楊亞旭 李躍華 魏小二

腫瘤微血管密度已經(jīng)作為評(píng)估腫瘤微血管生成的重要標(biāo)志之一，是代表性的量化指標(biāo)，其與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)正相關(guān)。MVD增加，腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的惡性潛能也顯著增加，是腫瘤侵襲性的特征性生物學(xué)指標(biāo)之一[1]。然而，目前評(píng)價(jià)MVD的方法是創(chuàng)傷性的、要求取材非常準(zhǔn)確，并且無(wú)法對(duì)腫瘤血管生成活性進(jìn)行功能評(píng)價(jià)，因此這些缺點(diǎn)使之不能成為一

種理想的檢查手段。體素內(nèi)不相干運(yùn)動(dòng)（intravoxel incoherent motion，IVIM）最早由Le等[2]學(xué)者提出，是一種多b值、無(wú)創(chuàng)性以及可重復(fù)性反映活體組織水分子運(yùn)動(dòng)的成像方法，對(duì)腫瘤解剖結(jié)構(gòu)的顯示、腫瘤血管生成的評(píng)估以及抗腫瘤血管的療效和預(yù)后有著重大價(jià)值。國(guó)外學(xué)者已經(jīng)應(yīng)用IVIM技術(shù)針對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)[3]、乳腺病變[4]、肝硬化[5]、腎臟[6]及胰腺病變[7]進(jìn)行成像，然而在軟組織腫瘤方面的研究還鮮有報(bào)道。

方 法

1.基本材料

將40只新西蘭大白兔隨機(jī)分為4組，分別為1周組（10只）、2周組（10只）、3周組（10只）、4周組（10只），以正常大腿肌肉組織作為對(duì)照組。將荷瘤兔腫瘤取出剪碎后制成VX2腫瘤懸液，將腫瘤懸液注入兔大腿肌肉內(nèi)制作成實(shí)驗(yàn)兔后進(jìn)行磁共振掃描。

2.MR掃描設(shè)備參數(shù)

上述4組實(shí)驗(yàn)兔在VX2瘤細(xì)胞植入后1周均進(jìn)行磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）掃描，明確4組腫瘤種植是否成功以及了解4組間VX2腫瘤的初始狀況，同時(shí)1周組MRI掃描結(jié)束后處死荷瘤兔、取出腫瘤組織進(jìn)行分析。完成第一次MRI掃描后，2周組在種植后2周、3周組在種植后3周、4周組在種植后4周進(jìn)行MRI掃描，各組在MRI掃描后處死實(shí)驗(yàn)兔，取出腫瘤組織進(jìn)行分析。

采用 3.0T 臨床用MRI掃描儀（Ingenia， 荷蘭飛利浦公司）和8通道頭顱表面線圈（上海辰光醫(yī)療科技股份有限公司）進(jìn)行掃描。具體掃描序列和 掃 描 參 數(shù) 如 下：T2W： TR/TE=2800/100ms，NSA=4， 層 厚 =2mm， FOV=180×180mm，矩 陣=224×224。T1W 和 增 強(qiáng) 后 T1W（post-T1W）：TR/TE=500/20ms， NSA=4， 層 厚 =2mm，F(xiàn)OV=180×180 mm，矩陣=224×224。DWI（彌散加權(quán)成像）采用ss-EPI序列（單次激發(fā)平面回波序列）來(lái)完成：TR/TE=2000/86ms， NSA=4，層厚=2mm，F(xiàn)OV=180×180mm，矩陣=75×75，b值分別為0，800s/mm2，ADC圖由掃描機(jī)器自帶軟件自動(dòng)生成。IVIM序列參數(shù)與DWI一致，但是b值不同，b值分別采用0、25、50、75、100、150、200、400、600、800s/mm2。增強(qiáng)掃描如下：經(jīng)兔耳緣靜脈按0.1mmol/kg注射Gd-DTPA（馬根維顯，469.01mg/ml，拜爾先寧）后，進(jìn)行增強(qiáng)后T1W掃描，掃描參數(shù)如前所述。

3.數(shù)據(jù)處理

將IVIM數(shù)據(jù)傳輸至后處理工作站，利用MRI/DWI Toolbox后處理軟件包生成D、D*、f偽彩圖。以T2W、T1W、post-T1W圖像為參考，在T2W橫斷面圖像中選取腫瘤組織最大層面圖像，避開(kāi)囊變壞死，在腫瘤實(shí)性部分取3點(diǎn)作為ROI（region of intrest）區(qū)進(jìn)行測(cè)量，分別測(cè)量D、D*、f值，三點(diǎn)平均值作為測(cè)量最終結(jié)果，ROI面積3.2～4.0cm2，平均3.5cm2。以post-T1W圖像為基礎(chǔ)來(lái)計(jì)算各組VX2腫瘤體積。同時(shí)在VX2腫瘤同側(cè)大腿肌肉劃定感興趣區(qū)，測(cè)量上述MRI定量參數(shù)作為參照。

4.組織學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)兔在完成MRI掃描后處死實(shí)驗(yàn)兔，將位于兩側(cè)后肢根部背側(cè)的VX2腫瘤完整剝離切除，經(jīng)10%甲醛溶液固定，切取相應(yīng)組織塊進(jìn)行石蠟包埋，選取與MRI像最大層面相對(duì)應(yīng)的石蠟塊進(jìn)行切片，分別進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色和CD34免疫組化分析。最后再對(duì)CD34的結(jié)果進(jìn)行半定量分析，來(lái)計(jì)算微血管數(shù)。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用 SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（Chicago，IL，USA)，P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)值均輸入到excel表格并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。使用單因素方差分析分析各組間病灶體積、MVD數(shù)以及各MRI參數(shù)之間的差異，利用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)分析MRI參數(shù)與MVD指數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系。

結(jié) 果

1.一般情況

4組實(shí)驗(yàn)兔均完成了最終的MRI掃描，所有實(shí)驗(yàn)兔均造模成功，共發(fā)現(xiàn)80個(gè)VX2腫瘤。4組實(shí)驗(yàn)兔的肌肉組織的ADC值、D值、D*值和f值之間均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05），表明本研究所采用的MRI-IVIM掃描以及后處理方法也是穩(wěn)定、可靠的。此外，各組在腫瘤種植后1周時(shí)腫瘤體積、ADC值、D值、D*值和f值之間也均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均 ＞0.05）。

2.腫瘤體積、MVD以及ADC值、D值、D*值和f值參數(shù)的動(dòng)態(tài)變化

隨著時(shí)間的推移，腫瘤體積急劇增加，在2周時(shí)出現(xiàn)壞死。2周組體積大于1周組（P=0.054），3周組大于2周組（P＜0.001）、4周組大于3周組（P＜0.001）。關(guān)于VX2腫瘤的ADC值，2周組的小于1周組（P＜0.001），3周組小于2周組（P＜0.001），4周組也小于3周組（P=0.013）。腫瘤的MVD在腫瘤的不同階段也存在差異，2周組的MVD大于1周組（P＜0.001），3周組的 MVD大于 2周組（P＜0.001），而4周組的MVD也小于3周組的MVD（P＜0.001）。2周組的f值大于1周組（P＜0.001），3周組的f值大于2周組（P＜0.001），而4周組的f值小于3周組（P＜0.001）。2周組的D值小于1周組（P＜0.001），3周組的D值小于2周組（P=0.004），而3周組和4周組D值之間的值無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.212）。2周組的D*值大于1周組（P＜0.001），3周組的D*值小于2周組（P＜0.001），而4周組的D*值相對(duì)于3周組有降低的趨勢(shì)（P=0.067）（表1，圖1、2）。

表1 各組VX2腫瘤ADC值、MVD計(jì)數(shù)、D值、D*值和f值之間的比較

表2 VX2腫瘤的ADC值、D值、D*值和f值與MVD計(jì)數(shù)之間的相關(guān)性

圖1 每組代表性實(shí)驗(yàn)兔的MRI圖像。不同時(shí)間點(diǎn)的VX2腫瘤，其ADC值、f值、D值和D*值也發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。

圖2 每組代表性實(shí)驗(yàn)兔的CD34免疫組化圖。CD34染色顯示CD34陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞染成褐色，與相鄰腫瘤細(xì)胞有明顯分離，不同時(shí)間點(diǎn)的VX2腫瘤CD34陽(yáng)性存在差異。

3.MRI-IVIM定量參數(shù)與MVD計(jì)數(shù)之間的相關(guān)性

4周組D*值與MVD計(jì)數(shù)之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性趨勢(shì)，其他各組D*值和f值與MVD計(jì)數(shù)之間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，而各組ADC值和D值與MVD計(jì)數(shù)之間均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性（表2）。

討 論

本研究采用彌散序列成像來(lái)反映腫瘤組織內(nèi)的灌注信息，盡管彌散與灌注之間存在一定的聯(lián)系，但兩者之間仍然存在一定的差異。目前臨床內(nèi)應(yīng)用的彌散序列所包含的不僅僅是水分子運(yùn)動(dòng)的信息，也包含了毛細(xì)血管灌注信息，即在小b值彌散成像時(shí)所得到的ADC值主要由毛細(xì)血管內(nèi)的血液灌注所貢獻(xiàn)。本研究在應(yīng)用多b值成像時(shí)利用低b值的圖像部分從而獲得腫瘤內(nèi)的灌注信息。從病理學(xué)角度來(lái)看，毛細(xì)血管內(nèi)灌注與腫瘤內(nèi)MVD密切相關(guān)，其血管密度直接決定了單位時(shí)間內(nèi)從毛細(xì)血管內(nèi)流入腫瘤細(xì)胞內(nèi)的血流量。從本研究結(jié)果來(lái)看，隨著VX2腫瘤的進(jìn)展，MVD的變化與D*及f值呈一定的相關(guān)性，而與ADC及D值無(wú)明顯相關(guān)性。對(duì)此我們的解釋是MVD主要反映了腫瘤微血管的定量指標(biāo)，即在單位組織內(nèi)毛細(xì)血管的量化。D*值主要是反映毛細(xì)血管內(nèi)流出到組織間隙的灌注值，f值反映的是微循環(huán)灌注所占整個(gè)血流灌注的比值。本研究中在腫瘤生長(zhǎng)早期的大多數(shù)腫瘤細(xì)胞處于G1期及S期，VX2的種植時(shí)間延長(zhǎng)，腫瘤的進(jìn)展，在S期及G2期其表達(dá)急劇增加，腫瘤細(xì)胞增殖活躍，其侵襲性更強(qiáng)、惡性程度更高，其特征表現(xiàn)為腫瘤微血管的密度增加。隨著腫瘤進(jìn)展，腫瘤細(xì)胞密度相對(duì)增加，其對(duì)應(yīng)的影像學(xué)指標(biāo)ADC值相對(duì)也降低，同時(shí)D值是反映水分子彌散的指標(biāo)，隨著腫瘤進(jìn)展，D值下降，這與以往研究結(jié)果較為一致。Chandarana等[8]在以IVIM研究腎臟時(shí)發(fā)現(xiàn)，D*及f值針對(duì)腎臟腫瘤的定性與分型具有重要的意義。在與病理對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，f值及D*值可以反映腫瘤血管的密集程度與VEGF的表達(dá)。而本研究中的其他參數(shù)如ADC值在b值＞200mm2/s所反映主要是水分子彌散與血流灌注的綜合值；D值則反映的是水分子彌散的實(shí)際情況，二者與腫瘤血管的量化相關(guān)性不如f值及D*值。本研究只研究到腫瘤種植后的28天，其主要原因?yàn)樵?8天左右的大體病理標(biāo)本中已經(jīng)出現(xiàn)腫瘤的壞死。在腫瘤出現(xiàn)壞死后，影響其血流灌注的因素將多樣化，隨著腫瘤細(xì)胞進(jìn)展，腫瘤的供血不足時(shí)，腫瘤細(xì)胞的灌注不僅僅由MVD所決定，其他因素如組織內(nèi)靜水壓在腫瘤進(jìn)展末期由次要因素變?yōu)橹饕蛩亍?/p>

腫瘤血管生成是實(shí)體性腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，間質(zhì)流體壓力（IFP）是反映腫瘤血管的一項(xiàng)指標(biāo)，在正常組織中，新生血管受促血管生成因子和抗血管生成因子的共同作用調(diào)控，處于一種平衡狀態(tài)。然而腫瘤組織中，這種平衡被打破，導(dǎo)致雜亂的不正常新生血管生成， 這些不正常的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了腫瘤血管上的滲漏及血管中血液的異常，進(jìn)而導(dǎo)致淋巴系統(tǒng)的異常，因此增加了組織液壓。腫瘤部位的異常脈管系統(tǒng)與較高的IFP阻礙了藥物的傳輸，并且有研究指出IFP在腫瘤缺氧、周圍血管生成、腫瘤周圍淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)展中起著重要作用。因此，IFP已被認(rèn)為是治療實(shí)體腫瘤的關(guān)鍵障礙之一。比較困難的是目前沒(méi)有可靠的生物標(biāo)志物來(lái)檢測(cè)IFP。先前研究表明，IFP的升高會(huì)導(dǎo)致腫瘤血流減少，我們假設(shè)可以用擴(kuò)散加權(quán)圖像（DWI）作為一種手段來(lái)檢測(cè)毛細(xì)血管血流減少。Kim等[9]采用擴(kuò)散加權(quán)圖像（DWI）對(duì)乳腺癌模型小鼠進(jìn)行研究，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了針刺IFP測(cè)定。用傳統(tǒng)的單指數(shù)模型和雙指數(shù)模型進(jìn)行Voxel分析后得出結(jié)論：擴(kuò)散系數(shù)D與IFP相關(guān)，IFP與f和D*的中位數(shù)乘積相關(guān)，支持使用IVIMDWI指標(biāo)作為腫瘤IFP的無(wú)創(chuàng)生物標(biāo)志物，利用這一無(wú)創(chuàng)性的成像方法在抗腫瘤血管生成治療中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，非侵入性、快速、可重復(fù)地顯示腫瘤血管特征的特性，對(duì)于評(píng)估腫瘤血管生成，抗血管生成藥物療效和預(yù)后具有重要的臨床意義。本研究以兔的肌肉組織VX2模型為研究對(duì)象，采用IVIM 成像技術(shù)研究不同時(shí)期腫瘤內(nèi)MVD變化，發(fā)現(xiàn)IVIM成像可以用來(lái)評(píng)價(jià)腫瘤血管的特性并具有一定的價(jià)值。