左斌，鄒凱，車彪，喻忠斌

骨質(zhì)疏松癥是臨床上常見骨代謝疾病，調(diào)查顯示其發(fā)病率逐漸上升，患者若不及時(shí)治療可發(fā)展為骨折，影響日常生活質(zhì)量[1]。潑尼松龍屬于糖皮質(zhì)激素藥物，臨床上主要治療過(guò)敏性與自身免疫性炎性疾病，但也存在較大不良反應(yīng)，長(zhǎng)期服用會(huì)導(dǎo)致骨量丟失、增加骨的脆性，導(dǎo)致骨折[2]。有研究顯示轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶1(transforming growth factor beta activated kinase 1，TAK1)在骨、關(guān)節(jié)的發(fā)育以及骨形態(tài)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用，與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生也存在一定的相關(guān)性[3-4]。本研究選取M3T3-E1成骨細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過(guò)用RNA干擾技術(shù)沉默M3T3-E1細(xì)胞TAK1基因的表達(dá)，以觀察TAK1沉默后對(duì)潑尼松龍誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的影響，為臨床潑尼松龍用藥提供一定的參考價(jià)值，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：小鼠M3T3-E1成骨細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。(2)試劑與藥物試藥：潑尼松龍購(gòu)自浙江仙琚制藥股份有限公司；胎牛血清(FBS)、RPMI-1640培養(yǎng)基、青霉素鏈霉素雙抗溶液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶購(gòu)自武漢純度生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、堿性磷酸酶(ALP)染色劑購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；MTT、茜素紅購(gòu)自美國(guó)sigma 公司；2×SYBR Premix Ex Taq II 購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；兔抗鼠p-TAK1、TAK1、p-JNK、JNK 抗體均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二體購(gòu)自上海鈺博生物科技有限公司；RNA提取和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自上海閃晶分子生物科技有限公司；Annexin V/PI雙染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Coulter公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司；Annexin V FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。(3)儀器設(shè)備：CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自于Forma Scientific公司；低溫離心機(jī)、蛋白凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Red公司；BX31光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2017年2月—2017年7月于長(zhǎng)江航運(yùn)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.1 M3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)：M3T3-E1細(xì)胞于室溫解凍，隨后采用5 ml PBS緩沖液5 ml進(jìn)行洗滌，添加10%FBS、100 U/ml的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞融合后添加0.2%胰蛋白酶溶液進(jìn)行消化，RPMI-1640培養(yǎng)液清洗2次后，1500 r/min離心5 min，保留細(xì)胞沉淀，再置于添加10%FBS、100 U/ml的RPMI-1640培養(yǎng)液中，制備單細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞密度調(diào)整為106個(gè)/ml，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至瓶底的80%時(shí)，加入胰蛋白酶消化，用RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌3次，800 r/min離心3 min，收集細(xì)胞。按照1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，第3代細(xì)胞用于后續(xù)研究。

1.2.2 TAK1siRNA轉(zhuǎn)染M3T3-E1細(xì)胞：取第3代培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)2 d后更換新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞密度調(diào)整為4×105/ml，接種細(xì)胞培養(yǎng)板中，參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行操作(TAK1siRNA序列：F 5’-GCUCAUGCCAUGAGCUGGUGUUUAC-3’；R 5’-GUAAACACCGCUCAUGGCAUGAGC-3’)；轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組：將細(xì)胞接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分為3組，每組均設(shè)置6個(gè)重復(fù)孔，正常組(A組)：正常培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；空白轉(zhuǎn)染潑尼松龍?zhí)幚斫M(B組)：M3T3-E1細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性siRNA后添加2 mmol/L潑尼松龍繼續(xù)培養(yǎng)，TAK1 siRNA+潑尼松龍從處理組(C組)：MC3T3-E1細(xì)胞轉(zhuǎn)染TAK1 siRNA后添加2 mmol/L潑尼松龍繼續(xù)培養(yǎng)，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 鈣結(jié)節(jié)染色、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色：(1)鈣結(jié)節(jié)染色。培養(yǎng)后的細(xì)胞用PBS溶液清洗后置于70%乙醇中固定1 h，PBS溶液清洗3次后加入茜紅素染色劑染色30 min，PBS清洗后于顯微鏡下進(jìn)行觀察。(2)ALP染色。細(xì)胞培養(yǎng)后用PBS溶液清洗，消化離心后保留細(xì)胞沉淀，加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于載玻片，PBS溶液沖洗玻片后進(jìn)入冷丙醇中10 min，流水沖洗3次，每次3 min，加入ALP孵育液，37℃下孵育4 h，蒸餾水沖洗2 min，加入2%硝酸鈷溶液37℃孵育5 min，蒸餾水沖洗5 min，加入1% 硫化銨中2 min。中性樹脂封片后于100倍顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)p-TAK1、TAK1、p-JNK、JNK 蛋白表達(dá)：收集處理后的細(xì)胞液加入細(xì)胞裂解液后提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA試劑盒測(cè)定提取細(xì)胞總蛋白濃度，配制8%、12%分離膠與濃縮膠，取25 μg樣品進(jìn)行上樣，蛋白Marker 6 μl，濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為120 V，反應(yīng)結(jié)束將蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入脫脂牛奶封閉4 h，加入一抗(兔抗鼠p-TAK1、TAK1、p-JNK、JNK 單抗)4℃震蕩過(guò)夜，PBS溶液清洗后加入辣根過(guò)氧酶標(biāo)記山羊抗兔二抗，室溫反應(yīng)2 h后PBS溶液清洗3次。將蛋白凝膠用EXL發(fā)光后，在暗室中曝光，利用凝膠成像儀對(duì)Western blot產(chǎn)生的條帶進(jìn)行定量分析。

1.2.6 MTT法檢測(cè)M3T3-E1細(xì)胞增殖情況：收集培養(yǎng)后的細(xì)胞制備單細(xì)胞懸浮液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/L接種，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h，培養(yǎng)結(jié)束后加入MTT 10 μl孵育4 h，加入DMSO溶液100 μl，在570 nm處測(cè)定OD值。細(xì)胞抑制率=(實(shí)驗(yàn)組OD-空白OD)/空白OD×100%。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡變化：收集培養(yǎng)后的細(xì)胞制備單細(xì)胞懸浮液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/L接種，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量至80%時(shí)，加入0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞后加入預(yù)冷PBS溶液進(jìn)行洗滌，70%乙醇溶液中進(jìn)行固定1 h，PBS溶液清洗細(xì)胞后加入PI進(jìn)行染色重懸后置于流式細(xì)胞儀中檢測(cè)細(xì)胞周期變化。在細(xì)胞懸浮液中加入Annexin V-APC室溫下黑暗中孵育15 min，采用細(xì)胞流式儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié) 果

2.1 ALP染色、鈣結(jié)節(jié)染色比較 ALP染色顯示A組細(xì)胞胞體較大，細(xì)胞核染色呈藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)呈淡紫色；B組細(xì)胞少于A組，且細(xì)胞發(fā)生破裂；C組細(xì)胞破裂程度高于B組，染色細(xì)胞數(shù)量也少于B組。將鈣化結(jié)節(jié)所占面積比例量化顯示，與A組比較，B組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少，C組結(jié)節(jié)數(shù)量少于B組。免疫熒光檢測(cè)，B組細(xì)胞出現(xiàn)破碎，形態(tài)發(fā)生改變，C組破碎細(xì)胞明顯增加，圖1見封3。

2.2 M3T3-E1細(xì)胞中p-TAK1、TAK1、p-JNK、JNK 蛋白的表達(dá) Western Blot 顯示，A、B、C 3組間TAK1、JNK蛋白表達(dá)量并無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.188、0.056，P=0.147、0.946)；p-TAK1、p-JNK蛋白表達(dá)量A組>B組>C組(q=7.071、14.369，7.299、5.869，P均<0.01)，見圖2、表1。

注：與A組比較，aP<0.01；與B組比較，bP<0.01

2.3 沉默TAK1后潑尼松龍對(duì)M3T3-E1細(xì)胞增殖的影響 MTT檢測(cè)顯示，A、B、C 3組間各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞抑制率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.059、74.880、117.081、116.049，P均<0.01)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，其中48 h受抑制更顯著。在12 h時(shí)，A組細(xì)胞抑制率明顯高于B組和C組(q=5.093、5.821，P均<0.01)，而B組和C組之間細(xì)胞抑制率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=0.728，P>0.05)。在24 h、48 h、72 h時(shí)，細(xì)胞抑制率比較，A組>B組>C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=12.000、15.782、15.902，4.800、4.932、4.638，P均<0.01)，見圖3、表2。

表1 3組細(xì)胞p-TAK1、TAK1、p-JNK、JNK蛋白表達(dá)比較

圖3 3組M3T3-E1細(xì)胞增殖抑制情況

表2 3組M3T3-E1細(xì)胞抑制率比較

注：與A組同時(shí)點(diǎn)比較，aP<0.01；與B組同時(shí)點(diǎn)比較，bP<0.01

2.4 沉默TAK1后潑尼松龍對(duì)M3T3-E1細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，處于G2期細(xì)胞比例C組為(15.34±3.66)%，B組為(8.23±2.64)%，A組為(4.23±2.54)%，3組比較C組>B組>A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.254，P=0.000)，C組高于B組和A組(q=5.825、3.277，P均<0.05)；處于S期細(xì)胞比例，C組為(2.18±1.05)%，B組 為(3.56±1.03)%，A組為(4.73±0.87)%，3組比較C組0.05)，見圖4。

2.5 TAK1沉默后潑尼松龍對(duì)M3T3-E1細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示左下象限為正常細(xì)胞，右下象限代表晚期凋亡細(xì)胞，右上象限代表早期凋亡細(xì)胞。A組中細(xì)胞極少量出現(xiàn)凋亡(3.83±1.56)%，B組細(xì)胞少量出現(xiàn)凋亡(13.16±1.87)%，C組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多(33.64±2.37)%，3組細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=362.449，P=0.000)，細(xì)胞凋亡率C組高于B組和A組(q=25.571、11.649，P均<0.05)，見圖5。

3 討 論

潑尼松龍屬于臨床常用糖皮質(zhì)激素，具有消炎、抑菌、抑制免疫應(yīng)答反應(yīng)等作用，但長(zhǎng)期服用也會(huì)導(dǎo)致肥胖癥、類固醇糖尿病等，這些不良反應(yīng)的產(chǎn)生限制著糖皮質(zhì)激素的臨床應(yīng)用[5]。骨質(zhì)疏松以及骨折是較嚴(yán)重的不良反應(yīng)，大部分患者骨重建功能、骨修復(fù)能力降低，骨量流失，同時(shí)骨脆性增加，使發(fā)生骨折的風(fēng)險(xiǎn)增加[6]。有研究顯示糖皮質(zhì)激素量越高，發(fā)生骨折的風(fēng)險(xiǎn)越大。長(zhǎng)期服用糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致骨折原因主要包括以下幾方面：糖皮質(zhì)激素能夠簇集成骨細(xì)胞的聚集，增強(qiáng)其活性；降低骨保護(hù)素水平，提高氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡[7-8]，因此探究潑尼松龍誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的機(jī)制對(duì)于降低其不良反應(yīng)的發(fā)生十分有必要。

骨質(zhì)疏松癥的重要原因之一為成骨細(xì)胞增殖受抑制及分化程度降低[9]。已有研究發(fā)現(xiàn)，潑尼松龍能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡，降低骨量、破壞骨微結(jié)構(gòu)，增加骨質(zhì)疏松發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[10-11]。ALP是成骨細(xì)胞在分化早期形成的酶蛋白，是骨形成的標(biāo)志性蛋白，一般用來(lái)鑒定成骨細(xì)胞的生化能力[12]。Zhou等[13]發(fā)現(xiàn)，ALP活性的降低直接影響成骨細(xì)胞礦化形成過(guò)程。本研究ALP染色顯示空白轉(zhuǎn)染聯(lián)合潑尼松龍?zhí)幚砗螅?xì)胞出現(xiàn)破裂，且數(shù)量有所降低，而轉(zhuǎn)染TAK1 siRNA聯(lián)合潑尼松龍?zhí)幚砗?，?xì)胞破裂程度加重，細(xì)胞數(shù)量明顯降低，說(shuō)明潑尼松龍?zhí)幚砗竽軌蚴筂3T3-E1細(xì)胞受損，沉默TAK1后細(xì)胞受損程度加重，鈣結(jié)節(jié)染色也顯示沉默TAK1基因表達(dá)后，鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯降低，提示TAK1與M3T3-E1細(xì)胞成骨能力相關(guān)。

圖43組沉默TAK1后潑尼松龍對(duì)M3T3-E1細(xì)胞周期的影響

圖5 3組沉默TAK1后潑尼松龍對(duì)M3T3-E1細(xì)胞凋亡的影響

TAK1屬于絲裂原蛋白激酶家族成員，較多研究已證實(shí)TAK1介導(dǎo)信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡中發(fā)揮重要作用[14-15]。TAK1是MAPK和NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵因子，其單獨(dú)狀態(tài)下并不能發(fā)揮重要作用，在MAPK通路中激活后的TAK1與MEKK3/6 共同激活JNK、P38發(fā)生磷酸化，進(jìn)而激活A(yù)P-1細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄蛋白，對(duì)相應(yīng)基因蛋白進(jìn)行調(diào)控；在NF-κB信號(hào)通路中，TAK1與膜受體蛋白結(jié)合后激活NIK，使IκB發(fā)生磷酸化介導(dǎo)NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核中調(diào)控通路下游靶基因表達(dá)[15-16]。有研究已證實(shí)在軟骨細(xì)胞中MAPK和NF-κB信號(hào)通路在軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解中發(fā)揮重要作用[17]。體外研究顯示沉默TAK1表達(dá)，能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解，因此推測(cè)TAK1作為MAPK和NF-κB兩個(gè)信號(hào)通路共同的上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在骨病的發(fā)生中起著重要的調(diào)控作用[18]。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)敲除小鼠TAK1基因能夠?qū)е滦∈笤煅杉?xì)胞出現(xiàn)大量凋亡，且能夠使JNK蛋白失活[19]。國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)小鼠角質(zhì)化細(xì)胞中沉默TAK1，能夠促進(jìn)表皮細(xì)胞的凋亡[20]。本研究通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后TAK1信號(hào)通路結(jié)果顯示TAK1、JNK蛋白表達(dá)量并無(wú)明顯變化，p-TAK1、p-JNK 蛋白表達(dá)量逐漸降低，表明沉默TAK1表達(dá)后能夠抑制TAK1、JNK蛋白磷酸化，進(jìn)而抑制JNK信號(hào)通路的表達(dá)促進(jìn)潑尼松龍誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡。

本研究MTT檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染聯(lián)合潑尼松龍?zhí)幚砗笠欢〞r(shí)間內(nèi)M3T3-E1細(xì)胞增殖受到抑制，且抑制程度明顯高于陰性轉(zhuǎn)染組，且在48h抑制程度最明顯，由此可見，M3T3-E1細(xì)胞轉(zhuǎn)染TAK1 siRNA后，能夠明顯抑制M3T3-E1細(xì)胞生長(zhǎng)，且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，抑制作用升高，提示TAK1具有抑制M3T3-E1細(xì)胞增殖的作用。細(xì)胞周期阻滯能夠?yàn)榧?xì)胞修復(fù)提供額外時(shí)間，當(dāng)損傷無(wú)法完全進(jìn)行修復(fù)時(shí)，就會(huì)啟動(dòng)凋亡程序。國(guó)外學(xué)者研究顯示二氧化硅納米粒子能夠誘導(dǎo)人臍靜脈表皮細(xì)胞凋亡，并使細(xì)胞處于G2/M期，細(xì)胞凋亡率也明顯升高[20]。國(guó)外研究顯示將白血病細(xì)胞分別同步至G1、S 及 G2/M 期并進(jìn)行紫杉醇處理，結(jié)果顯示處于G2/M期細(xì)胞凋亡率高于G1、S期，凋亡數(shù)量也高于G1、S期[21]。本研究結(jié)果顯示TAK1沉默后可導(dǎo)致M3T3-E1細(xì)胞周期阻滯于G2期，影響細(xì)胞增殖，MTT結(jié)果與以上研究中阻滯于G2期的細(xì)胞加速細(xì)胞凋亡這一結(jié)論相符，上述結(jié)果提示抑制TAK1表達(dá)后能夠增強(qiáng)潑尼松龍誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，進(jìn)而在骨質(zhì)疏松發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞生理性的死亡現(xiàn)象，是維持機(jī)體細(xì)胞數(shù)量平衡、對(duì)抗細(xì)胞異常增殖以及清除有害細(xì)胞的一種重要生理機(jī)制，研究腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制對(duì)于闡明疾病發(fā)生發(fā)展具有重要意義[22]。較多研究均證實(shí)潑尼松龍類糖皮質(zhì)激素能夠抑制成骨細(xì)胞增殖、分化誘導(dǎo)其凋亡[23]。體外研究也證實(shí)糖皮質(zhì)激素能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡，但關(guān)于誘導(dǎo)凋亡機(jī)制目前還不清楚[24]。本研究顯示沉默TAK1基因表達(dá)后細(xì)胞凋亡率明顯增加，表明沉默TAK1后能夠進(jìn)一步加強(qiáng)潑尼松龍誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的作用，推測(cè)TAK1參與成骨細(xì)胞凋亡途徑，同時(shí)也說(shuō)明潑尼松龍具有誘導(dǎo)成骨作用，可提高骨生長(zhǎng)能力，促進(jìn)骨愈合。

本研究也存在一定的局限性，未進(jìn)行藥物處理濃度研究，后期需要設(shè)置不同濃度梯度組來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證，此外并未對(duì)下游凋亡通路進(jìn)行深入研究，以便探究沉默TAK1基因與成骨細(xì)胞凋亡機(jī)制的聯(lián)系。總之，沉默TAK1表達(dá)后能夠增強(qiáng)潑尼松龍誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的作用，可能與JNK信號(hào)通路相關(guān)。

利益沖突：無(wú)

作者貢獻(xiàn)聲明

左斌、喻忠斌：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；鄒凱：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；車彪：實(shí)施研究過(guò)程，資料搜集整理，論文修改