Western blot檢測(cè)NF-κB通路P65、IκBα磷酸化水平變化；B.EMSA檢測(cè)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的變化

A.detection of P65 and IκBα phosphorylation change in NF-κB pathway by Western blot；B.detection of the change of NF-κB transcriptional ability by EMSA

圖3RPMI8226感染10感染復(fù)數(shù) CON和DTL-shRNA慢病毒48 h后，DTL-shRNA引起細(xì)胞增殖改變與NF-κB通路改變相關(guān)

Fig3Effect of DTL-shRNA on cell prolieration is related with NF-κB pathway alteration after RPMI8226 is infected by CON and DTL-shRNA lentivirus for 48 hours

討 論

盡管以硼替佐米為代表的MM靶向治療具有很好的效果，隨著耐藥的逐漸增多，開(kāi)發(fā)新的靶向治療藥物成為研究的熱點(diǎn)，越來(lái)越多的研究表明泛素化通路與MM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中usp7特異性抑制劑已在臨床應(yīng)用，同時(shí)泛素E3連接酶Pirh2也被證實(shí)與MM的硼替佐米耐藥相關(guān)。DTL做為一種泛素E3連接酶，其作用主要為將泛素分子與靶蛋白連接，繼而介導(dǎo)靶蛋白的降解、定位等生物學(xué)進(jìn)程，DTL同時(shí)也是反式維甲酸介導(dǎo)的人畸胎瘤細(xì)胞系nt2分化中重要的下游基因[10]，同時(shí)DTL也是一種備受關(guān)注的癌基因，在胃癌中，DTL的表達(dá)與淋巴結(jié)侵襲、腫瘤復(fù)發(fā)及患者生存率相關(guān)且與p53的突變無(wú)相關(guān)性[11]，在結(jié)腸癌中DTL高表達(dá)且作為MiR- 30a- 5p的靶點(diǎn)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖[12]。而DTL在MM中的表達(dá)以及與增殖、克隆形成能力的關(guān)聯(lián)則報(bào)道較少。

本研究首先選取34例MM患者與14例健康志愿者骨髓，在分離出單個(gè)核細(xì)胞后，由于MM中CD138+細(xì)胞表達(dá)異常升高，因此使用磁珠分選試劑盒分選出CD138+細(xì)胞，使用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)DTL的表達(dá)后顯示，DTL在骨髓瘤患者CD138+細(xì)胞中高表達(dá)，在確定了DTL mRNA水平的高表達(dá)后，由于Western blot所需細(xì)胞數(shù)量較多(需100萬(wàn)細(xì)胞)，部分骨髓瘤患者CD138+細(xì)胞比例較低，且每例患者僅獲得5 ml骨髓，獲得細(xì)胞較少，因此選取其中12例CD138+細(xì)胞比例較高患者，同時(shí)受Western膠上樣數(shù)量的限制，選取2例健康志愿者骨髓單個(gè)核細(xì)胞為對(duì)照，2例對(duì)照樣本DTL mRNA表達(dá)量位于中間水平，結(jié)果表明相對(duì)于健康志愿者血液?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞，DTL在蛋白水平同樣高表達(dá)，初步證實(shí)DTL可能為MM中的癌基因。因此進(jìn)一步使用RPMI8226細(xì)胞系分別感染CON與DTL-shRNA病毒，并使用CCK8方法檢測(cè)骨髓瘤細(xì)胞增殖變化，結(jié)果表明DTL的下調(diào)能夠顯著抑制細(xì)胞增殖，在48、72 h差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，細(xì)胞克隆形成能力能夠很好地反映細(xì)胞增殖、侵襲和對(duì)殺傷因素敏感性，結(jié)果表明DTL-shRNA使骨髓瘤細(xì)胞系克隆形成能力完全受限，鏡下DTL-shRNA組克隆不可見(jiàn)，DTL的敲低同時(shí)能夠促進(jìn)RPMI8226的凋亡，并使得細(xì)胞周期中G1期細(xì)胞比例顯著降低，證實(shí)了DTL的過(guò)表達(dá)對(duì)于骨髓瘤細(xì)胞系生物學(xué)功能的維持至關(guān)重要。NF-κB是骨髓瘤發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用的通路，NF-κB因子包括P65、P50等5種亞基，通常情況下兩種亞基形成的二聚體與抑制因子IκBα結(jié)合而以無(wú)活性的狀態(tài)存在[13]，各種胞外信號(hào)如腫瘤壞死因子α[14]、白介素- 2[15]等作用于膜受體后，激活磷酸化κB抑制蛋白激酶的作用，磷酸化κB抑制蛋白激酶使得IκBα與NF-κB亞基磷酸化，IκBα隨機(jī)與泛素分子結(jié)合并降解，NF-κB亞基則磷酸化激活并入核，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄下游分子[16]。使用蛋白印跡與EMSA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)骨髓瘤細(xì)胞中NF-κB通路的變化，結(jié)果表明DTL敲低后，NF-κB通路P65亞基磷酸化受到抑制，抑制因子IκBα磷酸化同時(shí)降低，且IκBα表達(dá)升高，IκBα磷酸化以及隨后的泛素化直接導(dǎo)致IκBα的降解[17]，因此，DTL-shRNA使得IκBα降解受到了抑制，EMSA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的變化后發(fā)現(xiàn)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性顯著降低，DTL對(duì)NF-κB通路影響的機(jī)制可能如下：(1)DTL的功能主要為介導(dǎo)泛素分子與靶蛋白的結(jié)合，已有研究證實(shí)，與DTL具有相似功能的鼠雙微基因2蛋白能夠通過(guò)與慢性粒細(xì)胞中的P65基因的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化蛋白1結(jié)合，從而誘導(dǎo)P65亞基的表達(dá)[18]，DTL可能通過(guò)相似的機(jī)制影響NF-κB通路。(2)本研究同時(shí)觀察到DTL的敲除能夠誘導(dǎo)IκBα亞基的磷酸化，同時(shí)促進(jìn)IκBα的降解，IκBα降解的增加通常與泛素化水平的升高密切相關(guān)[19]，DTL敲除能夠使腫瘤細(xì)胞泛素通路受損，IκBα降解降低，進(jìn)而使NF-κB通路受到抑制。因此，DTL敲低對(duì)于骨髓瘤細(xì)胞增殖、克隆形成能力的影響與NF-κB通路的抑制有關(guān)。

綜上，本研究結(jié)果顯示DTL在MM中的表達(dá)，并論證了DTL對(duì)骨髓瘤細(xì)胞增殖、克隆形成能力的影響及相關(guān)機(jī)制，為后續(xù)開(kāi)發(fā)DTL特異性抑制劑提供了依據(jù)，缺點(diǎn)在于本研究納入骨髓瘤標(biāo)本數(shù)量較少(mRNA 34例、蛋白水平12例)，對(duì)于DTL在骨髓瘤患者中的表達(dá)水平論證不充分，因此，在今后的研究中，需進(jìn)一步納入新的骨髓瘤患者病例，并嘗試在癌癥和腫瘤基因圖譜、基因表達(dá)匯編公共數(shù)據(jù)庫(kù)中得到驗(yàn)證。