楊永華，王 偉，胡 斌，楊海龍，王溪淳

1九江市第一人民醫(yī)院骨科，江西九江 3320002湘雅醫(yī)學(xué)院附屬第二人民醫(yī)院骨科，長(zhǎng)沙 410008

骨骼肌缺血再灌注損傷是肢體手術(shù)治療過(guò)程中十分常見(jiàn)的病理變化[1- 3]。在下肢斷肢再植手術(shù)、下肢動(dòng)脈栓塞手術(shù)、主動(dòng)脈瘤手術(shù)以及動(dòng)脈粥樣硬化手術(shù)等眾多下肢外科操作中不可避免地導(dǎo)致了肢體的缺血再灌注損傷。盡管肢體缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制尚未完全弄清，但研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注過(guò)程所誘發(fā)白介素和腫瘤壞死因子等多種炎癥因子的急劇釋放而形成局部炎性的“瀑布效應(yīng)”、骨骼肌細(xì)胞線粒體能量代謝障礙以及隨后發(fā)生的細(xì)胞壞死及凋亡均有著密切關(guān)聯(lián)[4- 5]。已有研究顯示硫化氫能夠特異性地清除體內(nèi)亞硝酸根和羥自由基發(fā)揮其拮抗氧化應(yīng)激作用，且硫化氫可顯著減輕心肌、腦組織以及腸等器官的缺血再灌注損傷[6- 7]?，F(xiàn)階段研究顯示，外源性H2S補(bǔ)充可以通過(guò)降低炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及炎性細(xì)胞因子激活、直接清除氧自由基、增加內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)的活力、降低醛固酮水平而對(duì)骨骼肌缺血再灌注后心肌損傷發(fā)揮保護(hù)作用。本研究的創(chuàng)新之處在于提取骨骼肌細(xì)胞線粒體進(jìn)行線粒體跨膜電位測(cè)定及ATP含量檢測(cè)，以探討硫化氫對(duì)大鼠肢體缺血再灌注導(dǎo)致的骨骼肌損傷的保護(hù)作用機(jī)制。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用購(gòu)于湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的健康、成年雄性Wistar大鼠60只，均為雌性(批號(hào)：2018- 0256)，鼠齡相同，體重220～260 g，符合國(guó)家二級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)，常規(guī)條件下進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。

主要器材和試劑動(dòng)物手術(shù)器械包購(gòu)自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；上海精科原子吸收分光光度計(jì)361CRT；自動(dòng)生化分析儀ADVIA 2400購(gòu)自上海；SuPerMax- 3100Plus型多功能酶標(biāo)儀系統(tǒng)購(gòu)自上海閃譜生物科技有限公司；美國(guó)伯樂(lè)Basic基礎(chǔ)電泳儀購(gòu)自北京嘉鵬同創(chuàng)科技發(fā)展有限公司；Hettich離心機(jī)購(gòu)自北京速達(dá)設(shè)備維修有限公司；電熱恒溫箱購(gòu)自上海智城分析儀器制造有限公司；美國(guó)Scientific Industries振蕩器購(gòu)自?shī)W然科技有限公司；奧林巴斯BX53熒光顯微鏡購(gòu)自上海創(chuàng)萌生物科技有限公司。硫氫化鈉(NaHS)水合 Sigma購(gòu)自上海聯(lián)碩生物科技有限公司；水合氯醛溶液(10% w/v)購(gòu)自上海羽朵生物科技有限公司；青霉素G鈉鹽購(gòu)自北京蘭博利德商貿(mào)有限公司；云南白藥粉購(gòu)自云南白藥集團(tuán)股份有限公司；3%雙氧水購(gòu)自上海生物工程有限公司；10%中性福爾馬林液購(gòu)自上海羽朵生物科技有限公司。

下肢缺血再灌注損傷動(dòng)物模型制作實(shí)驗(yàn)Wistar大鼠自由飲水及攝食，環(huán)境溫度(25.0±2.0)℃，濕度(60±5)%，12 h光照周期。在手術(shù)操作前均禁食12 h，不限飲水。5%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，肌注阿托品0.04 mg，待大鼠翻正反射及角膜反射消失，將大鼠右后肢毛發(fā)剪除，將大鼠仰臥位固定于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手術(shù)臺(tái)，2%碘伏消毒右后肢局部皮膚，鋪無(wú)菌巾單后，切開(kāi)右后肢處皮膚，顯露右側(cè)股動(dòng)脈，采取Bulldog無(wú)創(chuàng)血管阻斷技術(shù)游離右側(cè)股動(dòng)脈并用血管夾鉗夾，將股動(dòng)脈游離一段約1 cm，在股動(dòng)脈的遠(yuǎn)端監(jiān)測(cè)血壓，當(dāng)血液計(jì)讀數(shù)為零時(shí)表明大鼠肢體缺血模型制作成功，連續(xù)保持缺血4 h后，打開(kāi)動(dòng)脈夾，恢復(fù)右側(cè)股動(dòng)脈血流，監(jiān)測(cè)到血壓上升，標(biāo)志右后肢再灌注成功，術(shù)畢，縫合右后肢皮膚。待后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)分組選擇60只Wistar大鼠。A組為假手術(shù)組(Sham組)20只，B組為對(duì)照組(缺血-再灌注損傷+生理鹽水組)20只、C組為實(shí)驗(yàn)組(缺血-再灌注損傷+H2S 組)20只。A組大鼠麻醉完成后僅行手術(shù)暴露并游離右側(cè)股動(dòng)脈，不進(jìn)行動(dòng)脈夾閉處理，暴露4 h后經(jīng)鼠尾靜脈緩慢注射1 ml生理鹽水；B組大鼠麻醉完成后切開(kāi)暴露游離右側(cè)股動(dòng)脈，鉗夾4 h后打開(kāi)行后肢缺血再灌注處理，同時(shí)經(jīng)鼠尾靜脈注射1 ml生理鹽水；C組大鼠麻醉完成后切開(kāi)暴露游離右側(cè)股動(dòng)脈，鉗夾4 h后打開(kāi)行后肢缺血再灌注處理，同時(shí)經(jīng)鼠尾靜脈注射含5 μmol/L NaHS的溶液1 ml。3組Wistar大鼠均于再灌注成功后0、3、6、9、12、15 h經(jīng)左下肢靜脈分別采血；于再灌注成功15 h后切開(kāi)頸動(dòng)脈放血處死大鼠，并切取Wistar大鼠右后肢的肌肉組織，將骨骼肌組織用冷生理鹽水反復(fù)沖洗去除殘留血液，用于分析測(cè)定與線粒體的提取。此外，同時(shí)取大鼠肝臟、肺臟和腎臟組織，其處理方法與骨骼肌同。

肢體骨骼肌、肝臟、肺臟和腎臟組織內(nèi)壞死分解產(chǎn)物測(cè)定應(yīng)用自動(dòng)化分析儀測(cè)定大鼠肢體骨骼肌、肝臟、肺臟和腎臟組織內(nèi)肌紅蛋白(myoglobin，MB)、脂蛋白復(fù)合物(lipoprotein complex，LPC)以及脂質(zhì)過(guò)氧化物(lipid peroxide，LPO)的含量。

血清中炎癥因子含量的測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定各組大鼠于缺血再灌注后0、3、6、9、12、15 h各時(shí)間點(diǎn)血清中白介素(interleukin，IL)- 1、IL- 6及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎性因子的含量。

骨骼肌細(xì)胞內(nèi)線粒體能量代謝測(cè)定部分大鼠肢體骨骼肌組織標(biāo)本經(jīng)0.9%冷生理鹽水洗凈后用于制備骨骼肌細(xì)胞懸液，再應(yīng)用熒光探針技術(shù)，提供通過(guò)JC- 1熒光染色對(duì)骨骼肌細(xì)胞的線粒體進(jìn)行熒光染色標(biāo)記，然后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)比較熒光染色為紅色的線粒體與熒光染色為綠色的線粒體兩者之間的熒光強(qiáng)度，反映大鼠肢體骨骼肌細(xì)胞內(nèi)線粒體的跨膜電位情況。并利用ATP 檢測(cè)試劑盒繪制肌肉組織細(xì)胞線粒體ATP 含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線粒體ATP的含量。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件(美國(guó)IBM公司)進(jìn)行處理；計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析或者重復(fù)測(cè)量的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用百分率(%)表示，組間比較采用χ2分析；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

硫化氫對(duì)缺血再灌注所致骨骼肌破壞程度對(duì)照組大鼠在缺血再灌注損傷后肢體骨骼肌、肝臟、肺臟及腎臟組織內(nèi)MB、LPO和LPC的含量均明顯增高(MB：P骨骼肌=0.003，P肝臟=0.001，P肺臟=0.001，P腎臟=0.001；LPO：P骨骼肌=0.001，P肝臟=0.001，P肺臟=0.001，P腎臟=0.002；LPC：P骨骼肌=0.000，P肝臟=0.002，P肺臟=0.002，P腎臟=0.003)，而缺血再灌注時(shí)采用硫化氫處理可明顯抑制MB、LPO及LPC的生成(MB：P骨骼肌=0.021，P肝臟=0.036，P肺臟=0.005；LPO：P骨骼肌=0.003，P肝臟=0.008，P肺臟=0.010，P腎臟=0.015；LPC：P骨骼肌=0.002，P肝臟=0.026，P肺臟=0.007，P腎臟=0.006)(表1～3)。

硫化氫對(duì)缺血再灌注大鼠血清炎性反應(yīng)的影響大鼠下肢缺血再灌注可導(dǎo)致大鼠血清中IL- 1、IL- 6及TNF-α的含量均升高，并且隨著時(shí)間推移，IL- 1、IL- 6及TNF-α含量升高呈遞增趨勢(shì)，且自3 h時(shí)各組間IL- 1、IL- 6及TNF-α含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(IL- 1：P3 h=0.019，P6 h=0.011，P9 h=0.009，P12 h=0.008，P15 h=0.002；IL- 6：P3 h=0.026，P6 h=0.009，P9 h=0.002，P12 h=0.002，P15 h=0.003；TNF-α：P3 h=0.002，P6 h=0.002，P9 h=0.005，P12 h=0.002，P15 h=0.003)。而缺血再灌注時(shí)采用硫化氫處理可明顯抑制血清中 IL- 1、IL- 6及TNF-α的含量水平(IL-1：P3 h=0.035，P6 h=0.039，P9 h=0.012，P12h=0.005，P15 h=0.006；IL- 6：P3 h=0.042，P6 h=0.025，P9 h=0.023，P12h=0.006，P15 h=0.005；TNF-α：P3 h=0.005，P6 h=0.003，P9 h=0.022，P12h=0.005，P15 h=0.005)，隨著時(shí)間推移，其抑制效果越明顯(表4～6)。

表1 硫化氫對(duì)大鼠骨骼肌、肝臟、肺臟及腎臟中肌紅蛋白水平的影響(n=20，-±s，nmol/mg)Table 1 Effects of hydrogen sulfide on myoglobin level in skeletal muscle，liver，lung，and kidney of rats(n=20，-±s，nmol/mg)

P1：假手術(shù)組與對(duì)照組比較；P2：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較

P1：sham operation groupvs. control group；P2：experience groupvs. control group

表2 硫化氫對(duì)大鼠骨骼肌、肝臟、肺臟及腎臟中脂質(zhì)過(guò)氧化物水平的影響(n=20，-±s，nmol/mg)Table 2 Effect of hydrogen sulfide on lipid peroxide level in skeletal muscle，liver，lung and kidney of rats(n=20，-±s，nmol/mg)

P1：假手術(shù)組與對(duì)照組比較；P2：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較

P1：sham operation groupvs. control group；P2：experience groupvs. control group

硫化氫對(duì)缺血再灌注骨骼肌細(xì)胞內(nèi)線粒體跨膜電位的影響對(duì)照組大鼠肢體缺血再灌注后，骨骼肌細(xì)胞線粒體跨膜電位比假手術(shù)組大幅度下降(t=6.698，P=0.001)，而實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過(guò)硫化氫處理后線粒體膜勢(shì)能高于對(duì)照組(t=7.507，P=0.000)。

表3 硫化氫對(duì)大鼠骨骼肌、肝臟、肺臟及腎臟中脂蛋白復(fù)合物水平的影響(n=20，-±s，nmol/mg)Table 3 Effect of hydrogen sulfide on the level of lipoprotein complex in skeletal muscle，liver，lung and kidney of rats(n=20，-±s，nmol/mg)

P1：假手術(shù)組與對(duì)照組比較；P2：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較

P1：sham operation groupvs. control group；P2：experience groupvs. control group

表4 硫化氫對(duì)大鼠血清中IL- 1含量的影響(n=20，-±s，μg/L)Table 4 Effect of hydrogen sulfide on IL- 1 level in rat serum(n=20，-±s，μg/L)

IL：白介素；P1：假手術(shù)組與對(duì)照組比較；P2：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較

IL：interleukin；P1：sham operation groupvs. control group；P2：experience groupvs. control group

表5 硫化氫對(duì)大鼠血清中 IL- 6含量的影響(n=20，-±s，μg/L)Table 5 Effect of hydrogen sulfide on IL- 6 level in rat serum(n=20，-±s，μg/L)

P1：假手術(shù)組與對(duì)照組比較；P2：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較

P1：sham operation groupvs. control group；P2：experience groupvs. control group

表6 硫化氫對(duì)大鼠血清中腫瘤壞死因子-α含量的影響(n=20，-±s，μg/L)Table 6 Effect of hydrogen sulfide on the content of tumor necrosis factor-α in serum of rats(n=20，-±s，μg/L)

P1：假手術(shù)組與對(duì)照組比較；P2：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較

P1：sham operation groupvs. control group；P2：experience groupvs. control group

硫化氫對(duì)缺血再灌注骨骼肌細(xì)胞內(nèi)線粒體ATP的影響對(duì)照組大鼠缺血再灌注骨骼肌細(xì)胞內(nèi)線粒體的ATP含量比假手術(shù)組下降(t=7.526，P=0.000)；而實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過(guò)硫化氫處理后線粒體ATP含量高于對(duì)照組(t=8.604，P=0.000)。

討 論

肢體缺血再灌注是外科手術(shù)時(shí)常遇到的病理過(guò)程，多見(jiàn)于周圍血管外科手術(shù)耗時(shí)較長(zhǎng)且術(shù)中阻斷血流止血后再恢復(fù)血供后發(fā)生[8- 10]。由于下肢缺血再灌注損傷過(guò)程通常會(huì)導(dǎo)致骨骼肌組織發(fā)生變性壞死或凋亡，目前研究顯示，骨骼肌缺血再灌注損傷后，能夠?qū)е逻h(yuǎn)隔臟器(如心、肺、腸等)的損傷，而臨床上目前仍然缺乏有效的治療骨骼肌缺血再灌注損傷的手段[11- 13]。

近年，多項(xiàng)研究揭示了硫化氫在多個(gè)器官缺血再灌注損傷中能夠發(fā)揮保護(hù)作用，硫化氫可有效緩解因缺血再灌注損傷所導(dǎo)致的肝臟、腎臟、肺臟、大腦、心臟等器官的損傷[14- 16]。硫化氫的拮抗氧化應(yīng)激的作用日益為人們所重視。本研究通過(guò)建立Wistar大鼠肢體缺血再灌注動(dòng)物模型，探討硫化氫對(duì)大鼠肢體缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。當(dāng)骨骼肌組織發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)，由于骨骼肌細(xì)胞壞死或凋亡而導(dǎo)致組織壞死分解產(chǎn)物MB、LPC和LPO的大量生成[17]，同時(shí)通過(guò)對(duì)大鼠肝臟、肺和腎臟等器官中MB、LPC和LPO含量進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)大鼠肢體缺血再灌注損傷時(shí)，肝臟、肺和腎臟組織中MB、LPC和LPO的水平均呈顯著的上升，而實(shí)驗(yàn)組由于采用硫化氫處理后可顯著抑制組織壞死分解代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)硫化氫能減輕因肢體缺血再灌注導(dǎo)致的骨骼肌及其他遠(yuǎn)隔器官的損傷。

肢體缺血再灌注損傷通常會(huì)伴隨有損傷局部的炎癥反應(yīng)。IL- 1、IL- 6和TNF-α 是重要的細(xì)胞炎癥因子，這些因子的表達(dá)水平能夠反映炎癥反應(yīng)的劇烈程度，也可反映肢體缺血再灌注時(shí)的組織損傷程度[18]。因此，本研究測(cè)定大鼠血清中 IL- 1、IL- 6及TNF-α含量的變化，結(jié)果顯示肢體缺血再灌注損傷能夠?qū)е麓笫笱逯蠭L- 1、IL- 6及TNF-α的含量升高，且隨著時(shí)間推移，IL- 1、IL- 6及TNF-α等炎癥因子的含量進(jìn)一步增加，且自3 h起對(duì)照組的含量與假手術(shù)組相比升高更為顯著，提示肢體缺血再灌注直接導(dǎo)致骨骼肌及遠(yuǎn)隔器官出現(xiàn)明顯的炎性反應(yīng)。而實(shí)驗(yàn)組大鼠在經(jīng)過(guò)硫化氫處理后其血清中炎癥因子的含量較對(duì)照組顯著降低，隨著時(shí)間推移，這種對(duì)于炎癥因子表達(dá)的抑制效果愈加顯著，分別于9～12 h后抑制作用達(dá)到高峰。此結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了硫化氫處理可有效抑制肢體缺血再灌注損傷過(guò)程中的炎性反應(yīng)，從而減輕其對(duì)骨骼肌與遠(yuǎn)隔器官的損傷程度。

線粒體作為生物體內(nèi)首要的氧化反應(yīng)場(chǎng)所，機(jī)體的能量代謝和氧化過(guò)程均在線粒體中完成，機(jī)體內(nèi)的氧在線粒體內(nèi)膜被電子傳遞系統(tǒng)復(fù)合物轉(zhuǎn)變成活性氧自由基，當(dāng)線粒體中自由基蓄積過(guò)多時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致線粒體跨膜電位的改變，使線粒體滲透壓失衡，損傷線粒體的內(nèi)膜，造成線粒體腫脹及功能異常，從而造成ATP合成減少，細(xì)胞出現(xiàn)能量代謝障礙，最終引發(fā)細(xì)胞的凋亡[15，19]。本研究探討硫化氫對(duì)肢體缺血再灌注時(shí)骨骼肌細(xì)胞內(nèi)線粒體的跨膜電位與ATP含量的影響。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠肢體缺血再灌注損傷后，線粒體跨膜電位降低幅度明顯大于假手術(shù)組，而實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過(guò)硫化氫處理后骨骼肌細(xì)胞線粒體跨膜電位顯著高于對(duì)照組。這進(jìn)一步表明硫化氫處理可以在肢體發(fā)生缺血再灌注過(guò)程中維護(hù)線粒體跨膜電位的穩(wěn)定，有助于保持線粒體滲透壓的平衡，使其免于發(fā)生不可逆的損傷。通過(guò)對(duì)各組大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體中ATP的含量進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組線粒體內(nèi)ATP的含量明顯低于假手術(shù)組；而實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過(guò)硫化氫處理后大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體內(nèi)ATP的含量明顯高于對(duì)照組。表明硫化氫可有效減輕肢體缺血再灌注所致的線粒體損傷，抑制ATP的消耗，保護(hù)線粒體的能量代謝功能。

本研究的臨床實(shí)用性及其對(duì)臨床的指導(dǎo)意義是證實(shí)在大鼠骨骼肌缺血再灌注時(shí)，外源性補(bǔ)充H2S可以通過(guò)減輕再灌注損傷時(shí)線粒體跨膜電位和能量代謝障礙而對(duì)骨骼肌缺血再灌注的骨骼肌損傷發(fā)揮保護(hù)作用，為臨床上骨骼肌缺血再灌注損傷的防治提供了一條新的途徑。

綜上，硫化氫在肢體缺血再灌注后，可以減輕骨骼肌及遠(yuǎn)隔器官的損傷，減輕局部炎性反應(yīng)程度，同時(shí)還對(duì)減輕再灌注損傷時(shí)線粒體跨膜電位和能量代謝障礙具有重要意義。為硫化氫應(yīng)用在治療肢體缺血再灌注所致的骨骼肌及遠(yuǎn)隔臟器損傷提供理論上的支持。