李萌思雨，胡曉文，徐業(yè)秋，胡曉琳，張春雪，逄曙光,

(1 濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南250013；2 山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院)

2型糖尿病(T2DM)主要表現(xiàn)為糖脂代謝紊亂，膽汁酸(BA)作為糖脂代謝的重要信號(hào)分子，其主要通過(guò)BA受體(FXR)介導(dǎo)的多種信號(hào)通路發(fā)揮重要的生理作用[1]。BA既是肝臟膽固醇分解代謝的主要途徑，又能促進(jìn)腸道膳食脂肪的吸收。BA激活FXR后，可抑制甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白的表達(dá)，進(jìn)而改變脂類代謝相關(guān)基因的表達(dá)；能夠誘導(dǎo)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)脂肪酸氧化[2]；還能夠降低磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶的表達(dá)，從而抑制糖異生[3]。膽固醇通過(guò)經(jīng)典途徑和替代途徑合成BA。經(jīng)典途徑是BA合成的主要途徑，合成大約等量的膽酸(CA)和脫氧膽酸(CDCA)；膽固醇7α羥化酶(CYP7A1)是經(jīng)典途徑的限速酶，而膽固醇12α羥化酶(CYP8B1)可以催化CDCA向CA轉(zhuǎn)化[4]。最近研究表明，V-Maf肌肉腱膜纖維肉瘤癌基因同源物G(MAFG)是FXR的靶標(biāo)，是BA合成和代謝的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄抑制因子[5]。研究顯示MAFG降低肝臟中CYP8B1的轉(zhuǎn)錄水平[5，6]。由此可見，F(xiàn)XR-MAFG-CYP8B1信號(hào)通路在BA代謝中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠的BA池增大，而胰島素治療能夠降低BA池的大小、抑制CYP7A1、CYP8B1活性，并改變BA的組成[7]。二甲雙胍可以降糖降脂，該作用是否通過(guò)影響B(tài)A代謝發(fā)揮作用尚未可知。2017年12月～2018年10月，我們觀察了二甲雙胍對(duì)T2DM大鼠FXR-MAFG-CYP8B1信號(hào)通路的影響，從膽汁代謝通路探討其治療糖尿病的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 60只雄性Wistar大鼠，8周齡，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；將動(dòng)物于(23±2)℃、12 h光照/黑暗循環(huán)環(huán)境下常規(guī)喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)操作符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)要求。FXR抗體購(gòu)自Biorbyp公司；CYP8B1、MAFG抗體購(gòu)自Abcam公司；PVDF膜(0.2 mm)、ECL檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Millipore公司；鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自Sigma公司；鹽酸二甲雙胍購(gòu)自中美上海施貴寶制藥有限公司；CA ELISA試劑盒購(gòu)自上海通蔚生物有限公司；TRIzol、RNA抽屜試劑、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。血糖儀、Cobas8000自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自羅氏公司；胰島素ELISA試劑盒購(gòu)自Mercodia公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與造模干預(yù) 將60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組各20只。對(duì)照組喂食標(biāo)準(zhǔn)飲食(6%脂肪，64%碳水化合物,23%蛋白質(zhì))，模型組、干擾組喂食高脂飲食(25%脂肪，48%碳水化合物，20%蛋白質(zhì))。喂養(yǎng)10周后，模型組、干擾組腹腔注射小劑量STZ 30 mg/kg誘導(dǎo)T2DM模型，對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水。STZ注射后72 h，模型組、干擾組用血糖儀測(cè)量空腹血糖(FBG)≥11.1 mmol/L，成功建立T2DM模型。干預(yù)組給予二甲雙胍500 mg/(kg·d)灌胃，其余兩組給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)干預(yù)12周。

1.2.2 一般情況觀察及標(biāo)本收集 每天早晨觀察大鼠精神狀態(tài)，記錄并計(jì)算32周齡時(shí)與入組時(shí)食物攝入量、水?dāng)z入量和體質(zhì)量變化。在32周齡時(shí)禁食過(guò)夜，眶后靜脈叢取血，分離血清后-80 ℃冰箱保存；脫頸處死后剖腹取出肝組織，置于液氮中冷凍。

1.2.3 血清糖脂代謝指標(biāo)及BA檢測(cè) 取靜脈血清，使用Cobas8000自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)總膽固醇(TC)、總甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、BA，用血糖儀測(cè)FBG，用ELISA試劑盒檢測(cè)空腹胰島素(FINS)。胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=[FBG(mmol/L)×FINS(μU/mL)]/22.5。

1.2.4 肝組織FXR、MAFG、CYP8B1 mRNA檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。使用TRIzol試劑提取肝臟總RNA，在紫外分光光度計(jì)下讀取A260/A280值。用TaKaRa兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照PCR反應(yīng)液配比說(shuō)明書配成20 μL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s；PCR反應(yīng)95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)；解離95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。反應(yīng)中所用引物序列:FXR正向5′-AAGTGACCTCCACGACCAAG-3′，反向5′-TGGCATTCTCTGTTTGCTGT-3′；MAFG正向5′-CCCAATAAAGGAAACAAGGCC-3′，反向5′-GCACCGACATGGTCACCA-3′；CYP8B1正向5′-TCCATATGTCCCGGCAGGTTCTTT-3′，反向5′-TGTCAGGGTCCACCAGTTCAAAGT-3′；β-actin正向5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA -3′，反向5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 肝組織FXR、MAFG、CYP8B1蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。制備大鼠肝臟勻漿，4 ℃下以10 000 r/min離心10 min；收集上清液，BCA測(cè)定總蛋白質(zhì)濃度。加入4×上樣緩沖液(蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)上樣緩沖液比例為4∶1)，將混合物在100 ℃水中煮沸8 min。將等量蛋白質(zhì)加載至12% SDS-PAGE上，再轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜在PBST/5%脫脂奶粉中封閉，4 ℃下與針對(duì)FXR、MAFG、CYP8B1、β-actin的一抗孵育過(guò)夜。用磷酸鹽緩沖液和0.05% Tween-20(PBST)洗滌后，將與HRP綴合的二抗于室溫下孵育4 min。去除二抗后，使用ECL試劑盒洗滌印跡，在自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)上成像。以Image J圖像處理軟件計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參光密度比值，以此表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 肝組織CA檢測(cè) 采用ELISA法。稱取1 g肝組織樣品，加入9 g PBS(pH 7.2～7.4)并攪勻。以2 000～3 000 r/min離心20 min，收集上清液。將一部分包裝進(jìn)行測(cè)試，其余部分冷凍備用。用ELISA試劑盒檢測(cè)CA，按說(shuō)明書操作。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀況比較 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)照組一般狀態(tài)好，飲食、飲水、體質(zhì)量無(wú)明顯改變；模型組消瘦，毛色雜亂，精神萎靡，飲食、飲水量增加；干擾組給予二甲雙胍干預(yù)后癥狀較模型組好轉(zhuǎn)。與對(duì)照組比較，模型組和干擾組體質(zhì)量減輕，飲食和飲水增加(P均<0.05)；與模型組比較，干擾組二甲雙胍治療后體質(zhì)量、飲食和飲水均減少(P均<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、飲食、飲水變化

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

2.2 各組血清糖脂代謝指標(biāo)及BA水平比較 與對(duì)照組比較，模型組FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、BA水平均升高而HDL-C水平降低(P均<0.05)。與模型組比較，干擾組FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、BA水平均降低而HDL-C水平升高(P均<0.05)。見表2。

表2 各組血清糖脂代謝指標(biāo)及BA水平比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

2.3 各組肝組織FXR、MAFG、CYP8B1 mRNA及蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，模型組肝組織FXR、MAFG表達(dá)下調(diào)而CYP8B1表達(dá)上調(diào)(P均<0.05)；與模型組比較，干擾組肝組織FXR、MAFG表達(dá)上調(diào)而CYP8B1表達(dá)下調(diào)(P均<0.05)。見表3。

2.4 各組肝組織CA比較 對(duì)照組、模型組、干擾組肝組織CA分別為(442.58±86.18)、(1 208.90±127.21)、(620.98±35.48)ng/mL，模型組>干擾組>對(duì)照組(P均<0.05)。

表3 各組肝組織FXR、MAFG、CYP8B1表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

3 討論

T2DM是與血脂異常和胰島素抵抗相關(guān)的炎性疾病。在本研究中，我們通過(guò)給予高脂飲食喂養(yǎng)和小劑量STZ注射建立了T2DM大鼠模型。據(jù)報(bào)道，高脂飲食喂養(yǎng)引起胰島素抵抗，STZ對(duì)胰島β細(xì)胞有毒性作用。當(dāng)注射大劑量STZ時(shí)，可破壞大多數(shù)胰島β細(xì)胞以誘導(dǎo)T1DM模型；而注射小劑量STZ可用于制備T2DM模型，表現(xiàn)出血糖升高及胰島素抵抗[8]。本研究結(jié)果表明，干預(yù)組T2DM大鼠經(jīng)二甲雙胍治療后體質(zhì)量減輕且飲食、飲水量均減少，同時(shí)FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C水平均降低而HDL-C水平升高，臨床癥狀、糖脂代謝、胰島素抵抗均得到改善；此外，干預(yù)組經(jīng)二甲雙胍干預(yù)后BA也明顯下降。因此，我們推測(cè)二甲雙胍改善糖脂代謝的作用可能與影響B(tài)A代謝有關(guān)。

在肝內(nèi)由膽固醇直接合成的BA稱為初級(jí)BA，初級(jí)BA進(jìn)入腸道由腸道菌群催化合成次級(jí)BA[9]。肝臟產(chǎn)生的BA進(jìn)入腸道后，95%會(huì)被腸道重吸收，這些重吸收的BA隨門靜脈再次進(jìn)入肝臟，肝臟再將其與新合成的BA一起進(jìn)入腸道，即“肝腸循環(huán)”。經(jīng)典途徑是BA合成的主要途徑，該過(guò)程主要依靠CYP7A1來(lái)發(fā)揮作用。生理濃度的BA結(jié)合并激活FXR，F(xiàn)XR通過(guò)誘導(dǎo)小異二聚體伴侶(SHP)下調(diào)CYP7A1的表達(dá)[5]，從而負(fù)反饋抑制BA合成。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組肝組織中FXR表達(dá)減少，與相關(guān)研究結(jié)果一致[10]。T2DM大鼠FXR表達(dá)降低的具體機(jī)制尚不清楚，可能與糖尿病大鼠BA池的改變有關(guān)。CDCA是最有效的FXR激活配體，糖尿病大鼠BA庫(kù)中CA和脫氧膽酸(DCA)增加而CDCA減少[11]，對(duì)FXR激活作用降低。MAFG作為FXR激活介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄阻遏物[6]，當(dāng)糖尿病大鼠FXR表達(dá)降低時(shí)，MAFG表達(dá)也降低，同時(shí)MAFG抑制其下游基因的表達(dá)。在BA合成途徑中，CYP8B1負(fù)責(zé)CA合成[7]。研究發(fā)現(xiàn)，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠中，CYP8B1表達(dá)升高[12]。這是由于MAFG在糖尿病大鼠中表達(dá)降低，減弱了對(duì)CYP8B1的抑制作用使得CYP8B1表達(dá)增加，致使糖尿病大鼠CA升高。與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，即模型組CA濃度高于對(duì)照組。

本研究結(jié)果顯示，二甲雙胍治療后干擾組大鼠FXR和MAFG表達(dá)增加而CYP8B1表達(dá)降低。這表明二甲雙胍可以通過(guò)活化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，使得FXR磷酸化[13]，受FXR激活的MAFG表達(dá)增加，對(duì)CYP8B1的抑制作用增強(qiáng)，因而CYP8B1表達(dá)降低。丙酮酸激酶(PEPCK)和葡萄糖6磷酸酶(G-6-PASE)是參與糖異生的限速酶。研究表明，F(xiàn)XR抑制PEPCK和G-6-PASE的活性，阻礙糖異生過(guò)程，從而改善葡萄糖耐量[14]。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP-1c)是調(diào)節(jié)膽固醇代謝和甘油三酯合成的關(guān)鍵酶。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR誘導(dǎo)SHP的表達(dá)后，與肝X受體(LXR)結(jié)合后抑制SREBP-1c的表達(dá)，進(jìn)而降低膽固醇和甘油三酯合成[15]。此外，MAFG作為FXR的下游因子發(fā)揮其共調(diào)節(jié)作用，參與FXR的降低糖脂作用以調(diào)節(jié)體內(nèi)糖脂平衡[5，6]。

BA合成途徑的直接產(chǎn)物主要是CA和CDCA，它們的相對(duì)量之間的平衡決定了BA池的總體疏水性[16]。CA和CDCA之間平衡的主要調(diào)節(jié)劑是CYP8B1，CYP8B1確定了12α-羥基化BA和非12α-羥基化BA的相對(duì)量。CA是肝組織中含量最豐富的12α-羥基化BA。Kim等[14]研究表明，人胰島素抵抗與血清12α-羥基化BA水平升高有關(guān)。Kaur等[7]發(fā)現(xiàn)，CA的缺乏導(dǎo)致CYP8B1缺陷小鼠的胰島素抵抗改善。本研究結(jié)果顯示，干預(yù)組肝組織中CA表達(dá)減少，HOMA-IR降低，胰島素抵抗明顯改善。這是由于二甲雙胍抑制CYP8B1表達(dá)后降低CA表達(dá)，促進(jìn)血清12α-羥基化BA表達(dá)，從而改善了胰島素敏感性[18]；同時(shí)，CA的減少也降低了膽汁中膽汁鹽的疏水性，降低膽固醇的溶解度[19]，從而減少膽固醇的吸收。因此，我們認(rèn)為二甲雙胍可以通過(guò)調(diào)節(jié)FXR-MAFG-CYP8B1信號(hào)通路來(lái)干擾BA代謝，從而改善糖脂代謝和胰島素敏感性，這對(duì)進(jìn)一步探索二甲雙胍的新藥物靶點(diǎn)具有重要意義。