劉軒，徐翔，王靜，趙靜，李鴻斌

(1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，呼和浩特 010050；2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院)

骨性關(guān)節(jié)炎(OA)是一種常見的退行性疾病，常伴隨明顯的疼痛和功能障礙[1]。OA的發(fā)病率和致殘率日益升高，目前60歲以上人群發(fā)病率達50%，75歲以上人群達80%[2]。因此，早期診斷和治療OA，可以避免關(guān)節(jié)的完全損害，對預(yù)防或減緩疾病的進展具有重要作用。膝骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)的臨床特征為關(guān)節(jié)軟骨損傷、骨質(zhì)增生形成肥厚性骨變、軟骨下骨重塑和滑膜炎癥，炎癥在其發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，OA雖然不是一種炎癥性疾病，但是KOA發(fā)病過程中卻有炎癥發(fā)生，促進滑膜炎癥和關(guān)節(jié)疼痛[3]。目前，KOA的診斷主要依靠X線、關(guān)節(jié)超聲等，但均不能作為早期診斷的有效手段。C反應(yīng)蛋白(CRP)水平的輕度升高是慢性KOA X線進展的預(yù)測因素，CRP水平與KOA發(fā)生率之間存在顯著相關(guān)性[4]。血沉(ESR)的低度升高也被納入KOA患者的預(yù)測因素之一，來預(yù)測疾病的發(fā)展[5]。葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(GPI)由T細胞分泌，除具有酶活性外，還具有細胞因子及生長因子樣活性，存在于各種細胞的細胞外液及細胞質(zhì)，尤其是關(guān)節(jié)腔內(nèi)，特別是軟骨表面[6]。GPI和抗GPI抗體可能激活補體通路，誘發(fā)關(guān)節(jié)炎[7]?？雇蛔冃凸习彼岵ㄐ蔚鞍?MCV)抗體為瓜氨酸相關(guān)自身抗體，存在于RA患者的滑液、滑膜細胞和血清中[8]。GPI和抗MCV抗體現(xiàn)已成為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的診斷指標(biāo)，但在抗環(huán)狀瓜氨酸肽抗體(診斷RA的關(guān)鍵指標(biāo))陰性的情況下，二者仍有低水平的升高，考慮可能與OA有關(guān)。本研究觀察了KOA患者血清GPI、抗MCV抗體水平變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的KOA患者100例。納入標(biāo)準：①符合2010年歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(EULAR)與1995年美國風(fēng)濕病協(xié)會(ACR)制訂的KOA分類診斷標(biāo)準，KOA患者早期和中晚期的分級標(biāo)準根據(jù)MRI Recht分級標(biāo)準[9]和關(guān)節(jié)鏡下Outerbridge分級標(biāo)準[10]，其中Ⅰ～Ⅱ級為早期組，Ⅲ～Ⅳ級為中晚期組；②年齡≥50歲；③患者知情同意，并經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準。排除標(biāo)準：①伴有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或其他自身免疫性疾?。虎谟邢リP(guān)節(jié)外傷史或手術(shù)史；③膝關(guān)節(jié)腫瘤、結(jié)核；④嚴重的肝腎功能不全；⑤甲狀腺功能疾??；⑥近期接受過藥物治療者。所有患者按照病情進展分為兩組，早期組50例，男12例、女38例，年齡49～80(60.35±8.36)歲；中晚期組50例，男18例、女32例，年齡50～84(66.89±7.73)歲。另選取50例健康體檢者作為對照組，男13例、女37例，年齡50～79(57±8)歲。各組一般資料無統(tǒng)計學(xué)差異，具有可比性。

1.2 血清GPI、抗MCV抗體、ESR、CRP檢測 就診次日早晨采集入選對象空腹靜脈血各3～5 mL，以3 000 r/min速度離心10 min，分離血清，將離心后的血清標(biāo)本儲存于-80 ℃冰箱待測。①GPI：采用ELISA法檢測，操作嚴格按說明書進行。a.將標(biāo)準品和血清標(biāo)本各100 μL加到相應(yīng)微孔中置37 ℃孵育1 h，洗板5次后拍干；b.加酶100 μL置37 ℃孵育1 h，洗板5次后拍干；c.加入底物顯色液100 μL置室溫(15～30 ℃)避光孵育15 min；d.最后加終止液50 μL終止反應(yīng)；e.用芬蘭Thermo全自動酶標(biāo)儀，在主波長490 nm、副波長630 nm，以空白孔校零，測定各孔吸光度值，求出待測樣品GPI水平。本實驗GPI水平≥4 mg/L，按4 mg/L計算。②抗MCV抗體：采用ELISA法檢測，嚴格按說明書進行。a.將標(biāo)準品、質(zhì)控品和按1∶100比例稀釋后的患者血清各100 μL加入到微孔中，室溫(20～28 ℃)溫育30 min；b.吸出微孔板內(nèi)組分，用300 μL洗液沖洗，沖洗3次，吸取100 μL酶結(jié)合物加到每個微孔中，在室溫下溫育15 min；c.吸出微孔板內(nèi)組分，用300 μL洗液沖洗，沖洗3次，吸取100 μL底物溶液加到每個微孔中，在室溫下溫育15 min；d.在每個微孔中加入100 μL終止液，在室溫下溫育5 min；e.讀取450 nm處的光密度值并計算結(jié)果，根據(jù)繪制的標(biāo)準曲線得出待測樣本水平。③ESR：用散射比濁法檢測，ESR>20 mm/h為異常。④CRP：采用散射比濁法檢測，以CRP>5 mg/L為異常，CRP<0.5 mg/L按0.5 mg/L計算。

2 結(jié)果

2.1 各組血清GPI、抗MCV抗體、ESR、CRP水平比較 結(jié)果見表1。

表1 各組血清GPI、抗MCV抗體、ESR、CRP水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與中晚期組比較，△P<0.05。

2.2 KOA患者血清GPI、抗MCV抗體水平與ESR、CRP水平的相關(guān)性 KOA患者血清GPI水平與CRP水平呈正相關(guān)(r=0.27，P<0.05)，與ESR水平無相關(guān)性(r=0.06，P>0.05)；抗MCV抗體水平與CRP、ESR水平均無相關(guān)性(r分別為0.03、0.14，P均>0.05)。

3 討論

KOA病變關(guān)鍵是以軟組織退行性病變和病變關(guān)節(jié)周圍組織增生為主要病理變化的一組臨床綜合征，其實質(zhì)是一種慢性的，逐漸發(fā)生的退行性病變，常常累及1個及多個關(guān)節(jié)，病變關(guān)節(jié)常常表現(xiàn)為局部關(guān)節(jié)軟組織發(fā)生退行性病變，以關(guān)節(jié)邊緣或關(guān)節(jié)軟骨下的骨組織發(fā)生剝脫，消失等為病理特征，因此又被稱為退行性關(guān)節(jié)炎[11,12]。OA常累及活動較多的負重關(guān)節(jié)，尤其是膝關(guān)節(jié)。KOA的臨床癥狀主要是疼痛，早期呈間歇性疼痛，活動后加重，晚期則出現(xiàn)持續(xù)性疼痛，關(guān)節(jié)僵硬、腫大和變形，嚴重影響日常的工作和生活，最終只能進行手術(shù)治療。KOA的確切病因及發(fā)病機制尚不明確，現(xiàn)階段診斷OA主要依靠臨床癥狀、X線和核磁共振檢查。KOA疾病的過程是一個連續(xù)的統(tǒng)一體，從軟骨細胞的早期變化到周圍基質(zhì)的變化，到出現(xiàn)臨床癥狀和影像學(xué)檢測到的關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的變化，說明疾病進展是一個漫長、積累的過程，血清學(xué)標(biāo)志物在疾病初期就已出現(xiàn)，早期發(fā)現(xiàn)OA的血清學(xué)標(biāo)志物，對OA的早期診斷、早期治療至關(guān)重要。KOA屬于一種低度炎癥性關(guān)節(jié)病，炎癥反應(yīng)及固有免疫反應(yīng)等生物學(xué)因素在OA 進程中也發(fā)揮了重要作用[3]。最近的MRI和超聲成像也證實滑膜炎與KOA的癥狀和疾病進展有關(guān)，大量的試驗驗證了炎癥在OA的發(fā)病中與機械刺激等因素具有同樣的作用[13,14]。有研究[15]表明CRP、ESR與OA病情變化及預(yù)后具有一定的相關(guān)性。

CRP屬于一種急性時相反應(yīng)蛋白，對于各種炎癥反應(yīng)均有較高的敏感性，當(dāng)CRP水平升高時往往提示慢性免疫系統(tǒng)被激活[16]，盡管CRP不是KOA疾病的特異性標(biāo)記，但它可以指示OA疾病中存在外周循環(huán)的炎癥狀態(tài)，在早期KOA會顯著增加，提示KOA病情會隨時間推移而進展，是炎癥進展的預(yù)測因素。而ESR是炎癥的一種非特異性的指標(biāo)，在很多炎癥性疾病中都可以檢測到，在KOA患者中，也會有不同程度的升高。

除炎癥指標(biāo)可以作為KOA的預(yù)測因素外，還有其他一些生物學(xué)標(biāo)志物可以先于OA影像學(xué)出現(xiàn)，如血清軟骨寡聚基質(zhì)蛋白、透明質(zhì)酸、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-3等[17]。有研究[18,19]顯示，在腫瘤細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)GPI可以調(diào)節(jié)MMP-3的表達，而MMP-3在KOA患者的關(guān)節(jié)液中高表達。軟骨細胞對葡萄糖代謝途徑具有選擇性，通常情況下軟骨細胞主要通過糖酵解來滿足自身的能量需求，OA患者關(guān)節(jié)軟骨細胞糖酵解水平顯著提高[20]。GPI是糖酵解途徑的第二酶，由558個氨基酸組成，在糖酵解和糖異生過程中可以催化葡萄-6-磷酸和果糖6-磷酸的相互轉(zhuǎn)化。GPI在K/BxN關(guān)節(jié)炎小鼠中被確認為致病性自身抗原，重組人GPI免疫DBA/1小鼠可誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎[21]。GPI可被抗瓜氨酸化蛋白抗體(ACPA)識別，在RA患者的關(guān)節(jié)液和血清中ACPA呈高表達。ACPA還可識別其他多種瓜氨酸蛋白，如波形蛋白、α烯醇化酶、纖維蛋白原、纖維連接蛋白等[21]。波形蛋白是一種骨架蛋白，是抗MCV抗體的抗原，波形蛋白在凋亡細胞內(nèi)分解成核周的聚集物，因得不到及時清除而導(dǎo)致瓜氨酸波形蛋白的持續(xù)存在，進而促進了MCV抗體的產(chǎn)生[22]，GPI是否通過調(diào)節(jié)MMP-3而在OA中表達，波形蛋白在OA中的水平變化是否可以用來診斷KOA或者評估疾病嚴重程度，以及它們與炎癥預(yù)測因素ESR、CRP是否相關(guān)，是否通過參與炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)KOA的發(fā)生，可以通過本實驗的結(jié)果得到進一步闡釋。本研究顯示，與對照組比較，早期組和中晚期組血清GPI、抗MCV抗體、ESR、CRP水平升高；與早組比較，中晚期組血清CRP水平升高。KOA患者血清GPI水平與CRP水平呈正相關(guān)，與ESR水平無相關(guān)性；抗MCV抗體水平與CRP、ESR水平無相關(guān)性。

總之，KOA患者血清中GPI、抗MCV抗體水平升高，檢測兩指標(biāo)有助于KOA的診斷及病情評估。