鄧元元， 胡 超， 陳思宇， 朱文娟， 王 剛， 蘭時樂

（湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術學院，湖南長沙410128）

啤酒糟含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)以及鈣、磷、鐵、銅、錳礦物質(zhì)元素 （肖連東等，2008；Mussato等，2005）。近年來，在用啤酒糟代替部分棉籽殼、麥麩栽培食用菌（葉春苗，2016、2015）及發(fā)酵啤酒糟替代豆粕進行水產(chǎn)（李小霞等，2016）、肉鵝（姬向波等，2015）、肉鴨（王彥茹等，2016）、育肥奶公牛養(yǎng)殖（周永平，2016）等方面開展了大量的研究，并取得了一定的研究成果，但由于啤酒糟中纖維素含量較高，且容易腐敗，限制了其在飼料工業(yè)中應用。

低聚木糖是一種具有獨特生理活性的功能性低聚糖，能促進動物腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳酸菌大量增殖（Zhao等，2015），抑制腐敗菌的生長，增強機體免疫力 （范程瑞等，2017；王曉華，2015）。同時，低聚木糖還具有清除體內(nèi)自由基、抗衰老的功效 （Bian 等，2013；Ayyappan Appukuttan Aachary等，2011）。據(jù)測定，啤酒糟中半纖維素含量為 21.01% ～31.5%（劉甜甜，2013；鄧啟華等，2008），在適宜的工藝條件下可降解成低聚木糖。因此，本試驗以啤酒糟為原料，利用響應面分析法優(yōu)化啤酒糟酶解制備含低聚木糖啤酒糟飼料添加劑的試驗參數(shù)，以期為啤酒糟的深度開發(fā)提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 啤酒糟 將購于英博雪津湖南（白沙）啤酒有限公司新鮮啤酒糟置于80℃恒溫條件下烘干至恒重，粉碎至60～80目。

1.1.2 主要試劑 木二糖標準品（純度98%），木三糖標準品（純度98%），木四糖標準品（純度97%），木五糖標準品（純度96%），購于青島博智匯力生物科技有限公司；碳酸鈉、雙氧水、氫氧化鈣、氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇（AR，國藥集團化學試劑有限公司）；乙腈（色譜純，美國，Merck 公司）；高純氮（純度99%，長沙高科技氣體有限公司）；纖維素酶、木聚糖酶（湖南利爾康生物股份有限公司。其中纖維素酶10000 U/g，木聚糖酶 100000 U/g）。

1.1.3 主要儀器 色譜柱：COSMOSIL Sugar-D糖分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，北京英萊克科技發(fā)展有限公司）；高效液相色譜儀（Agilent 1260，美國，WATERS）；蒸發(fā)光散色檢測器（ELSD，美國，WATERS）；電子分析天平（KF3102，浙江凱豐集團有限公司）；高速冷凍離心機（CR21G，無錫凱派克斯科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 啤酒糟的預處理 稱取100 g粉碎的啤酒糟，用自來水調(diào)節(jié)固液比為1∶5，按質(zhì)量比加入0.7%的碳酸鈉和0.1%的雙氧水，在115℃條件下處理30 min。

1.2.2 酶解條件篩選 采用單因素試驗研究酶種類、酶添加量、酶解初始pH、酶解溫度、酶解時間等對低聚木糖產(chǎn)量的影響。

1.2.3 啤酒糟酶解工藝條件響應面優(yōu)化 在單因素試驗結果基礎上，采用Design-Expert.8.0.6b軟件，根據(jù)BOX-Benhnken試驗設計原理（王永菲等，2005），選取起始pH、木聚糖酶量、纖維素酶量、酶解溫度、酶解時間等條件對低聚木糖含量影響較大的因素，進行響應面設計。響應面設計見表1。

表1 響應面因素水平編碼表

1.2.4 低聚木糖產(chǎn)量的測定 稱取適量的經(jīng)酶解且80℃干燥后的啤酒糟，加入10倍體積的蒸餾水，30℃，180 r/min條件下振蕩提取 30 min，4000 r/min、4℃條件下離心15 min，收集上清液并定容至100 mL，采用HPLC-ELSD法測定啤酒糟中低聚木糖的含量。HLPC-ELSD法測定條件為：色譜柱：COSMOSIL Sugar-D糖分析柱 （250mm×4.6mm，5 μm）； 流動相為乙腈-水（69：31，V/V）；流速：0.9 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣體積：3 μL；蒸發(fā)溫度：78℃；載氣流速：1.6L/min；載氣壓力：0.5MP。

表2 纖維素酶添加量對低聚木糖產(chǎn)量的影響

表3 木聚糖酶添加量對低聚木糖產(chǎn)量的影響

表4 混合酶對低聚木糖產(chǎn)量的影響

2 結果與分析

2.1 纖維素酶添加量對低聚木糖產(chǎn)量的影響按底物質(zhì)量分數(shù)分別在經(jīng)預處理的啤酒糟中加入100、150、200、250、300、350 U/g 的纖維素酶，攪拌均勻，45℃、pH 5.0條件下酶解2.5 h，測定啤酒糟中低聚木糖的含量。結果見表2。

從表2結果可知，隨著纖維素酶添加量的增加，低聚木糖產(chǎn)量也隨之增加。當纖維素酶添加量為300 U/g時，低聚木糖產(chǎn)量最高，為18.8721 mg/g。但纖維素酶添加量繼續(xù)增加，低聚木糖產(chǎn)量反而下降。由于纖維素酶添加量為250 U/g和300 U/g時，低聚木糖產(chǎn)量差異不顯著，故選擇纖維素酶的添加量為250 U/g進行后續(xù)試驗。

2.2 木聚糖酶添加量對低聚木糖產(chǎn)量的影響在經(jīng)過預處理的啤酒糟中按底物質(zhì)量分數(shù)分別加入 100、150、200、250、300、350 U/g 的木聚糖酶，攪拌均勻，50℃、pH 4.8條件下酶解3 h，測定啤酒糟中低聚木糖的含量。結果見表3。

從表3結果可知，當木聚糖酶添加量為200 U/g時，低聚木糖產(chǎn)量達19.1448 mg/g。隨著木聚糖酶添加量的增加，低聚木糖產(chǎn)量下降。

2.3 混合酶對低聚木糖產(chǎn)量的影響 在經(jīng)過預處理的啤酒糟中分別加入由纖維素酶和木聚糖酶組成的混合酶，攪拌均勻，50℃、pH 5.0條件下酶解3 h，測定啤酒糟中低聚木糖的含量。結果見表4。

表4結果表明，不同木聚糖酶和纖維素酶混合酶處理啤酒糟，低聚木糖產(chǎn)量差異較大。 當纖維素酶和木聚糖酶以250 U/g和200 U/g組成混合酶時，低聚木糖產(chǎn)量最高，為21.1002 mg/g。

2.4 起始pH對低聚木糖產(chǎn)量的影響 在混合酶試驗結果基礎上，分別調(diào)節(jié)預處理后的啤酒糟pH 分別為 3.5、4.0、4.5、 5.0、5.5、6.0，50 ℃條件下酶解3 h，測定啤酒糟中低聚木糖的含量。結果見表5。

由表5結果可知，在一定范圍內(nèi)，隨著預處理后的啤酒糟初始pH的升高，低聚木糖的產(chǎn)量也隨之增加。當初始pH為5.5時，低聚木糖產(chǎn)量達20.8721 mg/g。

2.5 酶解溫度對低聚木糖產(chǎn)量的影響 在上述試驗結果基礎上，分別將酶解溫度設置為35、40、45、50、55、60℃，酶解3 h后測定啤酒糟中低聚木糖的含量。結果見表6。

溫度是影響酶解效果的主要因素之一。酶促反應速度在一定溫度范圍內(nèi)隨溫度的增高而加快，但當酶解溫度超過最適酶解溫度，酶促反應速率下降。從表6可以看出，當酶解溫度為50℃時，低聚木糖產(chǎn)量最大，為22.4692 mg/g。

2.6 酶解時間對低聚木糖產(chǎn)量的影響 在上述試驗結果基礎上，將預處理后的啤酒糟分別酶解1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h 后測定啤酒糟中低聚木糖的含量。結果見表7。

由表7結果可知，隨著酶解時間的延長，低聚木糖產(chǎn)量也隨之提高。當酶解時間為3 h時，低聚木糖產(chǎn)量達到22.5649 mg/g；但酶解時間延長，低聚木糖產(chǎn)量下降。原因可能為隨著酶解時間的延長，低聚木糖進一步被水解成木糖。

2.7 酶解工藝條件響應面優(yōu)化

2.7.1 響應面試驗設計及結果分析 根據(jù)單因素試驗結果，選取酶解工藝中低聚木糖產(chǎn)量影響較大的5個因素，即起始pH、木聚糖酶酶量、纖維素酶酶量、酶解溫度、酶解時間，采用Design-Expert.8.0.6b軟件，根據(jù)BOX-Benhnken試驗設計原理，對酶解工藝條件進行響應面優(yōu)化。試驗設計方案及結果見表8。

根據(jù)表8 BOX-Benhnken的試驗設計及結果，采用Design-Expert.8.0.6b軟件對結果進行分析，結果見表9。

由表9結果可知，pH、纖維素酶添加量、木聚糖酶添加量、酶解溫度和酶解時間均是顯著影響低聚木糖產(chǎn)量的主要因素。BC、BE、DE的P值均小于0.05，說明木聚糖酶添加量和纖維素酶添加量、木聚糖酶添加量和酶解溫度、酶解溫度和酶解時間之間的交互作用顯著。

采用Design-Expert.8.0.6b軟件對結果進行可信度分析，結果如表10。

方差分析結果表明（表9和表10），模型的F值和失擬項分別為20.78和2.25，P值＜0.0001和失擬項較高（0.1463＞0.05），說明模型與實際情況擬合度良好。

根據(jù)響應面系數(shù)的回歸分析，獲得該模型擬合方程為：Y=23.44-0.72A-0.045B-0.25C-1.26D+0.40E-0.39AB+0.48AC-0.63AD+1.11AE-1.45BC+0.66BD+0.90BE-0.35CD+0.64CE+0.72DE-1.59A2-1.73B2-2.19C2-3.17D2-2.14E2。

該回歸方程的 R2=0.9433，RAdj2=0.8979，CV/%=3.33%，SNR=17.318，說明模型可信度較高，且方程具有較高的統(tǒng)計學意義。

2.7.2 響應面分析 基于上述回歸方程，繪制起始pH，木聚糖酶酶量，纖維素酶酶量，酶解溫度，酶解時間之間交互作用的響應面曲線圖和等高線圖。結果分別見圖1～圖10。

表5 初始pH對低聚木糖產(chǎn)量的影響

表6 酶解溫度對低聚木糖產(chǎn)量的影響

表7 酶解時間對低聚木糖產(chǎn)量的影響

表8 BOX-Benhnken試驗設計及結果

表9 響應面結果方差分析

表10 二次回歸方程的方差分析

等高線的形狀可以反映出因素之間交互效應的強弱，圓形表示兩因素不顯著，而橢圓則表示較為顯著（毋銳琴等，2008）。由圖1可以看出，隨著木聚糖添加量的增加和pH提高，低聚木糖產(chǎn)量先緩慢增加后緩慢下降，且等高線呈圓形，說明木聚糖酶添加量與pH之間交互作用不顯著。當木聚糖酶添加量、酶解溫度和酶解時間處于最佳水平時，纖維素酶添加量與初始pH的交互作用見圖2。由圖2可以看出，隨著纖維素酶添加量的增加和初始pH的提高，低聚木糖產(chǎn)量先上升后下降，說明纖維素酶添加量與初始pH之間存在顯著的交互作用。當木聚糖酶添加量、纖維素酶添加量和酶解時間處于最佳水平時，起始pH與酶解溫度的交互作用見圖3。從圖3可以看出，隨著起始pH與酶解溫度的提高，低聚木糖產(chǎn)量呈先上升后下降，且酶解溫度超過51℃時，低聚木糖產(chǎn)量迅速下降，說明二者對低聚木糖產(chǎn)量有極顯著的影響。當木聚糖酶添加量、纖維素酶添加量和酶解溫度處于最佳水平時，初始pH與酶解時間的交互作用見圖4。由圖4可知，隨著初始pH的升高，低聚木糖產(chǎn)量下降明顯；而低聚木糖產(chǎn)量隨酶解時間的延長而增加，但酶解時間超過3.3 h，產(chǎn)量下降，說明二者存在較為顯著的交互作用。當初始pH、酶解溫度和酶解時間處于最佳水平時，纖維素酶添加量和木聚糖酶添加量的交互作用見圖5。由圖5可知，低聚木糖產(chǎn)量隨兩種酶添加量的增加而增加，但當纖維素酶添加量和木聚糖酶添加量分別接近350 U/g和250 U/g，低聚木糖產(chǎn)量有所下降，說明兩種酶對低聚木糖產(chǎn)量有顯著的影響。當初始pH、纖維素酶添加量和酶解時間處于最佳水平時，木聚糖酶添加量與酶解溫度的交互作用見圖6。圖6結果表明，隨著酶解溫度的升高，低聚木糖產(chǎn)量先升后降，而低聚木糖產(chǎn)量隨木聚糖酶添加量的增加先略升后略降，且等高線形狀呈橢圓，說明兩者之間的交互作用顯著。當初始pH、纖維素酶添加量和酶解溫度處于最佳水平時，木聚糖酶添加量和酶解時間的交互作用見圖7。從圖7可知，隨著木聚糖酶添加量的增加和酶解時間的延長，低聚木糖產(chǎn)量先上升后下降，說明維素酶添加量和酶解溫度存在顯著的交互作用。當初始pH、木聚糖酶添加量和酶解時間處于最佳水平時，纖維素酶添加量與酶解溫度的交互作用見圖8。由圖8可知，低聚木糖產(chǎn)量隨纖維素酶添加量增加與酶解溫度的升高先升高后下降，說明二者對低聚木糖產(chǎn)量有顯著影響，二者交互作用形成的曲面為拋物面，也說明纖維素酶添加量與酶解溫度存在交互作用。當初始pH、木聚糖酶添加量和酶解溫度處于最佳水平時，纖維素酶添加量與酶解時間的交互作用見圖9。圖9結果表明，低聚木糖產(chǎn)量隨纖維素酶添加量的增加和酶解時間的延長呈先上升后下降的趨勢，說明二者對低聚木糖產(chǎn)量有顯著影響。當初始pH、木聚糖酶添加量和纖維素酶添加量處于最佳水平時，酶解溫度和酶解時間的交互作用見圖10。由圖10可以看出，酶解溫度和酶解時間交互作用顯著。

圖1 起始pH與木聚糖酶酶量對低聚木糖含量影響的響應面圖及等高線圖

圖2 起始pH與纖維素酶酶量對低聚木糖含量影響的響應面圖及等高線圖

圖3 起始pH與酶解溫度對低聚木糖含量影響的響應面圖及等高線圖

圖4 起始pH與酶解時間對低聚木糖含量影響的響應面圖及等高線圖

圖5 木聚糖酶酶量與纖維素酶酶量對低聚木糖含量影響的響應面圖及等高線圖

圖6 木聚糖酶酶量與酶解溫度對低聚木糖含量影響的響應面圖及等高線圖

圖7 木聚糖酶酶量與酶解時間對低聚木糖含量影響的響應面圖及等高線圖

圖8 纖維素酶酶量與酶解溫度對低聚木糖含量影響的響應面圖及等高線圖

圖9 纖維素酶酶量與酶解時間對低聚木糖含量影響的響應面圖及等高線圖

圖10 酶解溫度與酶解時間對低聚木糖含量影響的響應面圖及等高線圖

由Design-Expert.8.0.5b軟件可求出回歸模型極值點，即適宜酶解條件：起始pH 5.4917，木聚糖酶添加量201.2607 U/g，纖維素酶添加量248.6930 U/g，酶解溫度48.1765℃，酶解時間3.0925 h。優(yōu)化得到低聚木糖的產(chǎn)量預測值為23.7647 mg/g。為了驗證本試驗模型預測值的準確性和可操作性，調(diào)整酶解條件為：起始pH 5.5，木聚糖酶添加量201 U/g，纖維素酶添加量248 U/g，酶解溫度48℃，酶解時間3 h。在此條件下進行3次重復試驗，低聚木糖的平均產(chǎn)量為23.8673 mg/g，與預測值接近，說明此模型能準確預測低聚木糖的產(chǎn)量。

3 結論

啤酒糟制備低聚木糖飼料添加劑的工藝為：酶解起始pH 5.5，木聚糖酶添加量201 U/g，纖維素酶添加量248 U/g，酶解溫度48℃，酶解時間3 h。通過驗證試驗，測得啤酒糟中低聚木糖的平均含量為23.8673 mg/g，與理論值相對誤差僅為0.43%，說明采用響應面分析法對利用啤酒糟制備含低聚木糖飼料添加劑酶解工藝進行優(yōu)化是有效的。