王春宇，徐珊珊，郭茂祖,2+，車 凱，劉曉燕

1.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 計算機科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150001

2.北京建筑大學(xué) 電氣與信息工程學(xué)院，北京 100044

1 引言

細胞是一個高度有序的結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部包含多種細胞器，諸如細胞核、細胞壁、核糖體、線粒體、高爾基體等，這些細胞器統(tǒng)稱為亞細胞位置。蛋白質(zhì)是細胞最重要的組成物質(zhì)之一。一種蛋白質(zhì)只有處于特定的亞細胞位置，其功能才能正常表達，否則生物體就會發(fā)生嚴(yán)重功能缺失或紊亂。因此，蛋白質(zhì)的亞細胞定位，是藥物設(shè)計、蛋白質(zhì)組學(xué)、細胞生物學(xué)的基本目標(biāo)之一[1-4]。

生命科學(xué)研究進入后基因組時代以來，基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的高速發(fā)展使得生物信息的信息量膨脹極為迅速。采用生化實驗的方法，進行蛋白質(zhì)亞細胞定位，耗時費物，遠不能適應(yīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)海量增長的現(xiàn)狀。因此，探索自動化處理大規(guī)模生物信息方法的重要性顯得愈加突出[5]。

最近提出的性能優(yōu)良的亞細胞定位方法大多使用基因本體論（gene ontology，GO）來構(gòu)造特征向量進行分類。盡管這些預(yù)測器的性能都很好，它們的預(yù)測結(jié)果卻很難解釋，因為其中涉及到了大量的GO注釋。本文不再使用GO數(shù)據(jù)，選擇最原始氨基酸序列數(shù)據(jù)作為問題輸入，這既保留了蛋白質(zhì)的序列信息，又降低了預(yù)處理大規(guī)模蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)集時難度。

本文把蛋白質(zhì)亞細胞定位問題看成一個分類問題?？紤]到領(lǐng)域移植的便捷性和人工構(gòu)造特征的諸多不便，采用端到端的深度學(xué)習(xí)方法。首先嘗試基于卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（convolutional neural network，CNN）的方法。該方法能自動從氨基酸序列中抽取隱含的特征，從而進行蛋白質(zhì)亞細胞定位，但是CNN模型對氨基酸序列空間序列關(guān)系的刻畫能力不強。因此，為了能更好地挖掘氨基酸序列的時序關(guān)系，使用LSTM（long short-term memory network）學(xué)習(xí)分段后的氨基酸序列，但LSTM比較依賴氨基酸的分段方法，即每個時刻輸入的序列片段?；谏鲜銮闆r，根據(jù)任務(wù)和氨基酸序列的特殊性，結(jié)合了CNN和LSTM的優(yōu)點，構(gòu)建了一種基于卷積的長短期記憶網(wǎng)絡(luò)（Convolutional-LSTM，ConvLSTM），使用CNN從氨基酸序列中抽取特征信息，隨后對特征信息進行重新組合，使用LSTM學(xué)習(xí)重新組合后的特征，得到分類結(jié)果。該網(wǎng)絡(luò)兼顧了氨基酸序列的隱含特征信息和序列中氨基酸之間的時序關(guān)系。

2 相關(guān)工作

蛋白質(zhì)的亞細胞位置決定了它的生物學(xué)功能。目前，利用實驗手段進行亞細胞定位的方法大致分為以下三種：（1）熒光顯微法；（2）電子顯微法；（3）超速離心分離法。但是，這些技術(shù)既費時，又不易于推廣到大規(guī)模蛋白質(zhì)亞細胞定位中去。隨著蛋白質(zhì)相關(guān)數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)量的快速增長，為了更好地研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，越來越多的機器學(xué)習(xí)方法被應(yīng)用到蛋白質(zhì)亞細胞定位的研究中[6-7]。

一般來說，亞細胞定位方法包括以下三個步驟：

（1）蛋白質(zhì)特征信息的提取。從蛋白質(zhì)相關(guān)數(shù)據(jù)庫中搜尋蛋白質(zhì)的特征信息，或者根據(jù)蛋白質(zhì)的序列特征（如：不同氨基酸的親水和疏水指標(biāo)）建立蛋白質(zhì)的特征向量作為蛋白質(zhì)亞細胞定位預(yù)測的輸入。特征信息的選取不同對于亞細胞定位預(yù)測的精度有較大的影響。

（2）選擇合適的機器學(xué)習(xí)算法，根據(jù)提取的特征信息對蛋白質(zhì)定位進行預(yù)測。算法是影響亞細胞定位預(yù)測精度的重要因素之一，目前主要的方法有支持向量機（support vector machine，SVM）、K階最近鄰（K-nearest neighbor，KNN）和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。

（3）選用不同的檢驗方法（如Jackknife檢驗和獨立樣本檢驗）對預(yù)測結(jié)果進行評價。

本文為了與前人方法進行更好的對比，選用一種經(jīng)典的方法——基于SVM的MultiLoc方法，作為基線方法[8]。

如圖1所示，MultiLoc是一種基于SVM方法。該方法將蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)作為輸入，分別輸入到第一層的四種預(yù)測方法SVMTarget、SVMSA、SVMaac和MotifSearch中，得到包含每個蛋白質(zhì)特征的信息向量PPV（protein profile vector）；然后將PPV作為輸入，使用一種1對1的SVM方法——TargetLoc，根據(jù)概率估計進行分類。

3 蛋白質(zhì)亞細胞定位算法

3.1 基于卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的蛋白質(zhì)亞細胞定位

CNN模型已被證實在圖像識別、文本分類等任務(wù)中具有良好表現(xiàn)[9-11]。亞細胞定位問題實質(zhì)上是一個分類問題，因此嘗試使用基于CNN模型的亞細胞定位。CNN模型由輸入層、卷積層、特征組合層和Softmax層組成。

（1）輸入層

對于給定長度為n的氨基酸系列，使用xi∈Rk代表氨基酸序列中第i個氨基酸經(jīng)過獨熱編碼后的向量，整個氨基酸序列可以表示成x1:n∈Rn×k，由每一個氨基酸向量連接而成，如式（1）所示：

其中，⊕代表將氨基酸向量依次進行連接操作。

（2）卷積層

卷積操作可以看作是基于滑動窗口的特征提取，主要用來捕捉氨基酸之間的局部信息。在生物學(xué)上，由多個氨基酸組成的多肽才能行使功能，因此選用1-D的卷積核，將若干個氨基酸一起卷積，抽象其特征。

本文定義了兩步卷積操作。首先，對于輸入的氨基酸序列進行卷積，定義1-D卷積核的長度為hk，大小為ω∈R1×(hk)，即窗口中有h個長度為k的氨基酸。卷積核通過式（2）所示的操作得到一個特征表示：

該卷積核依次對氨基酸序列中所有的窗口{x1:h,x2:h+1,x3:h+2,…,xn-h+1:n}進行滑動卷積，得到一個feature mapF∈Rn-h+1，如式（3）所示：

Fig.1 Method of MultiLoc圖1 MultiLoc方法

定義m個卷積核，得到m個F。

隨后設(shè)定不同長度的1-D卷積核對初步卷積后的氨基酸局部信息再卷積，得到不同的抽象特征。

（3）特征組合

將卷積操作后得到的所有feature map依次拼接在一起，保留所有的局部特征，將其作為全連接層的輸入。

（4）Softmax層

針對本文使用的數(shù)據(jù)，輸出類別數(shù)即蛋白質(zhì)亞細胞位置數(shù)。比如針對使用的動物蛋白，該模型的Softmax層輸出維度為9。Softmax之所以適用于本問題的場景，在于它的輸出可以解釋成條件概率，根據(jù)條件概率的值可以確定蛋白質(zhì)被分到哪一類亞細胞結(jié)構(gòu)中去。

3.2 基于長短期記憶網(wǎng)絡(luò)的蛋白質(zhì)亞細胞定位

基于CNN的蛋白質(zhì)亞細胞定位方法雖然對蛋白質(zhì)進行深層特征抽取得到了亞細胞定位，但在特征抽取的過程中沒有考慮到氨基酸的時序信息。氨基酸的先后信息，即其排列方式一定會對其功能的表達產(chǎn)生影響，因此為了更好地對氨基酸的時序信息建模，考慮采用LSTM模型。

LSTM由Hochreiter等人于1997年提出，是一種時間遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，可以學(xué)習(xí)長期依賴信息[12]。LSTM模型由輸入層、長短期記憶層和Softmax分類層組成，LSTM層由一系列重復(fù)的Cell組成，最后一個Cell的輸出為送入Softmax層。

（1）輸入層

由于實際的實驗設(shè)置中，氨基酸序列中包含1 000個氨基酸，每個氨基酸向量長度為20，若以每個氨基酸向量作為一個時刻的輸入，那么每個時刻得到的信息過少，不能很好地發(fā)揮LSTM的效果。因此在這部分實驗中，將每10個或每20個連續(xù)的氨基酸連接在一起，作為一個時刻的輸入，確保每個時刻的輸入能包含足夠多的信息。按照順序依次將氨基酸片段送入對應(yīng)的Cell，以保證氨基酸序列的時序性。

（2）長短期記憶層

Fig.2 Cell of LSTM圖2LSTM的Cell

長短期記憶層由一系列重復(fù)的Cell組成，如圖2所示。每個Cell接受上一時刻的隱層輸出ht-1以及當(dāng)前時刻的輸入xt。每個Cell由輸入門it、遺忘門ft和輸出門ot組成，對于LSTM中的每個Cell，其工作方式如下：

遺忘門用于控制清除或保留現(xiàn)有信息的程度，其中σ為sigmoid激活函數(shù)。

輸入門用于控制當(dāng)前輸入xt和上一層隱層輸出ht-1中哪些新的信息將被輸入。

tanh層用于Cell的更新變換，計算什么新信息將被存放在cell狀態(tài)中，其中tanh為激活函數(shù)。

計算新的候選值，即下一個時刻的狀態(tài)，更新舊Cell狀態(tài)。

輸出門用于確定Cell狀態(tài)哪部分能輸出：

最終的隱層輸出：

（3）Softmax層

與CNN中的Softmax層相同。

3.3 基于卷積長短期記憶網(wǎng)絡(luò)的蛋白質(zhì)亞細胞定位

ConvLSTM模型是Sainath等人[13]于2015年首次提出的，并在語音、圖像等領(lǐng)域有了一些應(yīng)用[14-15]。

本文將該模型應(yīng)用到蛋白質(zhì)細胞定位的問題上：首先，為了增強特征表達，使用多層的卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)特征代替?zhèn)鹘y(tǒng)的手工特征。多層卷積特征融合了低層局部信息和高層功能信息，能夠捕獲豐富的空間信息。然后，將提取到的卷積特征經(jīng)過特征組合后輸入LSTM層。最后，通過Softmax層得到最后的分類結(jié)果。結(jié)構(gòu)如圖3所示，包含了輸入層、卷積層、特征組合層、長短期記憶層和Softmax層。

Fig.3 Model of ConvLSTM圖3ConvLSTM模型

與前人工作的不同在于卷積的方式和特征組合的方式，為了能使卷積更有意義，使用上述CNN方式中敘述的卷積方式，獲取特征表達；特征組合層的每個向量將卷積后的每個feature map的第i維對應(yīng)的元素順序相連，如式（10）所示：

這樣將向量根據(jù)卷積的先后順序進行重新組合，保證了LSTM層輸入的時序性。

4 實驗結(jié)果分析

4.1 實驗數(shù)據(jù)

使用SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫中包含了5 959個蛋白質(zhì)的氨基酸序列數(shù)據(jù)，分別被注釋為11種亞細胞位置：葉綠體蛋白（chloroplast proteins）、細胞質(zhì)蛋白（cytoplasmic proteins）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)（exndoplasmic reticulum（ER）proteins）、胞外蛋白（extracellular proteins）、高爾基體蛋白（Golgi apparatus proteins）、溶酶體蛋白（lysosomal proteins）、線粒體蛋白（mitochondrial proteins）、核蛋白（nuclear proteins）、過氧化氫酶蛋白（peroxisomal proteins）、膜蛋白（plasma membrane proteins）、空泡蛋白（vacuolar proteins）[7]。每個亞細胞位置的蛋白質(zhì)含量如表1所示。

Table1 SWISS-PROT dataset表1 SWISS-PROT數(shù)據(jù)集

數(shù)據(jù)下載地址為http://abi.inf.uni-tuebingen.de/Services/MultiLoc2。

不同的物種所包含的蛋白質(zhì)種類也有不同：動物包含細胞質(zhì)蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)、胞外蛋白、高爾基體蛋白、溶酶體蛋白、線粒體蛋白、核蛋白、過氧化氫酶蛋白、膜蛋白這9類蛋白，其中經(jīng)過細胞膜的有除去細胞質(zhì)蛋白及胞外蛋白以外的7類；真菌也包含9類蛋白，分別是細胞質(zhì)蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)、胞外蛋白、高爾基體蛋白、線粒體蛋白、核蛋白、過氧化氫酶蛋白、膜蛋白、空泡蛋白；而植物只包含葉綠體蛋白和細胞質(zhì)蛋白兩類蛋白。因此，實驗過程中，也將數(shù)據(jù)集中的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)按物種劃分，重新組合成4組數(shù)據(jù)。

由于支持向量機等模型不能自然地處理不等長的序列，因此需要手動提取特征作為模型輸入。在以往的實驗中，大多使用GO數(shù)據(jù)進行蛋白質(zhì)特征提取，然后應(yīng)用機器學(xué)習(xí)模型進行分類。這個提取特征的過程非常復(fù)雜，耗時耗力。由于蛋白質(zhì)的性質(zhì)是由其上的氨基酸排列、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)決定的，在實驗中直接使用氨基酸序列作為輸入，既省去了手工提取特征的工作，又保留了序列信息。

4.2 性能評價

本文采用10重交叉驗證對分類器性能進行評估：將樣本分成10份，每次取出其中1份作為測試集，剩余9份作為訓(xùn)練集，于是得到10組相對應(yīng)的訓(xùn)練集和測試集。對于每組數(shù)據(jù)，使用訓(xùn)練集訓(xùn)練模型，計算模型在對應(yīng)測試集上的準(zhǔn)確率（accuracy，ACC）。準(zhǔn)確率為被正確識別樣本占總體的比例，可以表示為：

其中，tp(i)是第i類樣本被正確識別的數(shù)量(稱真陽數(shù))，N是測試樣本的數(shù)量，k是樣本的類別數(shù)。

該方法的總體準(zhǔn)確率Totalaccuracy為：

4.3 實驗結(jié)果分析

4.3.1 三種模型在不同物種數(shù)據(jù)集上的實驗結(jié)果

為了減少計算時間，該部分實驗中，將蛋白質(zhì)序列長度減少到1 000。根據(jù)分選信號進行刪減：選擇包含N端分選信號的蛋白質(zhì)片段，即保留從氨基酸序列左側(cè)開始的1 000位氨基酸，不夠1 000位的在右側(cè)尾端填充0。

對于所選用的數(shù)據(jù)集，其中包含了20種氨基酸，因此獨熱編碼后，每個氨基酸向量的長度k=20。即，使用20位的01字符串，表示該氨基酸的位編碼為1，其他位全部為0。

CNN實驗中，第一層1-D卷積核長度為3×20，個數(shù)為100個；第二層設(shè)置6種不同大小的1-D卷積核，長度分別為1、3、5、9、15、21，每種20個；全連接層節(jié)點數(shù)為400。卷積部分的激活函數(shù)全部選用ReLU激活函數(shù)。

LSTM中，設(shè)置兩種不同的氨基酸分段方法，輸入長度分別為10×20和20×20，對應(yīng)的time step為100和50，全連接層節(jié)點數(shù)N為400。同時設(shè)置一個普通的CNN作為對比，輸入層為整個氨基酸序列，節(jié)點數(shù)為1 000×20，隱藏層400個節(jié)點。

ConvLSTM中全連接節(jié)點數(shù)1 000，其余參數(shù)與上述二者相同。

其他參數(shù)設(shè)置：batch size為50，學(xué)習(xí)率為0.001，迭代30次。實驗結(jié)果如表2所示。

Table2 Accuracy of 3 models on different species datasets表2 三種模型在不同物種數(shù)據(jù)集上的準(zhǔn)確率

通過對比MultiLoc方法，可以看出CNN、LSTM的方法對蛋白質(zhì)亞細胞定位問題有一定效果，但在真菌和動物蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)集上，結(jié)果并不比傳統(tǒng)方法好；ConvLSTM的方法可以達到優(yōu)于傳統(tǒng)方法的準(zhǔn)確率，效果明顯好于單獨的CNN與LSTM。

ConvLSTM方法中，將卷積后的特征Fi重新組合為Gi作為LSTM層的輸入對結(jié)果有很大提升：使用Gi作為LSTM每一時刻的輸入能使網(wǎng)絡(luò)達到0.788 6的準(zhǔn)確率；但在相同的實驗參數(shù)下，使用Fi作為LSTM層的輸入，準(zhǔn)確率只有0.290 3，可以說該網(wǎng)絡(luò)對于分類預(yù)測沒有意義。

4.3.2 數(shù)據(jù)選擇對實驗結(jié)果的影響

上述實驗人為地將蛋白質(zhì)片段的長度規(guī)定為1 000，那么取不同長度蛋白質(zhì)片段是否對實驗結(jié)果有影響？不同位置的片段是否對分類結(jié)果有著不同的影響？

在動物蛋白質(zhì)亞細胞定位數(shù)據(jù)集上，分別取從N端及C端開始的長度分別為100、200、300、400、500的蛋白質(zhì)片段作為訓(xùn)練集，用于驗證不同長度的蛋白質(zhì)片段對分類結(jié)果的影響，實驗結(jié)果如表3所示。

可以看出序列長度為500時CNN和ConvLSTM的實驗結(jié)果為0.765 1和0.789 2，而序列長度為1 000時CNN和ConvLSTM的實驗結(jié)果分別為0.728 3、0.788 6，更長的序列并沒有帶來更好的結(jié)果，卻花費了更多的訓(xùn)練時間。

Table3 Classification accuracy of different lengths protein表3 不同長度的蛋白質(zhì)片段的分類準(zhǔn)確率

為探究不同空間位置上的蛋白質(zhì)片段對實驗結(jié)果的影響，將長度為1 000蛋白質(zhì)序列等分為5段，分別訓(xùn)練，實驗結(jié)果如表4所示。

Table4 Classification accuracy of different locations protein表4 不同空間位置蛋白質(zhì)片段的分類準(zhǔn)確率

由于并不是所有蛋白質(zhì)的長度都在1 000以上，因此部分蛋白質(zhì)在后面部分的片段可能由全0組成，不包含有用信息。但依然可以從實驗結(jié)果看出，蛋白質(zhì)兩端包含著更多與亞細胞定位有關(guān)的信息。故可以做出假設(shè)，由N、C兩端組合而成的氨基酸序列能得到更好的分類結(jié)果。

于是有了如下實驗：從N、C兩端截取不同長度的氨基酸序列片段組合在一起，使用CNN、ConvLSTM兩種模型進行亞細胞定位實驗。從表5可以看出從兩端分別取片段進行拼接得到的結(jié)果會更好，驗證了猜想。

Table5 Classification accuracy of combined amino acid sequence表5 組合氨基酸序列分類準(zhǔn)確率

4.3.3 實驗總結(jié)

通過上述實驗可以看出，從N、C兩端各取500為氨基酸組合成新的序列能獲得更好的實驗結(jié)果。對于各物種蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)集分別實驗，得到如表6所示結(jié)果。

Table6 Accuracy comparison of different protein subcellular localization表6 各物種蛋白質(zhì)亞細胞定位準(zhǔn)確率對比

在植物、真菌、動物蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)集上，使用重組后的數(shù)據(jù)在ConvLSTM模型下獲得結(jié)果最好。

5 結(jié)束語

本文使用了CNN、LSTM、ConvLSTM的方法對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)進行了亞細胞定位。與目前主流方法最大的不同是沒有使用GO數(shù)據(jù)作為輸入，直接從氨基酸序列上提取特征。這降低了面對大規(guī)模蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)集時預(yù)處理數(shù)據(jù)的難度，也更易于推廣。

三種方法在亞細胞定位問題上均比傳統(tǒng)方法有所提升，ConvLSTM方法在多組實驗中都取得了最好的結(jié)果。通過實驗可以看出，直接使用氨基酸序列預(yù)測蛋白質(zhì)亞細胞定位是可行的，且蛋白質(zhì)序列N、C兩端的序列對預(yù)測結(jié)果起著比較重要的影響。