王競?cè)澹?王 洋*， 余政豪， 喬秀亭， 程鎮(zhèn)燕，崔 培， 王慶奎， 孫金輝，曹 鵬，白東清

（1.天津農(nóng)學院水產(chǎn)系，天津西青 300384；2.天津市寶坻區(qū)漁翁水產(chǎn)科技發(fā)展有限公司，天津?qū)氎?301800）

益生菌是指一類可以直接飼喂動物的有益活體或死的微生物。在水產(chǎn)動物養(yǎng)殖過程中，益生菌可作為水產(chǎn)動物飼料添加劑，或用于制備發(fā)酵飼料。目前，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應用較廣的水產(chǎn)益生菌主要包括芽孢桿菌屬 （Bacillus）、酵母菌（Saccharomyces）和光合細菌（Photorophic bacterium）。 益生菌在對蝦養(yǎng)殖中的應用非常廣泛 （朱金星等，2017），最主要的應用方式為直接添加到飼料中（Azadis等，2005）。然而，蝦類的消化道較短，飼料在體內(nèi)停留時間約2 h（李健等，1993）。因此，如果采用拌料投喂的方式添加益生菌，無法充分發(fā)揮其降解飼料大分子物質(zhì)，提高消化吸收率的作用。研究表明，直接投喂芽孢桿菌僅能使斑節(jié)對蝦的飼料干物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂肪水解率增加不到2%（於葉兵等，2007）。相比之下，復合益生菌發(fā)酵后的飼料中大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化成小分子，如氨基酸等，可提升飼料的可消化性（胡紅偉等，2017）。同時益生菌發(fā)酵可以降低飼料原料中的抗營養(yǎng)因子，提高對蝦腸道消化酶活性，還能產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，提高水產(chǎn)動物抗病性（吳東，2015）。

研究證明，多株益生菌混合發(fā)酵效果優(yōu)于單一菌株（陳樹河等，2016）。因此本研究擬篩選適用于制備對蝦發(fā)酵飼料的益生芽孢桿菌復配組合，并對組合菌株的產(chǎn)酶活性進行評價，以初步優(yōu)化發(fā)酵對蝦飼料的條件。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株 益生芽孢桿菌菌株7株，保存于天津農(nóng)學院水產(chǎn)學院，使用前以LB液體培養(yǎng)基活化至活菌數(shù) 1×109～ 3×109cfu/mL。

1.2 試驗試劑 磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、三氯乙酸、無水碳酸鈉、L-酪氨酸、鹽酸、三水乙酸鈉、冰乙酸、羧甲基纖維素鈉、3，5-二硝基水楊酸、四水酒石酸鉀鈉、苯酚、無水亞硫酸鈉、無水葡萄糖、檸檬酸、蒸餾水、檸檬酸鈉、麥芽糖、酒石酸鉀鈉、干酪素等，均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要試驗儀器 W-CJ-2FO潔凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DK-98-11A電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；SMLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋：日本Sanyo公司；FA2104電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；UV-5500紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；SHP-250型微生物生化培養(yǎng)箱：上海三發(fā)科學儀器有限公司；YZB-GER 1841-2014高速冷凍離心機：奧默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.4 LB培養(yǎng)基 按照張士偉等（2013）的方法制備LB種子培養(yǎng)基（固體培養(yǎng)基需加入細菌瓊脂粉1.5% ～2.0%），pH 7.0，121℃滅菌20 min后使用。

1.5 益生芽孢桿菌復配組合的篩選 根據(jù)表1，各菌株按照OD600值1∶1∶1比例組合，接種于LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h后測定上清液酶活性。

表1 菌株組合情況表

蛋白酶活性的定量測定采用福林酚法 （中國國家標準委員會，2009），淀粉酶活性的定量測定采用3，5-二硝基水楊酸法 （張龍翔等，1982），纖維素酶活性的定量測定采用DNS法 （楊海峰等，2014）。使用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA）。以三種酶活性的綜合響應值作為評價指標，選取最優(yōu)組合。計算公式為：

響應值=蛋白酶活性×50%+（淀粉酶活性+纖維素酶活性）×25%。

1.6 優(yōu)良芽孢桿菌復配組合發(fā)酵飼料 采用單因素優(yōu)化法，使用自封袋模擬發(fā)酵容器，分別控制加水量（0.8、1.0、1.3、1.5 mL/g 飼料）、接種量（0.1%、0.5%、1%、5%），置于 37℃恒溫箱發(fā)酵 24 h，對比飼料顆粒黏合狀態(tài)，以確定發(fā)酵飼料的最適注水量；采用平板法進行活菌計數(shù)，以確定最適接種量；在最佳注水量和接種量條件下，分別發(fā)酵對蝦開口餌料（南美白對蝦配合飼料-開口料，唐山三發(fā)普林飼料有限公司）和對蝦成蝦飼料（通威南美白對蝦配合飼料-成蝦料，通威股份有限公司），發(fā)酵24 h后進行活菌計數(shù)，以確定適用的飼料種類；選用適宜飼料種類，向自封袋內(nèi)注入無菌空氣（10、20、30、40、50 mL/g 飼料）、適宜水量和接種量，發(fā)酵24 h后進行活菌計數(shù)以確定最適通氣量。

2 結(jié)果與分析

2.1 組合菌酶活性定量測定和響應值結(jié)果 表2可知，在所測的9組芽孢桿菌組合菌中，組合8-Z所產(chǎn)蛋白酶活性明顯高于其他組合，達到（28.58±0.34）U/mL。復配菌株應用于對蝦飼料或者制備發(fā)酵飼料過程中，產(chǎn)生的消化酶可以與水產(chǎn)動物內(nèi)源酶相互補充，從而提高消化率（陽艷林等，2017；仉明軍等，2013）。許多研究發(fā)現(xiàn)，為水產(chǎn)動物補充外源性消化酶，能夠提高水產(chǎn)動物的飼料利用率。張娟娟等（2012）試驗證明，在虹鱒魚的低魚粉飼料中添加蛋白酶，可提高其胃腸蛋白酶活性，進而改善生長性能。與其他報道相比，本研究中所測得的各菌株蛋白酶活性并不高，這可能與培養(yǎng)時間短（陳營等，2004）以及培養(yǎng)基成分的差異有關(guān)。因此，本試驗各菌株在LB培養(yǎng)基中僅培養(yǎng)12 h后測得的酶活性，并不能完全代表菌株在發(fā)酵飼料或者宿主腸道內(nèi)的產(chǎn)酶能力。

組合3-Z所產(chǎn)的淀粉酶活性較其他復配組合高，達到（5.8±0.34）U/mL。 其淀粉酶活性顯著高于其他報道，如經(jīng)紫外誘變育種得到的高產(chǎn)淀粉酶菌株，淀粉酶活性只達到2.264 U/mL（馬穎輝等，2011）；游龍等（2018）測定的野生型芽孢桿菌，胞外淀粉酶活性最高為3.0 U/mL。表明本試驗所篩選的芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶活性較高，更具研究和實際應用價值。有試驗證明，芽孢桿菌的淀粉酶活性會隨溫度變化而發(fā)生改變，在0～40℃其淀粉酶活性隨溫度升高而上升，之后隨溫度升高而下降（高永生等，2011）。

表2 組合菌株蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶酶活性定量和響應值結(jié)果

菌株組合3-Z所產(chǎn)纖維素酶活性最高，達到（34.53±7.41）U/mL。 此結(jié)果高于屈二軍等（2008）經(jīng)過紫外誘變得到的高酶活枯草芽孢桿菌以及江國忠 （2010）所篩選的野生型高酶活枯草芽孢桿菌。在飼料中添加纖維素酶，可改善養(yǎng)殖動物對粗纖維的利用率（張新武等，2002）。纖維素酶可以刺激內(nèi)源酶分泌，還可以與其他內(nèi)源酶共同作用，從而促進動物的消化和吸收（王仁華等，2011）。

2.2 優(yōu)選芽孢桿菌形態(tài) 7株菌均為革蘭氏陽性桿菌，大小和長短有菌株特異性，無特殊排列方式。

2.3 16S rDNA測序結(jié)果 測定上述優(yōu)選菌株的16S rDNA序列，通過與數(shù)據(jù)庫其他菌株的序列信息進行比對，得出鑒定結(jié)論：菌株8-D、4-D、9-D、3-D、7-D、5-D均為枯草芽孢桿菌；菌株2-D為地衣芽孢桿菌；菌株6-D為地衣形芽孢桿菌；菌株1-D為解淀粉芽孢桿菌。使用MEGA3.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，圖1為菌株2-D的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.4 飼料發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1 不同加水量發(fā)酵飼料形態(tài)觀察 通過觀察，加入0.8 mL蒸餾水的飼料（1 g）經(jīng)過24 h發(fā)酵后，飼料顆粒呈現(xiàn)較干燥狀態(tài)，故不能充分發(fā)酵；而加水量1.3 mL和1.5 mL的兩組則呈現(xiàn)較為潮濕、易碎狀態(tài)，會影響發(fā)酵后配合飼料在水中的穩(wěn)定性；加水量1.0 mL的飼料發(fā)酵24 h后呈現(xiàn)較為理想的狀態(tài)。

圖1 菌株2-D系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4.2 不同接種量發(fā)酵飼料的活菌數(shù) 由表3可知，接種芽孢桿菌組合8-Z的接種量為5%的飼料（成蝦飼料和開口料）在發(fā)酵24 h后，所得的活菌數(shù)最高，其中成蝦飼料活菌數(shù)為9.47×108cfu/g，開口料活菌數(shù)為4.33×108cfu/g。其次為接種量0.50%的飼料（成蝦飼料和開口料），其中成蝦飼料的活菌計數(shù)結(jié)果為4.23×108cfu/g，開口料的活菌計數(shù)結(jié)果為3.67×108cfu/g。出于對飼料成本和活菌數(shù)的綜合考慮，選擇接種量為0.50%作為芽孢桿菌組合菌8-Z的最適接種量。

表3 不同接種量發(fā)酵24 h后蝦開口餌料和成蝦飼料活菌數(shù)cfu/g

2.4.3 不同通氣量發(fā)酵飼料的活菌數(shù) 如表4所示，通入空氣量為20 mL的飼料發(fā)酵后活菌數(shù)最高，為 6.48×108cfu/g。

表4 不同通氣量發(fā)酵24 h后成蝦飼料的活菌數(shù)cfu/g

3 結(jié)論

適用于制備對蝦發(fā)酵飼料的益生芽孢桿菌組合為8-Z（包含解淀粉芽孢桿菌1-D，枯草芽孢桿菌3-D和枯草芽孢桿菌9-D）。制備對蝦發(fā)酵飼料的適宜參數(shù)為：加水量1 mL/g，接種量0.50%（0.5×107～ 1.5×107cfu/g），充氣量 20 mL/g，發(fā)酵24 h成蝦飼料的活菌數(shù)為6.48×108cfu/g。