王道靜，呂為萍，李建友，厲吉霞

維生素D缺乏性佝僂病(vitamin D deficient rickets)是由于嬰兒體內(nèi)維生素D不足，造成鈣、磷代謝紊亂、骨鹽沉積量減少、骨形成障礙，形成一種以骨骼病變?yōu)樘卣鞯娜砺誀I(yíng)養(yǎng)性疾病[1]，甚至造成成人后骨質(zhì)疏松的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn),即使在陽(yáng)光充足的地域，佝僂病的發(fā)病率也比較高，且給予患兒補(bǔ)充維生素D之后的效果也不盡相同，說(shuō)明佝僂病的發(fā)生不僅與環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)因素有關(guān)，還與基因遺傳因素有關(guān)[2]。維生素D受體(vitamin D receptor,VDR)作為核內(nèi)生物大分子，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著極其重要的作用，尤其是維持鈣磷代謝等[3]。近年來(lái)，VDR基因被認(rèn)為是遺傳調(diào)控骨和鈣代謝的候選基因[4]。研究表明，VDR等位基因通過(guò)影響信使RNA的表達(dá)，進(jìn)而引起其受體蛋白在數(shù)量或功能上的差異，進(jìn)一步地引起對(duì)鈣磷代謝調(diào)節(jié)出現(xiàn)異常，最終影響機(jī)體腸道中對(duì)鈣磷的吸收，使骨骼中的鈣磷沉積發(fā)生改變，從而影響骨密度(BMD)[5]。因此本研究采用病例對(duì)照研究方法，選取山東省煙臺(tái)地區(qū)的嬰幼兒作為研究對(duì)象，分析VDR基因 BsmI和FokI位點(diǎn)多態(tài)性與佝僂病、骨密度相關(guān)性，以期對(duì)本地區(qū)佝僂病患兒提供輔助性病因診斷，預(yù)測(cè)維生素D治療效果，指導(dǎo)臨床維生素D個(gè)體化用量。進(jìn)而降低佝僂病患兒低骨密度對(duì)骨骼造成的不可逆性的改變，避免成人期骨質(zhì)疏松的發(fā)生，報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 選取2017年1—12月于煙臺(tái)市煙臺(tái)山醫(yī)院兒科就診的佝僂病患兒作為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)兒童保健學(xué)組制定的“維生素D缺乏及維生素D缺乏性佝僂病防治建議”診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(2)臨床表現(xiàn)為枕禿、肋軟骨溝、雞胸。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)長(zhǎng)期服用激素類(lèi)藥物；(2)伴隨先天性疾?。?3)早產(chǎn)兒；(4)伴隨遺傳性疾病及肝腎功能障礙的患兒。最終納入符合要求的患兒50例作為研究組，男30例，女20例，年齡4～12(7.89±1.23)個(gè)月。另選擇同期在醫(yī)院體檢的健康嬰兒50例作為健康對(duì)照組，男29例，女21例，年齡4～12(7.92±1.21)個(gè)月。2組嬰兒均不存在影響維生素D吸收的胃腸道、內(nèi)分泌、肝腎疾病等。2組嬰兒性別和年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入選嬰兒的監(jiān)護(hù)人均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 觀察指標(biāo)與方法

1.2.1 VDR基因BsmI和FokI位點(diǎn)多態(tài)性分析：采用口腔拭子采集嬰兒口腔上皮細(xì)胞，然后采用DNA試劑盒進(jìn)行提取，并采用紫外分光光度計(jì)測(cè)量純度和含量，PCR引物采用Primer Premier 6.23 DEMO軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，由上海吉瑪生物有限公司代為合成。BsmI：F.3'-CCCTCACTGCCCTTAGCTC-5',R.3'-CCTCCAAAATCAATCAGGTAAAC-5'；FokI：F.3'-GCTGAGCTCCCTGGTGGT-5'，R.3'-AGCATTGAAGTGAAAGCCAGT-5'。反應(yīng)條件：總體系為50 μl，95℃預(yù)變性3 min，之后94℃變形30 s、55℃退火35 s、72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)后，再72℃延伸5 min。1%瓊脂糖電泳，嗅化乙啶染色，然后采用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，采用3730XL基因測(cè)序儀(美國(guó)ABI公司生產(chǎn))完成基因分型。

1.2.2 骨密度檢測(cè)：采用BMD-1000A超聲波骨密度儀(上海名元實(shí)業(yè)有限公司)檢測(cè)左脛骨中段骨密度，然后通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)自動(dòng)計(jì)算骨密度Z值，骨密度檢測(cè)由2位具有5年以上工作經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師完成。

1.2.3 生化指標(biāo)檢測(cè)：常規(guī)禁食8 h，采集肘靜脈血1.5 ml，離心5 min，收集血清，一部分采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清鈣和磷；另一部分采用酶聯(lián)免疫試劑盒(基爾頓生物科技有限公司)檢測(cè)25-(OH)D3水平，采用全血干化學(xué)法檢測(cè)骨堿性磷酸酶(bone alkaline phosphatase,B-ALP)，試劑盒購(gòu)自安徽高山藥業(yè)有限公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)分析。采用卡方檢驗(yàn)判斷各位點(diǎn)基因型頻率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡；計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)或率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；符合正態(tài)分布計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；不同基因型的骨密度、血鈣、血磷以及25-(OH)D3采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；Logistic單因素回歸分析基因位點(diǎn)與佝僂病發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組嬰兒血鈣、血磷、骨密度、B-ALP及25-(OH)D3水平比較 研究組患兒血鈣、骨密度以及25-(OH)D3明顯低于健康對(duì)照組，而血磷和B-ALP明顯高于健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示BsmI位點(diǎn)(χ2=0.714，P>0.05)和FokI位點(diǎn)(χ2=0.693，P>0.05)，均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，說(shuō)明選取的對(duì)象具有代表性。

2.3 2組嬰兒VDR基因BsmI和FokI位點(diǎn)基因多態(tài)性分布比較 研究組和健康對(duì)照組在FokI位點(diǎn)上的基因型ff、Ff及FF分布上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在BsmI位點(diǎn)上基因型BB和Bb+bb分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.4 2組嬰兒VDR基因BsmI和FokI位點(diǎn)基因多態(tài)性與佝僂病風(fēng)險(xiǎn)性的關(guān)系 校正性別和年齡后，結(jié)果顯示FokI位點(diǎn)攜帶FF基因型個(gè)體的佝僂病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是攜帶Ff+ff基因型個(gè)體的3.918倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=3.918，95%CI1.174～8.918，P=0.045)，而B(niǎo)smI位點(diǎn)基因型BB與bb+Bb個(gè)體相比，佝僂病發(fā)病差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=1.034，95%CI0.437～1.562，P=0.782)。

2.5 2組嬰兒VDR基因FokI位點(diǎn)不同基因型血鈣、血磷、骨密度、B-ALP及25-(OH)D3比較 2組骨密度和25-(OH)D3在不同基因型間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而不同基因型間血鈣、血磷以及B-ALP間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示FF基因型個(gè)體骨密度和25-(OH)D3水平均明顯低于攜帶Ff和ff基因型個(gè)體(P<0.05)，見(jiàn)表3。

3 討 論

據(jù)報(bào)道，中國(guó)北方地區(qū)佝僂病的流行率為40%左右[7]。人體大部分骨礦含量的累積發(fā)生在嬰兒及青少年時(shí)期，至30歲左右達(dá)到骨量峰值(peak bone mass，PBM)。PBM代表個(gè)體一生中所能達(dá)到的最大BMD值，PBM的高低與原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥發(fā)生密切相關(guān)[8]。嬰幼兒作為佝僂病的高發(fā)群體，雖不會(huì)給患兒生命安全造成威脅，但會(huì)引起患兒抵抗力下降，致使其容易發(fā)生腹瀉、貧血等疾病，因此正確識(shí)別和診斷佝僂病至關(guān)重要[9]。B-ALP作為骨合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，由成骨細(xì)胞合成分泌，如果小兒體內(nèi)缺乏維生素D，骨鈣化不足，成骨細(xì)胞就會(huì)活躍，B-ALP活性就會(huì)升高[10]。本研究結(jié)果顯示佝僂病患兒血鈣、骨密度以及25-(OH)D3明顯低于健康對(duì)照組，而血磷和B-ALP明顯高于健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示血鈣、骨密度、25-(OH)D3、血磷和B-ALP均可作為診斷佝僂病的生化指標(biāo)。

表1 2組嬰兒血鈣、血磷、骨密度、B-ALP及25-(OH)D3水平比較

表2 2組嬰兒VDR基因BsmI和FokI位點(diǎn)基因多態(tài)性分布比較 (例)

表3 2組嬰兒VDR基因FokI位點(diǎn)不同基因型血鈣、磷、骨密度、B-ALP以及25-(OH)D3比較

注：組內(nèi)與ff基因型比較，aP<0.05；組內(nèi)與Ff基因型比較，bP<0.05

嬰兒時(shí)期的PBM與性別、鈣吸收、運(yùn)動(dòng)、體質(zhì)以及遺傳等諸多因素有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道稱(chēng)即使在陽(yáng)光充足的地域，佝僂病的發(fā)病率也比較高，且給予患兒補(bǔ)充維生素D之后的效果也不盡相同，說(shuō)明佝僂病的發(fā)生不僅與環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)因素有關(guān)，還與基因遺傳因素有關(guān)[11]。維生素D與骨代謝有著非常密切的關(guān)系。人體內(nèi)維生素D主要活性形式是25-(OH)D3，它通過(guò)對(duì)腸、腎、骨等靶器官的作用發(fā)揮其抗佝僂病的生理功能[12]。維生素D受體(vitamin D receptor,VDR)作為核內(nèi)生物大分子，屬于一種配體依賴(lài)的核轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)與其他激素如甲狀旁腺激素共同維持鈣、磷的動(dòng)態(tài)平衡，調(diào)節(jié)骨骼代謝[13]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)維生素D受體基因是調(diào)控骨和鈣代謝的候選基因[14]。本研究結(jié)果顯示煙臺(tái)地區(qū)嬰幼兒VDR基因FokI位點(diǎn)基因多態(tài)性和佝僂病風(fēng)險(xiǎn)性相關(guān)，攜帶FF基因型個(gè)體的佝僂病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是攜帶Ff+ff基因型個(gè)體的3.918倍，說(shuō)明FokI位點(diǎn)FF基因更容易發(fā)生佝僂病。

與骨代謝相關(guān)的VDR基因FokI位點(diǎn)在VDR基因5'端第二個(gè)外顯子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，當(dāng)由ATG突變?yōu)锳CG時(shí)，原本由從第一位起始密碼子ATG轉(zhuǎn)錄(f型VDR基因)，轉(zhuǎn)變成從下游存在ATG開(kāi)始轉(zhuǎn)錄(F型VDR基因)[5]。因此，F(xiàn)位點(diǎn)的VDR所表達(dá)出來(lái)的蛋白質(zhì)長(zhǎng)度要短于f位點(diǎn)，因此其親和力、穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)運(yùn)活力要比f(wàn)位點(diǎn)高，所以F位點(diǎn)的VDR所表達(dá)出來(lái)的蛋白質(zhì)能夠增加腸道對(duì)鈣的吸收，從而增加BMD。FokI位點(diǎn)基因多態(tài)性可能主要是通過(guò)影響鈣和維生素D的攝入，從而引起佝僂病的發(fā)生[16]。另外本研究還對(duì)比了佝僂病嬰兒和健康嬰兒不同基因型個(gè)體血鈣、血磷、骨密度、B-ALP以及25-(OH)D3的差異，結(jié)果顯示FokI位點(diǎn)FF基因型個(gè)體骨密度和25-(OH)D3水平均明顯低于攜帶Ff和ff基因型個(gè)體(P<0.05)，說(shuō)明FokI位點(diǎn)基因多態(tài)會(huì)影響到骨代謝，從而引起佝僂病發(fā)生。而對(duì)于BsmI位點(diǎn)多態(tài)性，本研究尚未發(fā)現(xiàn)其與佝僂病風(fēng)險(xiǎn)性相關(guān)，研究結(jié)果與銀川地區(qū)嬰兒BsmI位點(diǎn)多態(tài)性分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義一致[17]?？赡苁且?yàn)锽smI位點(diǎn)在VDR內(nèi)含子中，因此并不改變VDR蛋白的序列。

綜上所述，煙臺(tái)嬰幼兒FokI位點(diǎn)基因多態(tài)性和骨密度、25-(OH)D3水平密切相關(guān)，F(xiàn)F基因型可能是佝僂病發(fā)生的遺傳危險(xiǎn)因素，提示佝僂病發(fā)生不僅與維生素D缺乏和紫外照射不足有關(guān)，還與基因異常突變有關(guān)，通過(guò)對(duì)嬰兒VDR基因檢測(cè)，從遺傳角度進(jìn)行評(píng)估，明確個(gè)體對(duì)維生素D需求的差異，從而采取個(gè)性化干預(yù)方案，有利于針對(duì)性地指導(dǎo)嬰兒對(duì)維生素D和鈣的攝入，從而降低佝僂病發(fā)生率。

利益沖突：無(wú)

作者貢獻(xiàn)聲明

王道靜、呂為萍：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫(xiě),提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核;李建友、厲吉霞：實(shí)施研究過(guò)程，資料搜集整理