陳 欣，劉美歐，戴珊珊，侯瑞蘭，王 琦，李月秋，楊 磊

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吐溫-80增敏同步熒光法檢測蔬菜中二甲菌核利殘留

陳 欣1，劉美歐1，戴珊珊2，侯瑞蘭1，王 琦1，李月秋3，楊 磊4

（1. 河北大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，河北 保定 071000；2. 河北大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000；3. 河北大學(xué) 醫(yī)學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)中心，河北 保定 071000；4. 保定疾病預(yù)防控制中心 理化科，河北 保定 071000）

基于表面活性劑可增強(qiáng)二甲菌核利熒光強(qiáng)度，建立同步熒光分光光度法測定蔬菜中二甲菌核利殘留量。對波長差進(jìn)行了優(yōu)化；討論了溶劑種類、緩沖液的種類、用量及pH值等因素對二甲菌核利熒光強(qiáng)度的影響；應(yīng)用正交實(shí)驗(yàn)對提取劑種類、用量、超聲時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。選擇甲醇做溶劑和提取劑，質(zhì)量濃度為4.29 g?L-1吐溫-80做表面活性劑。在0.14～3.00 μg?mL-1范圍內(nèi)，二甲菌核利濃度與熒光強(qiáng)度線性關(guān)系良好，檢出限為0.105 6 mg?kg-1，回收率為82.63～99.77%，RSD為0.16～0.61%。

二甲菌核利；吐溫-80；殘留；同步熒光分光光度法

殺菌劑具有殺死病菌孢子、菌絲體或抑制其發(fā)育、生長的作用[1]。二甲菌核利（Pythium）屬于新型低毒殺菌劑，主要用于果蔬灰霉病的防治[2,3]。國標(biāo)規(guī)定黃瓜、西紅柿和韭菜中二甲菌核利最大殘留限量分別為2.00 mg?kg-1和0.20 mg?kg-1[4]。

蔬菜中二甲菌核利殘留量國標(biāo)檢測法為氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)[5]。近年來，國內(nèi)外報(bào)道的蔬菜中二甲菌核利殘留量的檢測方法主要有聯(lián)用技術(shù)[2,5-10]，高效液相色譜法（HPLC）[11]、氣相色譜法（GC）[12]、電化學(xué)法[13]、近紅外光譜法[3]、毛細(xì)管電泳法[9,10]、酶聯(lián)免疫法[14]等。這些方法存在前處理過程繁瑣，對操作人員技術(shù)要求高，易造成環(huán)境污染等問題。

熒光分析法靈敏度較紫外分光光度法高2～4個(gè)數(shù)量級[15]。同步熒光具有靈敏度高、共存組分干擾小等優(yōu)點(diǎn)。目前，國內(nèi)外鮮見增敏同步熒光法檢測蔬菜中二甲菌核利殘留量的報(bào)道。本研究將以探討應(yīng)用表面活性劑對二甲菌核利增敏為開端，應(yīng)用正交試驗(yàn)對提取劑種類、用量，超聲時(shí)間等因素進(jìn)行篩選，建立回收率高、靈敏度好的快速同步熒光法對蔬菜中二甲菌核利殘留量進(jìn)行測定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

熒光分光光度計(jì)（日本島津，RF-5301PC）；超純化水機(jī)（法國默克密理博公司Milli-Q Advantage A10）；組織搗碎勻漿機(jī)（江蘇金壇，JJ-2）；快速混勻器（常州國華電器有限公司，SK-1）；高速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠，TGL-20B）；電子天平（日本島津，AUW120D）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，RQ5200E）；氮?dú)獯蹈蓛x（中國雷爾達(dá)儀表有限公司，YQD-37A）；電熱恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司，HDM-3000B）。

80%二甲菌核利可濕性粉劑（山東海迅生物化學(xué)有限公司）；磷酸氫二鈉、檸檬酸、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、檸檬酸鈉、醋酸、醋酸鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鈉均為分析純，購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）、溴代十六烷基吡啶、吐溫-20、吐溫-80均為分析純，均購自上海麥克林生化科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 二甲菌核利標(biāo)準(zhǔn)儲備液制備

準(zhǔn)確稱取0.062 5 g 80%的二甲菌核利可濕性粉劑溶于甲醇，定容至50 mL，配成1.00 mg?mL-1二甲菌核利標(biāo)準(zhǔn)溶液，繼而稀釋成1.00 μg?mL-1，用0.45 μm微孔濾膜過濾，置于冰箱中冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品預(yù)處理

將2.00 g樣品搗碎勻漿，抽濾，得樣品溶液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，置于10 mL離心管中，加入1.00 g氯化鈉，6 mL甲醇，漩渦混勻，超聲10 min，5 000 r?min-1離心10 min，氮吹儀濃縮干燥至1 mL。向甲醇濃縮液中加入1 mL 吐溫-80溶液（10.00 g?L-1），1 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH=6），漩渦混勻，室溫反應(yīng)10 min。

1.2.3 樣品測定

以1 cm石英比色皿作吸收池，起始激發(fā)波長（λx）為283 nm，發(fā)射波長（λm）為343 nm，Δλ為60 nm，激發(fā)、發(fā)射狹縫寬度為3 nm條件下同步掃描測定1.2.2節(jié)中制備的樣品溶液的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光測定條件選擇

2.1.1 溶劑選擇

分別配制10.00 μg?mL-1的二甲菌核利水溶液、5.00 μg?mL-1的二甲菌核利甲醇溶液以及50.00 μg?mL-1的二甲菌核利丙酮溶液，于283 nm激發(fā)波長處測定熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)測得熒光強(qiáng)度分別為416、590、157，表明5.00 μg?mL-1二甲菌核利甲醇溶液熒光強(qiáng)度最大。由于二甲菌核利甲醇溶液中二甲菌核利濃度最小，而熒光強(qiáng)度最大，因此選擇甲醇為二甲菌核利的溶劑。

2.1.2 同步熒光分光光度法條件選擇

圖1 熒光與同步熒光光譜圖

固定其他條件，設(shè)定起始激發(fā)和發(fā)射波長，在波長差Δλ分別為30、40、50、60、70、80、90 nm的條件下測定二甲菌核利熒光強(qiáng)度。由測定結(jié)果可知，隨著波長差Δλ增加，熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先增加后減弱趨勢，在Δλ=60 nm時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值，因此選擇Δλ=60 nm。熒光掃描和同步熒光掃描光譜圖（見圖1），由圖可知，同步熒光掃描可以使二甲菌核利溶液熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，使峰形變窄，可減少共存物質(zhì)干擾，提高靈敏度。

2.1.3 pH選擇

在其他條件一定情況下，討論了不同pH值磷酸氫二鈉?檸檬酸緩沖溶液（pH=2.20、3.40、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.40、10.83）對質(zhì)量濃度為5.00 μg?mL-1二甲菌核利甲醇溶液熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明：在pH=6.00時(shí)，二甲菌核利甲醇溶液熒光強(qiáng)度最高（見圖2），故選擇pH=6.00的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液。

圖2 pH和緩沖液用量對二甲菌核利熒光強(qiáng)度影響

2.1.4 緩沖液種類選擇

在其他條件一定的情況下，討論不同種類緩沖溶液（pH=6.00）即磷酸氫二鈉-檸檬酸，磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀對5.00 μg?mL-1二甲菌核利甲醇溶液熒光強(qiáng)度影響，實(shí)驗(yàn)測得熒光強(qiáng)度分別為632、556、598。結(jié)果表明：加入磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液時(shí)二甲菌核利熒光強(qiáng)度最高，故選擇磷酸氫二鈉-檸檬酸為緩沖溶液。

2.1.5 緩沖溶液用量選擇

其他條件一定，討論了加入不同量（0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL）磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH=6.00）對二甲菌核利甲醇溶液熒光強(qiáng)度影響。結(jié)果表明：隨著緩沖溶液加入量增加，二甲菌核利熒光強(qiáng)度也隨之增加（見圖2），因此緩沖溶液用量增高可以使增敏效果增加，故實(shí)驗(yàn)選擇添加3.00 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液（pH=6.00）。

2.1.6 表面活性劑選擇

選擇合適的表面活性劑及其濃度（≥臨界膠束濃度）時(shí)，可以將被測分子包裹于膠束內(nèi)，使其避免因碰撞而發(fā)生無輻射去激，從而可提高熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度。因此，其他實(shí)驗(yàn)條件一定的情況下，考察了不同種類表面活性劑（溴代十六烷基吡啶、吐溫-80、吐溫-20、SDS）對熒光強(qiáng)度影響。結(jié)果表明：吐溫-80使熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，SDS、溴代十六烷基吡啶等使熒光強(qiáng)度減弱（見圖3）。故實(shí)驗(yàn)選擇加入吐溫-80。

圖3 表面活性劑種類及吐溫-80質(zhì)量濃度對熒光強(qiáng)度影響

2.1.7 吐溫-80用量選擇

表面活性劑對熒光強(qiáng)度的影響與表面活性劑濃度有關(guān)。實(shí)驗(yàn)中考察了加入不同質(zhì)量濃度的吐溫-80（0.00、0.71、1.43、2.14、2.86、3.57、4.29、5.00、6.67 g?L-1）對二甲菌核利增敏效果影響。隨著吐溫-80濃度增加，二甲菌核利甲醇溶液熒光強(qiáng)度先逐漸增強(qiáng)后下降，在加入質(zhì)量濃度為4.29 g?L-1的吐溫-80時(shí)二甲菌核利熒光強(qiáng)度達(dá)到峰值（見圖3）。故實(shí)驗(yàn)選擇加入濃度為4.29 g?L-1的吐溫-80溶液。

2.1.8 待測液溫度選擇

按照實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)備好待測溶液，分別處置為不同測定溫度（0、20、25、40、50、60 ℃），考察溶液溫度對二甲菌核利熒光強(qiáng)度影響。結(jié)果表明：溫度對二甲菌核利熒光強(qiáng)度影響較小，故選擇室溫條件下測定。

2.1.9 樣品前處理正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

果蔬樣品中二甲菌核利回收率主要受提取劑種類、提取劑用量，超聲時(shí)間等影響。故實(shí)驗(yàn)中，以提取劑種類（A）、提取劑用量（B）、超聲時(shí)間（C）為影響因素，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)（見表1）。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

本研究需要考慮因素A與B、C之間的交互作用，即A×B、A×C；選擇L27(313)交互作用表安排實(shí)驗(yàn)方案。使用SPSS19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明提取劑用量和超聲時(shí)間對提高回收率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p﹤0.05），見表2。

表2 方差分析表

綜合分析，最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方案為用甲醇作提取劑，用量為6 mL，超聲10 min。

2.2 方法學(xué)建立

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

取標(biāo)準(zhǔn)儲備液各一定體積，向其中分別加入1 mL吐溫-80溶液（質(zhì)量濃度10.00 g?L-1），1 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH=6），漩渦混勻，分別定容至一定體積，配制成標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，并按照1.2.3中實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測定。以二甲菌核利濃度為橫坐標(biāo)（），熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)（），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：在0.14～3.00 μg?mL-1范圍內(nèi)，二甲菌核利濃度與其熒光強(qiáng)度呈良好線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：

=27.629 0-4.916 6（相關(guān)系數(shù)r=0.992 0）。

根據(jù)IUPAC(3δ)[16]規(guī)定，向11份空白溶液中加入1 mL吐溫-80溶液（10.00 g?L-1），1 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH=6），漩渦混勻，由=3×δ/（為檢出限，為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，為11份空白溶液熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差），求出檢出限為0.105 6 mg?kg-1。

2.2.2 穩(wěn)定性

測定靜置不同時(shí)間（0、0.5、1、2、4、8、12、24 h）二甲菌核利熒光強(qiáng)度變化，經(jīng)計(jì)算RSD=0.60%，表明二甲菌核利在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3 回收率及精密度

表3 平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）

取市售西紅柿勻漿9份，每份2.00 g，等分為三組，每組各加入1 mL濃度為0.50 μg?mL-1、1.50 μg?mL-1、2.50 μg?mL-1二甲菌核利甲醇溶液，按照1.2.2節(jié)的方法處理，按照1.2.3的實(shí)驗(yàn)條件測定，將測得的結(jié)果按下述公式計(jì)算回收率：

式中，2代表加標(biāo)樣品測試值（μg?mL-1），2代表加標(biāo)樣品體積（mL），1代表未加標(biāo)樣品測試值（μg?mL-1），1代表未加標(biāo)樣品體積（mL），0代表加入標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（μg?mL-1），0代表加入標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）。

平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。

2.3 樣品測定

按照1.2.2樣品處理方法，按照1.2.3樣品測定方法對保定市菜市場出售的西紅柿、黃瓜、韭菜樣品分別進(jìn)行了檢測，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次。僅黃瓜中測得二甲菌核利殘留量為2.10 μg/g（RSD=3.00%），其余蔬菜、水果中均未檢測到二甲菌核利殘留。

3 結(jié)論

本研究探索建立了用吐溫-80增敏，蔬菜水果中二甲菌核利殘留量同步熒光檢測方法，該方法選擇性好、精密度高、穩(wěn)定性好、儀器設(shè)備簡單；檢出限為0.105 6 mg?kg-1，能滿足國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的水果蔬菜允許的最大殘留限量[4]。此方法的缺點(diǎn)是回收率相對較低，可進(jìn)一步探索建立液液微萃取、離子液體等先進(jìn)的樣品前處理方法以進(jìn)一步提高回收率。

本研究建立的方法可以作為蔬菜水果中農(nóng)藥殘留檢測新方法，可推廣于有關(guān)部門進(jìn)行日常跟蹤檢測。

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Determination of Pythium Residues in Vegetables by Tween-80 Sensitized Synchronous Fluorescence

CHEN Xin1, LIU Mei-ou1, DAI Shan-shan2, HOU Rui-lan1, WANG Qi1, LI Yue-qiu3, YANG Lei4

(1. School of Public Health, Hebei University, Baoding 071000, China; 2. College of Medicine, Hebei University, Baoding 071000, China; 3. Center of Medical Comprehensive Experiment, Hebei University, Baoding 071000, China; 4. Science and Technology Section, Baoding Center for Disease Control and Prevention, Baoding 071000, China)

Synchronous fluorescence method for determining pythium residues in vegetables based on surfactants sensitization was developed. The wavelength difference (Δλ) was selected. The effect of the solvent type, the type and amount of buffer, pH on the fluorescence intensity was discussed. The type and dosage of the extractant, the ultrasonic time were optimized by orthogonal test. Methanol was used as solvent and extractant. Tween-80 (4.29 g?L-1) was used as the surfactant. In the range of 0.14 to 3.00 μg?mL-1, the linear relationship between the concentration of pythium and its fluorescence intensity was good, and the detection limit was 0.105 6 mg?kg-1. The recovery were 82.63 to 99.77%, RSD was 0.16 to 0.61%. The new method can be used to determine pythium residues in vegetables.

pythium; tween-80; residues; synchronous fluorescence

s-3

A

1009-9115(2019)03-0067-05

10.3969/j.issn.1009-9115.2019.03.019

河北省科技計(jì)劃自籌經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（15275511）

2019-02-18

2019-03-05

陳欣（1997-），女，滿族，河北唐山人，本科生，研究方向?yàn)闄z驗(yàn)與檢疫。

（責(zé)任編輯、校對：琚行松）