宋鹍鵬，舒 鵬，馬炬雷，王 兵，陳 博

寧波市北侖區(qū)人民醫(yī)院 浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院北侖分院 1手足外科 2分子實(shí)驗(yàn)室，浙江寧波 315800

多發(fā)性骨髓瘤主要癥狀與特征包括骨痛、貧血、高鈣血癥、腎功能受損以及反復(fù)感染等[1]，多發(fā)性骨髓瘤的預(yù)后整體較差且復(fù)發(fā)率較高[2]，因此改善多發(fā)性骨髓瘤的治療方式成為研究熱點(diǎn)。目前多發(fā)性骨髓瘤的靶向藥物包括蛋白酶體抑制劑[3]、免疫調(diào)節(jié)藥物[4]，靶向治療藥物能夠更好地提高患者總體生存率[5]。但與此同時(shí)，靶向藥物的耐藥層出不窮[6]，而開發(fā)新的靶點(diǎn)，從而克服耐藥成為必需。核糖體蛋白S9(ribosomal protein S9，RPS9)是一種B23相互作用蛋白，其缺失被認(rèn)為能夠激活p53，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、分化[7]，而RPS9與多發(fā)性骨髓瘤之間的關(guān)系報(bào)道較少。本研究主要明確RPS9在骨髓瘤中的表達(dá)及其對(duì)骨髓瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。

材料和方法

材料CD138磁珠分選試劑盒EasySepTMHuman CD138 Positive Selection Kit Ⅱ購自美國STEMCELL 公司(貨號(hào)：17877)，人外周血淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)笥邢薰荆琓rizol購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser(貨號(hào)：RR047A)與QPCR試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(貨號(hào)：RR820L)均購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，RPS9抗體購自美國Abcam公司(貨號(hào)：ab157125)，類泛素蛋白修飾分子特異蛋白酶1(sentrin-specific protease 1，SENP1)(貨號(hào)：11929)、P65(貨號(hào)：8242)、磷酸化-P65(phosphorylation-P65，P-P65)(貨號(hào)：3033)、抑制因子κBα(inhibitory subunit-κBα，IκBα)(貨號(hào)：5209)、磷酸化-IκBa(phosphorylation-IκBa，P-IκBa)(貨號(hào)：2859)、GAPDH(貨號(hào)：5174)一抗以及相應(yīng)二抗均購自美國Cell Signaling Technology公司，細(xì)胞周期染色中高濃度碘化丙啶(propidium iodide，PI)購自美國Sigma公司(貨號(hào)：P4170)，膜聯(lián)蛋白 V別藻青蛋白(allophycocyanin，APC)/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購自天津三箭生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)：AO2001- 11P-G)，CCK8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所(貨號(hào)：CK04)，高靈敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購自美國Thermo Fisher公司(貨號(hào)：NCI5080)，實(shí)驗(yàn)中引物由華大基因合成，對(duì)照(control，CON)與RPS9-短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)購自美國Sigma公司，SENP1過表達(dá)載體購自北京義翹神州技術(shù)有限公司(貨號(hào)：HG19083-UT)，慢病毒聚乙二醇沉降試劑購自美國System Biosciences公司(貨號(hào)：LV825A- 1)。

細(xì)胞培養(yǎng)與分組健康志愿者與初治多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓來自寧波市北侖區(qū)人民醫(yī)院，人骨髓瘤細(xì)胞系RPMI8226來自北京協(xié)和細(xì)胞庫，RPMI8226培養(yǎng)于1640(美國Gibico，貨號(hào)：11875127)+10%胎牛血清(美國Gibico，貨號(hào)：11573397)完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2，在RPS9敲低實(shí)驗(yàn)中，RPMI8226分別感染CON與RPS9-shRNA慢病毒，感染復(fù)數(shù)為10(病毒數(shù)目∶細(xì)胞數(shù)目=10∶1)。

CD138+細(xì)胞分離純化健康志愿者與多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓首先分離單個(gè)核細(xì)胞，將骨髓樣本加入到淋巴細(xì)胞分離液中，1500 r/min 離心20 min，轉(zhuǎn)子半徑為116 mm，吸取單個(gè)核細(xì)胞層，多發(fā)性骨髓瘤單個(gè)核細(xì)胞隨后使用CD138磁珠分選試劑盒進(jìn)行分選，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，分離得到的CD138+細(xì)胞隨后凍存或進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

慢病毒包裝與純化包裝病毒為CON與RPS9-shRNA病毒，包裝體系為三代慢病毒包裝，即PMD2.G(addgene 12259)∶psPAX2(addgene 12260)∶目的載體=1∶3∶4，使用脂質(zhì)體 2000(賽默飛公司，貨號(hào)：12566014)轉(zhuǎn)染至293t細(xì)胞，轉(zhuǎn)染步驟按照試劑說明書進(jìn)行，并收集36、48以及72 h病毒上清，病毒上清隨后使用聚乙二醇沉淀法進(jìn)行純化，操作步驟按照試劑說明書進(jìn)行。

細(xì)胞凋亡檢測(cè)細(xì)胞凋亡檢測(cè)使用膜聯(lián)蛋白 V APC/PI雙染法檢測(cè)，RPMI8226在感染CON與RPS9-shRNA 48 h后，使用100 μl 結(jié)合緩沖液重懸，并加入5 μl膜聯(lián)蛋白 V APC抗體和5 μl PI染料，冰上孵育10 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化，細(xì)胞最終凋亡的比例使用膜聯(lián)蛋白 V APC陽性細(xì)胞比例判定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

細(xì)胞周期檢測(cè)細(xì)胞周期檢測(cè)使用高濃度PI染色法，RPMI8226 在感染CON與RPS9-shRNA 慢病毒48 h后，各取100萬個(gè)細(xì)胞，最終使用300 μl 含有5%胎牛血清 的磷酸鹽緩沖液重懸，隨后加入700 μl 純酒精，并固定至少過夜。加入RNA酶使得終濃度為1 μg/ml，37 ℃ 30 min后，加入PI染料，使得終濃度為50 μg/ml，避光孵育20 min后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。

免疫印跡蛋白檢測(cè)使用Western blot法，細(xì)胞在使用RIPA裂解液冰上裂解30 min后，加入等體積的2×上樣緩沖液，沸水浴15 min后，加入到Western 預(yù)制膠中，50 V恒壓電泳，待溴酚藍(lán)在分離膠與積層膠之間被壓平后，140 V恒壓直到溴酚藍(lán)至分離膠底部。隨后400 mA恒流1 h濕法轉(zhuǎn)膜，使用Tris 鹽緩沖液-Tween洗膜3次，使用5%牛血清白蛋白封閉2 h，并4 ℃過夜標(biāo)記相應(yīng)的一抗，室溫30 min標(biāo)記相應(yīng)的二抗，最后使用高靈敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒發(fā)光液顯色，膠片曝光，最終蛋白的表達(dá)量使用Image J軟件進(jìn)行定量。

實(shí)時(shí)熒光定量PCRmRNA表達(dá)量的變化使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，RPMI8226 CON 與RPS9-shRNA細(xì)胞總RNA首先使用Trizol法提取后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，使用SYBR染料法檢測(cè)目的基因的表達(dá)，其中內(nèi)參GAPDH 引物序列為：GAPDH正向 5’-TATGCTCTCCTCATGCATTG- 3’，GAPDH反向 5’-GGGACGACCTTCGATCTACC- 3’，RPS9正向 5’-GTCTCGACCAAGAGCTGAAGCT- 3’，RPS9反向5’-GGTCCTTCTCATCAAGCGTCAG- 3’，SENP1 正向5’-CATTTCGCCTGACCATTACACGC- 3’ SENP1 反向5’-CACACTTGGCAAGCCCTTCTCT- 3′，反應(yīng)體系與條件參照試劑盒說明書進(jìn)行，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，使用2-△△Ct法定量，RPS9 Ct值-GAPDH Ct值后計(jì)算出RPS9相對(duì)于GAPDH的表達(dá)量，即-△Ct值，并使用RPS9-shRNA 組Ct值-RPS9-CON組Ct值，得到-△△Ct值后，計(jì)算2-△△Ct值得到相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞增殖檢測(cè)細(xì)胞增殖檢測(cè)使用CCK8法進(jìn)行，RPMI8226 在感染CON與RPS9-shRNA 48 h后，鋪于96孔板中，并設(shè)立0、24、48、72、96 h時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均設(shè)立4副孔，每孔3000個(gè)細(xì)胞，分別于0、24、48、72、96 h時(shí)加入1/10體積的CCK8試劑，37 ℃避光孵育2 h后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度，并分別于0 h吸光度相除得到增殖指數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

公共數(shù)據(jù)庫分析公共數(shù)據(jù)集選取基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus，GEO)的GSE19784數(shù)據(jù)集，此數(shù)據(jù)集包括320例新診斷的多發(fā)性骨髓瘤樣本，測(cè)序平臺(tái)為GPL570，數(shù)據(jù)集下載使用GEOquery進(jìn)行，在得到數(shù)據(jù)后，使用preprocessCore包進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，并使用survival包進(jìn)行生存分析，基因之間的相關(guān)性分析使用R自帶函數(shù)cor.test進(jìn)行。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)均使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，zumicroarray數(shù)據(jù)使用R語言分析，版本為3.3.4。其中定量數(shù)據(jù)使用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

RPS9在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況，以及與患者年齡、髓外浸潤的相關(guān)性首先檢測(cè)10例健康志愿者骨髓單個(gè)核細(xì)胞(CON)以及30例多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓CD138+細(xì)胞的RPS9表達(dá)，結(jié)果表明CON與CD138+細(xì)胞RPS9 相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.12 和 5.45±0.71，骨髓瘤患者CD138+細(xì)胞中RPS9表達(dá)量顯著升高(t=4.291，P=0.0036)，蛋白檢測(cè)結(jié)果表明在大多數(shù)CD138+樣本中，RPS9高表達(dá)(圖1A)。在GSE19784數(shù)據(jù)集中，RPS9與患者總體生存率相關(guān)[P=0.004，beta=0.26，HR(95%CI)=1.43(1.1～1.6)，wald=8.3](圖1B)。在患者臨床信息中，RPS9被證實(shí)在年老患者與髓外浸潤陽性患者中高表達(dá)，提示RPS9可能為多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病過程中的癌基因。

RPS9的敲低與人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系RPMI8226凋亡、增殖的關(guān)聯(lián)在確定RPS9在骨髓瘤CD138+細(xì)胞中高表達(dá)后，構(gòu)建RPS9-shRNA，并包裝為慢病毒，人骨髓瘤細(xì)胞系RPMI8226在感染CON與RPS9-shRNA慢病毒48 h后，首先使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光蛋白陽性細(xì)胞比例，以確定感染效率，結(jié)果顯示相對(duì)于未感染病毒的RPMI8226，CON與RPS9-shRNA細(xì)胞綠色熒光蛋白+細(xì)胞比例均在90%以上(圖2A)。提取出RPMI8226-CON與RPMI8226-RPS9-shRNA 總RNA與蛋白后，分別使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR與Western blot檢測(cè)RPS9表達(dá)的變化，結(jié)果顯示在mRNA水平，CON與RPS9-shRNA的RPS9相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.12和0.19±0.02，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.963，P=0.0022)。在蛋白水平，RPS9-shRNA細(xì)胞中的RPS9顯著降低(圖2B)。在RPMI8226感染CON與RPS9-shRNA慢病毒48 h后，CON與RPS9-shRNA組細(xì)胞膜聯(lián)蛋白 V 陽性細(xì)胞比例分別為3.47±0.37 和 18.60±1.64，RPS9-shRNA組顯著高于CON組(t=9.015，P=0.0008)(圖2C)。在增殖中，CON組與RPS9-shRNA組在72 h時(shí)增殖指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.846，P=0.0024)(圖2D)。在細(xì)胞周期中，CON與RPS9-shRNA組在感染病毒48 h時(shí)，G2期細(xì)胞比例分別為(29.28±3.42)% 和(10.43±1.43)%，CON顯著高于RPS9-shRNA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.329，P=0.0007)(圖2E)。

RPS9對(duì)凋亡作用的機(jī)制確定RPS9抑制能夠促進(jìn)RPMI8226凋亡、抑制增殖后，找出GSE19784數(shù)據(jù)集中與RPS9表達(dá)相關(guān)的、并在類泛素蛋白修飾分子、泛素化通路中發(fā)揮功能的基因，最終確定為SENP1基因[r2(95%CI)=0.48(0.37～0.60)，t=9.92，P<0.0001]，與此同時(shí)RPS9表達(dá)與編碼IκBα的NFKBIA基因呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)[r2(95%CI)=-0.33(-0.46～-0.19)，t=6.34，P<0.0001](圖3A)。提取RPMI8226 CON與RPS9-shRNA細(xì)胞總蛋白，并檢測(cè)SENP1的表達(dá)，結(jié)果顯示SENP1的表達(dá)顯著降低(圖3B)。隨后構(gòu)建SENP1過表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染至RPMI8226-RPS9-shRNA細(xì)胞中，Western blot確定SENP1過表達(dá)的效率(圖3C)。并檢測(cè)CON組、RPS9-shRNA組、shRPS9-SENP1組核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)通路P65亞基以及抑制因子IκBα的表達(dá)，結(jié)果顯示隨著RPS9的抑制，相對(duì)于CON組，RPS9的抑制使P65亞基、IκBα磷酸化受到抑制，P65總表達(dá)量不變，而IκBα的表達(dá)則顯著上升，與此同時(shí)，過表達(dá)SENP1能夠使P65、IκBα磷酸化得到恢復(fù)，IκBα整體表達(dá)量下降(圖3D)。而在SENP1過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染48 h后，檢測(cè)CON組、RPS9-shRNA組、shRPS9-SENP1組凋亡水平的變化，3組膜聯(lián)蛋白 V陽性細(xì)胞比例分別為2.00±0.11、18.29±1.86和8.19±1.36，單因素方差分析顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=36.32，P=0.0004)，CON組與RPS9-shRNA組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.620，P=0.001)，RPS9-shRNA組與shRPS9-SENP1組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.483，P=0.025)，相對(duì)于RPS9-shRNA組，SENP1的過表達(dá)使RPS9介導(dǎo)的凋亡減少(圖3E)。

RPS9：核糖體蛋白S9；Mr：相對(duì)分子質(zhì)量

RPS9：ribosomal protein S9；Mr：relative molecular mass

A.Western blot檢測(cè) RPS9 在骨髓瘤CD138+細(xì)胞中蛋白水平的表達(dá)；B.RPS9在GSE19784公共數(shù)據(jù)集中與患者總體生存率相關(guān)

A.Western blot was performed to detect RPS9 expression in multiple myeloma CD138+cells at protein level；B.RPS9 expression is related with patients’ survival rate in GSE19784 public dataset

圖1RPS9在骨髓瘤CD138+細(xì)胞中高表達(dá)

Fig1RPS9 is highly expressed in myeloma CD138+cells

討 論

多發(fā)性骨髓瘤中已知的異常信號(hào)通路包括NF-κB信號(hào)通路、蛋白酶體通路等[8]。核糖體蛋白在其他腫瘤中的作用已經(jīng)得到證實(shí)，如在肝癌中，RPL36a表達(dá)顯著升高并能夠促進(jìn)急性髓系白血病細(xì)胞的增殖[9]，而RPS3a則被證實(shí)在多種腫瘤如早幼粒白血病細(xì)胞、肝癌、卵巢癌中高表達(dá)[10]，RPS9屬于核糖體蛋白S4P家族，RPS9與p53通路關(guān)系密切，能夠通過p53通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞衰老、分化[7]，而RPS9與多發(fā)性骨髓瘤之間的關(guān)系則報(bào)道較少。

由于骨髓瘤患者表現(xiàn)為異常的CD138+細(xì)胞聚集，因此，本研究首先檢測(cè)了RPS9在CD138+細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果表明RPS9在mRNA與蛋白水平均呈現(xiàn)高表達(dá)，而在骨髓瘤患者中，合并髓外病變的患者預(yù)后顯著變差，患者總體生存率與無病進(jìn)展生存期均顯著下降。相對(duì)于無髓外浸潤的骨髓瘤患者，RPS9在髓外浸潤患者中的表達(dá)顯著上升。在GSE19784公共數(shù)據(jù)集中，RPS9的高表達(dá)也與患者預(yù)后差顯著相關(guān)，基于以上結(jié)果，能夠得出RPS9可能為癌基因的結(jié)論。因此，隨后本研究設(shè)計(jì)了RPS9-shRNA并感染骨髓瘤細(xì)胞，結(jié)果表明RPS9表達(dá)的降低能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制增殖，并使得RPMI8226細(xì)胞系G1期比例顯著上升，G2期比例下降。因此得到結(jié)論，RPS9的抑制能夠起到抑制腫瘤的作用，證實(shí)RPS9可能為腫瘤突變過程中的驅(qū)動(dòng)基因。

CON：對(duì)照組；shRNA：短發(fā)夾RNA；shRPS9：RPS9-短發(fā)夾RNA；FL1-H：1通道-高度；SSC-H：側(cè)向角通道-高度；GFP：綠色熒光蛋白；APC：別藻青蛋白；FL2-H：2通道-高度；PI：碘化丙啶；FL2-A：2通道-面積；a：P<0.01

CON：control；shRNA：short hairpin RNA；shRPS9：short hairpin RNA of RPS9；FL1-H：fluorescence 1-height；SSC-H：side scatter-height；GFP：green fluorescent protein；APC：allophycocyanin；FL2-H：fluorescence 2-height；PI：propidium iodide；FL2-A：fluorescence 2-area；a：P<0.01

A.CON與RPS9-shRNA慢病毒感染RPMI8226細(xì)胞系48 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP+細(xì)胞比例；B.Western blot檢測(cè)RPS9表達(dá)水平的變化；C.膜聯(lián)蛋白V APC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化；D.CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖的變化；E.高濃度PI染色法檢測(cè)細(xì)胞周期的變化

A.after CON and RPS9-shRNA lentivirus infected RPMI8226 cell line for 48 hours，the proportion of GFP+cells was detected by flow cytometry；B.Western blot was performed to detect RPS9 expression change；C.Annexin V APC/PI double staining was performed to detect apoptosis；D.CCK8 was performed to detect cell proliferation；E.high concentration PI staining was performed to detect cell cycle

圖2RPS9促進(jìn)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系RPMI8226凋亡、抑制增殖

Fig2RPS9 promotes apoptosis and inhibits proliferation of human multiple myeloma cell line RPMI8226

RPS9基因本身相關(guān)的報(bào)道不多，在多發(fā)性骨髓瘤中蛋白酶體、NF-κB、類泛素蛋白修飾分子(small ubiquitin-like modifier，SUMO)通路相互關(guān)聯(lián)，且均與患者生存、預(yù)后顯著相關(guān)。對(duì)GSE19784數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析后顯示，RPS9的表達(dá)與SUMO解離酶SENP1以及NFKBIA(編碼IκBα)基因的表達(dá)顯著相關(guān)。NF-κB通路通常情況下兩種亞基隨機(jī)組成的二聚體與抑制因子如IκBα聚合從而不能發(fā)揮功能，在IκBα磷酸化后，IκBα隨后與泛素分子結(jié)合從而降解，這一過程中SUMO分子能夠與泛素分子競(jìng)爭性結(jié)合[11]，而SENP1作為SUMO解離酶的一種，其活性的降低能夠使細(xì)胞中SUMO結(jié)合的蛋白顯著上升，進(jìn)而抑制IκBα降解[12]。與此同時(shí)，本研究證實(shí)RPS9的抑制能夠降低SENP1的表達(dá)，并使得P65亞基磷酸化降低，而總表達(dá)量不變，抑制因子IκBα磷酸化同時(shí)降低，而IκBα則表達(dá)量顯著上升，表明RPS9的抑制使NF-κB通路受到抑制。而在過表達(dá)SENP1后，P65亞基、IκBα磷酸化均得到恢復(fù)，IκBα總表達(dá)量上升，表明RPS9對(duì)NF-κB通路的影響與SENP1相關(guān)。在過表達(dá)SENP1后，RPS9引起的凋亡增加同時(shí)受限，表明SENP1不僅是RPS9影響骨髓瘤通路的關(guān)鍵因子，同時(shí)也是RPS9發(fā)揮抑制凋亡功能的中介。而細(xì)胞生物學(xué)的改變是否由NF-κB通路的改變引起，以及RPS9對(duì)SENP1的調(diào)控具體機(jī)制仍需證明。

SENP1：類泛素蛋白修飾分子特異蛋白酶1；NF-κB：核因子-κB；P-P65：磷酸化-P65；IκBα：抑制因子κBα；P-IκBα：磷酸化-IκBα

SENP1：sentrin-specific protease 1；NF-κB：nuclear factor-κB；P-P65：phosphorylation-P65；IκBα：inhibitory subunit-κBα；P-IκBα：phosphorylation-IκBα

A.在提取出GSE19784數(shù)據(jù)集基因表達(dá)量后，使用Pearson相關(guān)性檢測(cè)RPS9與SENP1、NFKBIA之間表達(dá)的關(guān)系；B.RPMI8226細(xì)胞感染CON與shRPS9慢病毒后，Western blot檢測(cè)SENP1蛋白水平的表達(dá)變化；C.RPMI8226-shRPS9細(xì)胞轉(zhuǎn)染SENP1過表達(dá)載體后，Western blot檢測(cè)SENP1蛋白水平的表達(dá)變化；D.Western blot檢測(cè)RPMI8226-CON、RPMI8226-shRPS9和RPMI8226-shRPS9-SENP1細(xì)胞中，NF-κB通路P65、IκBα的磷酸化水平的變化；E.膜聯(lián)蛋白 V APC/ PI 雙染法檢測(cè)凋亡水平的變化

A.after the expression values were extracted from GSE19784 dataset，Pearson correlation test was performed to confirm the relationships of RPS9 expression with SENP1 and NFKBIA expressions；B.after RPMI8226 cells were infected with CON and shRPS9 lentivirus，the expression level of SENP1 protein was detected by Western blot；C.after RPMI8226-shRPS9 cells transfected the SENP1 overexpression vector，Western blot was performed to detect SENP1 expression at protein level；D.the phosphorylation levels of P65 and IκBα in NF-κB pathway in RPMI8226-CON，RPMI8226-shRPS9，and RPMI8226-shRPS9-SENP1 cells were detected by Western blot；E.change of apoptosis level was detected by annexin V APC/ PI double staining

圖3RPS9通過SENP1影響NF-κB通路以及細(xì)胞凋亡

Fig3RPS9 affects NF-κB pathway and apoptosis through SENP1

綜上，本研究顯示RPS9在多發(fā)性骨髓瘤患者中高表達(dá)，且與患者髓外浸潤、預(yù)后顯著相關(guān)。RPS9的抑制能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制增殖并促進(jìn)細(xì)胞周期的阻滯。與此同時(shí)，RPS9能夠通過SENP1影響骨髓瘤異常信號(hào)通路NF-κB的活性。表明RPS9在多發(fā)性骨髓瘤中起到促進(jìn)作用且與NF-κB相關(guān)。RPS9作為一種研究較少的蛋白，在前人的研究中主要致力于和P53通路的相互作用，且與骨髓瘤的關(guān)聯(lián)尚不清楚。本研究證實(shí)RPS9與骨髓瘤之間的關(guān)聯(lián)，且證實(shí)與NF-κB通路相關(guān)。不足之處在于并未能夠確定RPS9與SENP1的直接關(guān)聯(lián)，在后期的研究中，可能需要通過免疫沉淀、點(diǎn)突變等方式進(jìn)一步研究RPS9與SENP1之間的作用及其對(duì)NF-κB通路的影響。