張 偉，何 婧，伍倫剛，彭現(xiàn)其，李 遠(yuǎn)

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，重慶 402160

腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤患者死亡的首要因素，其轉(zhuǎn)移過(guò)程涉及多個(gè)環(huán)節(jié)，包括腫瘤細(xì)胞從原位灶剝離、向基底膜內(nèi)浸潤(rùn)、基底膜內(nèi)遷移、向毛細(xì)血管中內(nèi)滲、進(jìn)入系統(tǒng)性循環(huán)系統(tǒng)和浸潤(rùn)遠(yuǎn)端組織[1- 2]。其中，腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)并跨過(guò)基底膜內(nèi)的過(guò)程稱(chēng)為腫瘤細(xì)胞侵襲，是研究腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，腫瘤細(xì)胞侵襲能力體外分析應(yīng)用最為廣泛的是遷移/侵襲小室[3- 4]。分析時(shí)，將腫瘤細(xì)胞接種在鋪有基質(zhì)膠濾膜的侵襲上室，在下室中加入趨化因子，具有侵襲能力的腫瘤細(xì)胞將穿過(guò)鋪有基質(zhì)膠的濾膜，通過(guò)檢測(cè)穿過(guò)濾膜并黏附在濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)量來(lái)量化腫瘤細(xì)胞侵襲能力。然而，基于遷移/侵襲小室分析方法為半定量和終點(diǎn)式測(cè)量，檢測(cè)數(shù)據(jù)的信息含量較少，不能對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲過(guò)程進(jìn)行動(dòng)態(tài)可視化觀測(cè)[5]。另一方面，基于微加工技術(shù)設(shè)計(jì)的微流控芯片裝置為深入研究腫瘤侵襲行為提供了新的解決方案[6- 8]。例如，宋振等[8]利用微流控芯片技術(shù)模擬乳腺癌細(xì)胞MDA-MB- 231的3D微環(huán)境，并全程監(jiān)測(cè)在腫瘤壞死因子-α濃度梯度誘導(dǎo)下MDA-MB- 231細(xì)胞侵襲的全過(guò)程；Blaha等[6]通過(guò)在微流控細(xì)胞遷移模型中加入基質(zhì)膠原蛋白構(gòu)建出一個(gè)3D薄屏障，動(dòng)態(tài)觀察分析乳腺癌細(xì)胞MDA-MB- 231浸潤(rùn)過(guò)程中腫瘤細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞間及細(xì)胞-ECM蛋白間的相互作用。盡管基于微流控芯片技術(shù)的腫瘤細(xì)胞體外侵襲模型已取得重要進(jìn)展，但仍存在一些缺陷。首先是報(bào)道采用的微流控芯片加工和微流體操作較為復(fù)雜，一定程度上限制其推廣應(yīng)用；其次是當(dāng)前研究構(gòu)建的3D屏障較“薄”，研究結(jié)果呈現(xiàn)的是腫瘤細(xì)胞侵襲的最終結(jié)果，而未詳細(xì)闡述腫瘤細(xì)胞在3D基質(zhì)膠內(nèi)的遷移行為。本研究報(bào)道一種簡(jiǎn)易的醫(yī)學(xué)研究分析微裝置以期更深入地闡明腫瘤細(xì)胞在基質(zhì)膠內(nèi)的3D遷移行為。利用本裝置，本文首次對(duì)低侵襲性乳腺癌細(xì)胞株MCF- 7的3D遷移過(guò)程和行為進(jìn)行動(dòng)態(tài)追蹤和分析，并進(jìn)一步量化不同化學(xué)抑制劑藥物對(duì)MCF- 7細(xì)胞遷移行為的影響。

材料和方法

微裝置設(shè)計(jì)和制作腫瘤細(xì)胞3D遷移分析微裝置基本單元由一個(gè)遷移通道和通道兩側(cè)腔室組成。其中，遷移通道高0.1 mm，寬1.0 mm；腔室對(duì)稱(chēng)分布在遷移通道兩側(cè)，高度為1.0 mm，體積約為100 μl。分析裝置模具由Solidworks 2016三維建模軟件(Dassault Systemes S.A)繪制，由精密模具生產(chǎn)企業(yè)外協(xié)加工而成。模具三維示意圖和實(shí)物圖如圖1A和1B所示。每一個(gè)模具含4個(gè)結(jié)構(gòu)單元，因此一次制備可獲得4個(gè)獨(dú)立的分析微裝置。模具表面質(zhì)量將直接影響分析微裝置性能，因此需對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制。模具結(jié)構(gòu)單元表面通過(guò)激光三維形狀顯微成像系統(tǒng)(日本基恩士，VK-X150K)進(jìn)行質(zhì)量控制，其表面顯微形狀和3D輪廓圖分別如圖1C和1D所示，表面粗糙度Ra=(0.47±0.05)μm，符合設(shè)計(jì)預(yù)期要求。分析微裝置制作采用微流控芯片軟光刻工藝相類(lèi)似的流程[9]，加工流程示意圖如圖1E所示。如下：首先將聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)基質(zhì)和固化劑按重量10∶1混合而成的預(yù)聚物澆鑄在不銹鋼模具上，抽真空除氣泡，60 ℃下固化3 h。將固化后的PDMS基片從模具上剝離，利用平頭打孔器(直徑5 mm)在遷移通道和腔室兩側(cè)打孔形成樣品出入口，氧等離子清洗機(jī)處理(功率為30 W)1 min后與清洗干凈的載玻片進(jìn)行不可逆鍵合、封裝，形成PDMS-玻璃材質(zhì)的分析微裝置。

細(xì)胞培養(yǎng)低侵襲性乳腺癌細(xì)胞株MCF- 7由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存。常規(guī)條件下，MCF- 7用含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI- 1640培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中分別加入終濃度為5 μmol/L 的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)抑制劑(巴馬司他)(碧云天，中國(guó))和20 μmol/L ATP酶抑制劑(Blebbistation)(碧云天，中國(guó))處理12 h作為藥物處理組(注：預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示使用上述兩種濃度抑制劑作用MCF- 7細(xì)胞12 h不會(huì)降低細(xì)胞活性，結(jié)果未給出)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用1% 胰酶消化，1500 r/min(轉(zhuǎn)子半徑10.4 cm)離心5 min，RPMI- 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，濃度調(diào)整為1×106細(xì)胞/ml，待用。

PDMS：聚二甲基硅氧烷

PDMS：polydimethylsiloxane

A.模具三維結(jié)構(gòu)示意圖；B.模具照片；C.表面形貌；D.表面三維形貌；E.加工流程示意圖

A.3D schematic diagram of the mold structure；B.picture of the mold；C.surface topography；D.three-dimensional surface topography；E.schematic diagram of the processing process

圖1腫瘤細(xì)胞3D遷移分析微裝置的設(shè)計(jì)和制作

Fig1Design and fabrication of the microdevice for 3D migration analysis of tumor cells

趨化因子濃度梯度表征將預(yù)冷的基質(zhì)膠(BD公司)和RPMI- 1640培養(yǎng)液按1∶1(v/v)冰上混勻后加入微裝置遷移通道中。在表面張力作用下，基質(zhì)膠液體將限制在遷移通道內(nèi)；將微裝置放入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜止1 h待基質(zhì)膠聚合；將含10 μg/ml異硫氰酸熒光素標(biāo)記葡聚糖(阿拉丁)(平均相對(duì)分子質(zhì)量 150 000)的PBS溶液或含食用色素的PBS溶液加入一側(cè)腔室中，另一側(cè)加入空白PBS，再次放入37 ℃培養(yǎng)箱中，12 h后取出檢測(cè)遷移通道和兩側(cè)腔室溶液中異硫氰酸熒光素標(biāo)記葡聚糖和食用色素濃度分布。

腫瘤細(xì)胞3D遷移行為動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和量化將預(yù)冷基質(zhì)膠和MCF- 7細(xì)胞懸液按1∶1(v/v)冰上混勻后注入遷移通道內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)箱中靜止1 h使MCF- 7細(xì)胞包埋進(jìn)聚合的基質(zhì)膠內(nèi)；在一側(cè)腔室中加入含化學(xué)誘導(dǎo)劑(20% FBS)的RPMI- 1640培養(yǎng)液，另一側(cè)加入空白的RPMI- 1640培養(yǎng)液，誘導(dǎo)MCF- 7細(xì)胞發(fā)生遷移行為；將上述分析微裝置放入37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)盒(重慶初生犢科技有限公司，中國(guó))，通過(guò)活細(xì)胞動(dòng)態(tài)成像儀(NanoEnTek，韓國(guó))以30 min/幀速度定時(shí)拍攝，記錄MCF- 7細(xì)胞的遷移過(guò)程，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞3D遷移行為的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)示意圖如圖2所示。

細(xì)胞遷移行為通過(guò)ImageJ圖像處理軟件(NIH，美國(guó))對(duì)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)拍攝的序列圖像進(jìn)行量化。遷移速度計(jì)算方法如下：首先將圖像像素校準(zhǔn)為距離，隨后將定時(shí)拍攝的圖像序列以堆棧形式打開(kāi)，采用ImageJ軟件中的“Manual Tracking”插件對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行跟蹤，并將跟蹤數(shù)據(jù)導(dǎo)入Chemotaxis And Migration Tool軟件(Ibidi公司，美國(guó))計(jì)算單個(gè)細(xì)胞遷移速度；細(xì)胞遷移率(%)為圖像視野中的遷移細(xì)胞數(shù)目/細(xì)胞總數(shù)×100(注：將遷移速度大于等于3倍無(wú)化學(xué)誘導(dǎo)劑濃度梯度條件下細(xì)胞平均遷移速度的細(xì)胞定義為遷移細(xì)胞)。

FBS：胎牛血清

FBS：fetal bovine serum

A.細(xì)胞加載進(jìn)遷移微通道；B.加載趨化因子濃度梯度和監(jiān)測(cè)細(xì)胞遷移過(guò)程

A.loading of cells into the migration microchannel；B.loading of chemokine concentration gradient and monitoring of cell migration process

圖2利用微裝置進(jìn)行細(xì)胞3D遷移行為分析實(shí)驗(yàn)示意圖

Fig2Schematic diagram of 3D migration behavior analysis using the microdevice

侵襲小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)將200 μl MCF- 7細(xì)胞接種在預(yù)先涂覆了基質(zhì)膠的小室內(nèi)，下室中加入600 μl含20% FBS的RPMI- 1640培養(yǎng)基。37 ℃下培養(yǎng)24 h后擦除上室上面未侵襲細(xì)胞和基質(zhì)膠，將小室底部浸沒(méi)在0.1%結(jié)晶紫細(xì)胞染色液30 min，PBS沖洗、晾干，計(jì)算6個(gè)視野下細(xì)胞數(shù)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，其中兩組之間的比較采用SNK(或q-檢驗(yàn))。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

趨化因子濃度梯度表征待基質(zhì)膠在分析微裝置細(xì)胞遷移通道聚合后，即在腔室1中加入含色素或熒光物質(zhì)的PBS溶液，結(jié)果顯示色素或熒光物質(zhì)分布在腔室1內(nèi)、腔室2內(nèi)無(wú)色素或熒光物質(zhì)分布，說(shuō)明遷移通道中基質(zhì)膠完全聚合，可對(duì)兩側(cè)腔室內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行空間隔離(圖3A、3C、3E)；加入色素或熒光物質(zhì)12 h的圖像、熒光圖像和熒光強(qiáng)度分布曲線結(jié)果顯示，腔室1內(nèi)部分色素或熒光物質(zhì)通過(guò)基質(zhì)膠擴(kuò)散至腔室2，但兩側(cè)腔室內(nèi)物質(zhì)濃度仍存在差異，提示該裝置能維持物質(zhì)濃度梯度超過(guò)12 h(圖3B、3D、3F)。因此，后續(xù)細(xì)胞3D遷移實(shí)驗(yàn)選擇12 h作為記錄時(shí)間。

MCF- 7細(xì)胞在基質(zhì)膠的遷移行為不同誘導(dǎo)劑濃度梯度分布條件下MCF- 7單細(xì)胞在基質(zhì)膠內(nèi)典型的遷移圖像和軌跡顯示，MCF- 7細(xì)胞沿FBS高濃度方向做定向遷移，且沿FBS高濃度方向的細(xì)胞遷移率超過(guò)90%(圖4A)；無(wú)FBS濃度梯度存在情況下，MCF- 7細(xì)胞無(wú)明顯遷移行為(圖4B)；在MCF- 7細(xì)胞沿FBS濃度梯度遷移12 h后改變FBS濃度梯度方向，細(xì)胞遷移方向也隨之改變(圖4C)。此外，MCF- 7細(xì)胞在整個(gè)遷移過(guò)程中呈類(lèi)球形，維持細(xì)胞的非極化狀態(tài)(圖4A、4C)。遷移過(guò)程中，MCF- 7細(xì)胞形態(tài)和輪廓呈收縮、伸展交替改變(圖4D)。

MCF- 7細(xì)胞在基質(zhì)膠的遷移行為量化分析結(jié)果正常情況下，MCF- 7在基質(zhì)膠內(nèi)細(xì)胞遷移率為(65.5±8.0)%；MMP抑制劑處理后，MCF- 7在基質(zhì)膠內(nèi)細(xì)胞遷移率為(57.9±14.5)%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.79，P=0.47)；ATP酶抑制劑處理顯著降低MCF- 7細(xì)胞遷移率(t=5.99，P=0.004)，為(22.1±9.7)%。無(wú)誘導(dǎo)劑濃度梯度條件下，MCF- 7在基質(zhì)膠內(nèi)平均遷移速度為0.42 μm/h；存在誘導(dǎo)劑濃度梯度條件下，MCF- 7在基質(zhì)膠內(nèi)的遷移平均速度：正常對(duì)照組為(8.39±1.27)μm/h；MMP抑制劑處理后MCF- 7 細(xì)胞遷移平均速度降低為(7.65±1.53)μm/h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.84，P=0.032)；ATP酶抑制劑處理后MCF- 7細(xì)胞遷移平均速度進(jìn)一步降低為(1.76±0.63)μm/h，相比正常對(duì)照組和MMP抑制劑處理均顯著降低(t=26.12，P<0.01；t=32.81，P<0.01)。

侵襲小室細(xì)胞侵襲能力MCF- 7細(xì)胞侵襲能力通過(guò)傳統(tǒng)的侵襲小室進(jìn)行分析，結(jié)果顯示正常對(duì)照組浸潤(rùn)的MCF- 7數(shù)量為24.9±3.44(n=18)，MMP抑制劑和ATP酶抑制劑處理均顯著降低浸潤(rùn)MCF- 7數(shù)量，細(xì)胞數(shù)量分別為8.8±2.43(n=18)和2.8±1.7(n=18)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.2，P<0.01；t=24.5，P<0.01)。此外，ATP酶抑制劑處理后浸潤(rùn)MCF- 7數(shù)量顯著低于MMP抑制劑處理組(t=8.7，P<0.01)(圖5)。

A.0 h圖像；B.12 h圖像；C.0 h熒光圖像；D.12 h熒光圖像；E.0 h熒光強(qiáng)度分布曲線；F.12 h熒光強(qiáng)度分布曲線

A.image at 0 hour；B.image at 12 hours；C.fluorescence image at 0 hours；D.fluorescence image at 12 hours；E.fluorescence intensity distribution curve at 0 hour；F.fluorescence intensity distribution curve at 12 hours

圖3食用色素和熒光物質(zhì)在分析微裝置內(nèi)的分布情況

Fig3Distribution of food pigment and fluorescent substance in the microdevice

討 論

體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜、動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的生理病理過(guò)程，涉及多環(huán)節(jié)和多種轉(zhuǎn)移機(jī)制，深入研究腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中不同的環(huán)節(jié)和機(jī)制將有利于發(fā)展?jié)撛诘哪[瘤治療靶標(biāo)和手段[10]。其中，腫瘤細(xì)胞在3D ECM中的遷移是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移必經(jīng)環(huán)節(jié)[11]。然而，現(xiàn)有的細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和侵襲小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)均不能很好地展示腫瘤細(xì)胞的3D遷移行為?；诖吮尘埃狙芯恐荚诎l(fā)展并驗(yàn)證了一種簡(jiǎn)易的可用于研究腫瘤細(xì)胞3D遷移行為的醫(yī)學(xué)研究微裝置。該裝置能夠與活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀察裝置相兼容，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移行為的可視化監(jiān)測(cè)。乳腺癌是女性腫瘤死亡的首要疾病，MCF- 7細(xì)胞株具有分化乳腺上皮細(xì)胞特征，侵襲能力弱，廣泛用于抗乳腺癌藥物的作用機(jī)制研究[12]，而用于研究乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移較少。基質(zhì)膠來(lái)源于移植性小鼠軟骨肉瘤ECM，體外細(xì)胞培養(yǎng)中廣泛用于模擬基底膜微環(huán)境。因此，本研究利用發(fā)展的微裝置首次分析MCF- 7細(xì)胞在基質(zhì)膠內(nèi)的3D遷移行為，同時(shí)對(duì)微裝置分析性能進(jìn)行驗(yàn)證。

分析微裝置基本單元由一遷移通道和對(duì)稱(chēng)分布在通道兩側(cè)的腔室組成，便于產(chǎn)生誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的趨化因子濃度梯度，同時(shí)易于對(duì)細(xì)胞遷移行為進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。與文獻(xiàn)[6- 7]報(bào)道的微流控芯片細(xì)胞侵襲模型采用的“薄”3D基質(zhì)膠屏障(寬度：20～100 μm)不同，本裝置遷移通道寬1 mm，因此能長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)觀察腫瘤細(xì)胞在3D基底膜中的遷移。同時(shí)，兩側(cè)對(duì)稱(chēng)分布的腔室能夠維持趨化因子濃度梯度長(zhǎng)達(dá)12 h，避免維持趨化因子濃度梯度而進(jìn)行的頻繁換液或連續(xù)灌注，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作。此外，通過(guò)精密機(jī)械加工而成的微裝置模具能長(zhǎng)時(shí)間使用，不易變形，可保證每次制備的微裝置結(jié)構(gòu)一致性。

A.FBS濃度梯度下MCF- 7細(xì)胞典型的遷移圖像和軌跡；B.無(wú)FBS濃度梯度下MCF- 7細(xì)胞典型的遷移圖像和軌跡；C.改變FBS濃度梯度方向MCF- 7細(xì)胞典型的遷移圖像和軌跡；D.MCF- 7細(xì)胞遷移過(guò)程中典型的單細(xì)胞形態(tài)和輪廓變化

A.typical migration images and trajectories of MCF- 7 cells under FBS concentration gradient；B.typical migration images and trajectories of MCF- 7 cells without FBS concentration gradient；C.typical migration image and trajectory of MCF- 7 cells after changing the FBS concentration gradient direction；D.typical morphological and outline changes of MCF- 7 cells during migration

圖4MCF- 7單細(xì)胞在基質(zhì)膠內(nèi)遷移受FBS濃度梯度分布方向控制

Fig4Migration of MCF- 7 single cells in matrigel was controlled by the direction of FBS concentration gradient distribution

A.正常對(duì)照組侵襲細(xì)胞染色圖像；B.MMP抑制劑處理組侵襲細(xì)胞染色圖像；C.ATPase抑制劑處理組侵襲細(xì)胞染色圖像

A.staining image of invaded cells in the normal control group；B.staining image of invaded cells treated with MMP inhibitor；C.staining image of invaded cells treated with ATPase inhibitor

圖5侵襲小室分析MCF- 7細(xì)胞侵襲能力

Fig5Invasiveness of MCF- 7 cells analyzed by transwell assay

研究顯示腫瘤細(xì)胞在3D ECM中遷移至少呈現(xiàn)兩種不同遷移模式，分別為間質(zhì)細(xì)胞樣遷移模式和變形蟲(chóng)樣遷移模式[13]。當(dāng)細(xì)胞以間質(zhì)細(xì)胞樣模式遷移時(shí)，細(xì)胞呈拉伸狀極化形態(tài)，具有片狀偽足樣突出物。該模式下細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)基于路徑“產(chǎn)生”機(jī)制，即依賴(lài)于細(xì)胞遷移前沿分泌的細(xì)胞外蛋白酶(如MMP)對(duì)ECM蛋白水解形成遷移路徑[14]；相反，當(dāng)細(xì)胞以變形蟲(chóng)樣模式遷移時(shí)，細(xì)胞呈圓形非極化狀態(tài)，依賴(lài)路徑“找尋”機(jī)制進(jìn)行移動(dòng)。該模式下細(xì)胞遷移不依賴(lài)于細(xì)胞分泌的蛋白酶，而是通過(guò)細(xì)胞表面的皰疹樣細(xì)胞膜突出物和肌動(dòng)球蛋白產(chǎn)生收縮擠壓力在ECM中移動(dòng)[14]。利用構(gòu)建的分析微裝置對(duì)MCF- 7細(xì)胞在基質(zhì)膠內(nèi)遷移行為進(jìn)行分析，結(jié)果顯示MCF- 7細(xì)胞在遷移過(guò)程中細(xì)胞呈非極化圓形狀態(tài)，且遷移過(guò)程中MCF- 7細(xì)胞形態(tài)和輪廓呈收縮拉伸交替改變，說(shuō)明MCF- 7細(xì)胞在基質(zhì)膠內(nèi)遷移為變形蟲(chóng)樣遷移模式，該結(jié)果與傳統(tǒng)2D環(huán)境下通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)觀察到的MCF- 7細(xì)胞呈間質(zhì)細(xì)胞樣遷移模式存在明顯差異，其原因推測(cè)與MCF- 7細(xì)胞和基質(zhì)膠間的相互作用力所致。此外，MCF- 7細(xì)胞的遷移方向嚴(yán)格受趨化因子(FBS)濃度梯度方向控制，即超過(guò)90%的遷移細(xì)胞朝向高濃度FBS方向定向遷移。該結(jié)果與實(shí)驗(yàn)預(yù)期相符，說(shuō)明本研究裝置在控制、分析腫瘤細(xì)胞3D遷移行為的有效性。

MCF- 7細(xì)胞在基質(zhì)膠內(nèi)遷移行為進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞遷移率和遷移速度進(jìn)行量化，結(jié)果顯示正常情況下超過(guò)60%的MCF- 7細(xì)胞進(jìn)行了遷移，而部分細(xì)胞未呈現(xiàn)明顯的遷移運(yùn)動(dòng)，說(shuō)明MCF- 7細(xì)胞群體的遷移能力存在異質(zhì)性。具有遷移能力的MCF- 7細(xì)胞的遷移平均速度為(8.39±1.27)μm/h，高于文獻(xiàn)[7]報(bào)道高侵襲性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB- 231在基質(zhì)膠膠內(nèi)遷移平均速度7 μm/h。事實(shí)上，MDA-MB- 231在基質(zhì)膠內(nèi)遷移模式符合間質(zhì)細(xì)胞樣遷移模式[7]。因此，MCF- 7細(xì)胞遷移平均速度高于MDA-MB- 231遷移平均速度的原因推測(cè)有兩點(diǎn)：首先，MDA-MB- 231遷移依賴(lài)蛋白酶對(duì)基質(zhì)膠水解過(guò)程，慢于MCF- 7細(xì)胞通過(guò)收縮擠壓力通過(guò)基質(zhì)膠；其次，遷移過(guò)程中MCF- 7細(xì)胞的球形形態(tài)相比MDA-MB- 231的拉伸形態(tài)能最大限度地減少遷移過(guò)程中基質(zhì)膠物理阻力；相比正常對(duì)照組，MMP抑制劑處理未能明顯降低MCF- 7細(xì)胞遷移率和遷移速度，說(shuō)明MCF- 7細(xì)胞的遷移模式為不依賴(lài)于MMP的變形蟲(chóng)樣遷移模式，同時(shí)也部分解釋單純MMP抑制劑藥物在抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移行為的有限治療效果。ATP酶抑制劑(Blebbistation)是一種細(xì)胞通透性非肌肉肌球蛋白Ⅱ型ATP酶抑制劑，研究報(bào)道其能抑制肌動(dòng)蛋白激活的Mg-ATP酶收縮活性和肌球蛋白收縮動(dòng)力[15]。本研究結(jié)果顯示ATP酶抑制劑處理顯著降低MCF- 7細(xì)胞遷移率和遷移平均速度，說(shuō)明MCF- 7細(xì)胞的遷移依賴(lài)細(xì)胞肌動(dòng)球蛋白產(chǎn)生收縮擠壓力，而ATP酶抑制劑通過(guò)抑制肌球蛋白收縮動(dòng)力從而抑制MCF- 7細(xì)胞的變形蟲(chóng)樣遷移模式；此外，ATP酶抑制劑處理后MCF- 7細(xì)胞遷移率和遷移平均速度顯著低于MMP抑制劑處理組，說(shuō)明針對(duì)MCF- 7的遷移模式，ATP酶抑制劑在抑制其遷移行為更為有效，再一次說(shuō)明研究腫瘤細(xì)胞3D遷移行為對(duì)于發(fā)展腫瘤轉(zhuǎn)移抑制精準(zhǔn)治療的意義。

分析微裝置研究結(jié)果通過(guò)傳統(tǒng)的侵襲小室實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，與分析微裝置研究結(jié)果不同的是，侵襲小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MMP抑制劑能顯著降低抑制MCF- 7細(xì)胞的侵襲能力。其原因推測(cè)與侵襲小室分析包含了腫瘤細(xì)胞向基質(zhì)膠中浸潤(rùn)、3D遷移和從基質(zhì)膠中滲出3個(gè)步驟，MMP抑制劑可能抑制MCF- 7細(xì)胞向基質(zhì)膠中浸潤(rùn)和從基質(zhì)膠滲出環(huán)節(jié)。同時(shí)，相比本研究的分析微裝置，傳統(tǒng)的侵襲小室分析方法僅能量化最終的浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)量，所獲得的數(shù)據(jù)信息有限，不能深入地研究和闡釋腫瘤侵襲各步驟的行為和機(jī)制。

本研究仍存在一些不足和需要改進(jìn)的地方：首先，本研究?jī)H分析了一種乳腺癌細(xì)胞株MCF- 7，其他類(lèi)型乳腺癌細(xì)胞的3D遷移行為正在研究中；其次，僅考慮腫瘤細(xì)胞在一個(gè)平面的遷移，沿深度/高度方向的遷移行為暫未做考慮；第三，僅考慮了基質(zhì)膠，腫瘤細(xì)胞在其他類(lèi)型的ECM(如膠原蛋白)中遷移行為將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行；第四，本研究?jī)H探討了腫瘤細(xì)胞遷移環(huán)節(jié)，利用本裝置全過(guò)程研究腫瘤細(xì)胞的侵襲行為(侵襲、遷移和滲出)正在進(jìn)行。

綜上，本研究發(fā)展并驗(yàn)證了一種簡(jiǎn)易的用于體外分析腫瘤細(xì)胞在ECM中3D遷移行為的醫(yī)學(xué)研究微裝置。結(jié)果顯示MCF- 7細(xì)胞在基質(zhì)膠中呈變形蟲(chóng)樣遷移模式，且MMP抑制劑和ATP酶抑制劑對(duì)MCF- 7細(xì)胞遷移行為具有不同的抑制能力。本裝置操作簡(jiǎn)單，可精確控制細(xì)胞的生化、物理學(xué)微環(huán)境，未來(lái)可用于開(kāi)展腫瘤細(xì)胞3D培養(yǎng)、靶向藥物篩選、腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制及轉(zhuǎn)移過(guò)程的體外模擬等研究。