陳則華，肖凌云，劉宏，朱艷紅，萬蕓

(1.華中科技大學無限極現(xiàn)代制劑聯(lián)合實驗室，武漢 430075；2.國家納米藥物工程技術(shù)研究中心，武漢 430075)

甲狀腺功能減退癥(甲減)是臨床上常見的內(nèi)分泌疾病，是由各種原因引起甲狀腺激素合成、分泌及生物效應不足引起的一種全身代謝減低綜合征[1]。甲減發(fā)生原因復雜，與遺傳、環(huán)境等諸多因素有關(guān)，其中甲狀腺炎癥(包括免疫反應、病毒感染等)是重要的誘因之一[2]。研究顯示，細胞因子可調(diào)節(jié)甲狀腺細胞的增殖，參與甲狀腺疾病的免疫紊亂，影響甲狀腺細胞的多種功能活動[3]。

目前有多種動物造模方法模擬甲減癥狀，常用硫脲類藥物包括丙硫氧嘧啶(propylthiouracil，PTU)和甲巰咪唑(methimazole)誘發(fā)，該法尤其適用于甲狀腺激素作用原理、藥物藥理作用等研究[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)葡萄籽油含有豐富的維生素和礦物質(zhì)，具有延緩衰老，抵抗體內(nèi)自由基，抗氧化，預防高血壓、動脈硬化及心臟病，營養(yǎng)腦神經(jīng)細胞，調(diào)節(jié)植物神經(jīng)等功效[6-7]。筆者在本研究通過甲巰咪唑灌胃的方法建立甲減小鼠模型，采用葡萄籽油進行干預，初步探討葡萄籽油對甲減小鼠的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康4～6周齡無特定病原體(SPF)級BALB/c雌性小鼠24只，體質(zhì)量14～16 g，購于湖北省實驗動物研究中心。動物合格證號：42000600020792，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2015-0018。

1.2藥品與試劑 甲巰咪唑片(德國默克公司生產(chǎn)，批號：212940)；葡萄籽油(中國農(nóng)科院武漢油料所提取，葡萄籽經(jīng)篩選、脫殼、粉碎后用壓榨法提取)；聚山梨酯80(Biosharp 公司，批號：0442)；固體石蠟(德國Leica儀器有限公司，批號：1506173)；蘇木精染色液、伊紅染色液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)；多因子酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)芯片(武漢研錦生物科技有限公司)。

1.3儀器與設備 生物組織智能脫水機(型號：HD-300，湖北慧達儀器有限公司)；生物組織自動包埋機(型號：HD-310，湖北慧達儀器有限公司)；攤片拷片機(型號：HD-330，湖北慧達儀器有限公司)；半自動切片機(型號：RM2235，德國Leica公司)；電子天平(型號：EK3820，廣東香山衡器集團股份有限公司)；冷凍離心機(型號：H2050R，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；超聲機(型號：KQ-225B，昆山超聲儀器制造有限公司)；倒置顯微鏡(型號：DM3000，德國Leica公司)；超純水系統(tǒng)(型號：NW30VF，Heal Force公司)。

1.4動物分組、模型制備及給藥方法 小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量隨機將小鼠分為正常對照組、模型對照組和葡萄籽油組，每組8只。然后將甲巰咪唑片用研磨棒碾碎后溶于0.9%氯化鈉溶液中制成10 mg·mL-1的混懸液，灌胃劑量為100 μL·(20 g)-1，劑量換算參照文獻[8]。 模型對照組和葡萄籽油組連續(xù)用甲巰咪唑灌胃4周，正常對照組予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃。從第5周開始灌胃葡萄籽油，葡萄籽油的人體推薦劑量為50 mg·kg-1·d-1，使用人體推薦劑量的20倍即1 mg·kg-1·d-1作為小鼠灌胃劑量，然后將葡萄籽油用2%聚山梨酯80稀釋，正常對照組和模型對照組給相應體積2%聚山梨酯80，連續(xù)灌胃至第8周實驗結(jié)束。每周根據(jù)體質(zhì)量換算調(diào)整給藥劑量。

1.5觀察指標 采用摘眼球法取血，處死，室溫靜置2 h后924×g離心20 min，收集血清，然后分裝于-20 ℃保存。取甲狀腺組織攝像后放入4%多聚甲醛中固定，取脾臟和胸腺，用0.9%氯化鈉溶液清理干凈組織，濾紙吸干后用電子天平稱定質(zhì)量，然后根據(jù)體質(zhì)量計算胸腺、脾臟指數(shù)。臟器指數(shù)(%)=臟器質(zhì)量(g)/小鼠體質(zhì)量(g)×100% 。取4%多聚甲醛固定好的甲狀腺組織，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，進行石蠟包埋。血清游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)的含量由湖北省中醫(yī)院核醫(yī)學科采用化學發(fā)光法進行檢測；血清細胞因子采用定制的多因子ELISA芯片進行檢測。

2 結(jié)果

2.1葡萄籽油對甲減小鼠體質(zhì)量的影響 甲巰咪唑連續(xù)灌胃8周后，正常對照組小鼠體質(zhì)量為(23.54±1.06)g，模型對照組為(20.80±1.32) g，葡萄籽油組為(20.28±0.82) g，模型對照組小鼠體質(zhì)量較正常對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且小鼠出現(xiàn)少動嗜睡，畏寒蜷臥、弓背、喜聚堆，大便稀，豎毛、體毛枯疏無光澤且易脫落等現(xiàn)象。與模型對照組比較，葡萄籽油組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義，但小鼠體毛逐漸恢復光澤，活動度和抵抗力均有所增加。

2.2葡萄籽油對甲減小鼠脾和胸腺的影響 胸腺和脾臟是重要的免疫器官，其臟器指數(shù)可在一定程度上反映機體免疫功能的強弱。表1結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型對照組小鼠脾質(zhì)量、脾指數(shù)、胸腺質(zhì)量和胸腺指數(shù)均差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但模型對照組胸腺指數(shù)有降低趨勢。葡萄籽油干預后小鼠脾質(zhì)量較模型對照組顯著降低(P<0.05)。

表1 3組小鼠脾質(zhì)量、脾指數(shù)、胸腺質(zhì)量和胸腺指數(shù)比較

組別脾質(zhì)量/g脾指數(shù)/(0.01 g/g)正常對照組0.089±0.0070.441±0.041模型對照組0.088±0.0050.456±0.030葡萄籽油組0.078±0.005?10.424±0.028組別胸腺質(zhì)量/g胸腺指數(shù)/(0.01 g/g)正常對照組0.033±0.0040.162±0.020模型對照組0.029±0.0050.148±0.024葡萄籽油組0.030±0.0080.162±0.047

與模型對照組比較，*1P<0.05

Compared with model control group，*1P<0.05

2.3葡萄籽油對甲減小鼠血清甲狀腺功能的影響 圖1結(jié)果顯示，模型對照組小鼠血清FT4含量較正常對照組顯著下降(P<0.05)，葡萄籽油干預后FT4含量顯著升高(P<0.05)，模型對照組FT3和血清促甲狀腺激素(TSH)的含量與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，葡萄籽油干預后FT3含量較模型對照組顯著升高(P<0.05)。

2.4葡萄籽油對甲減小鼠大體觀及組織形態(tài)學的影響 甲狀腺大體觀和HE染色結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)正常對照組小鼠甲狀腺呈深紅色(圖2)，鏡下可見較大的濾泡均勻分布，為卵圓形或不規(guī)則形。濾泡上皮為單層立方上皮，細胞呈柱狀，核圓。而模型對照組小鼠甲狀腺外觀明顯腫大，鏡下甲狀腺組織增生，濾泡變小、呈結(jié)節(jié)狀大小不一分布，腔內(nèi)膠樣物質(zhì)減少，甚至消失。葡萄籽油組甲狀腺組織結(jié)構(gòu)較清晰，增生較模型對照組顯著減輕，甲狀腺濾泡為柱狀或低柱狀上皮，濾泡腔內(nèi)有較多均一膠質(zhì)。

2.5葡萄籽油對甲減小鼠血清IL-1β、IL-2和INF-γ的影響 與正常對照組比較，模型對照組小鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-2和INF-γ的含量顯著升高(P<0.05)，葡萄籽油干預4周后，小鼠血清IL-1β和IL-2的表達水平顯著降低(P<0.05)，見圖3。

3 討論

大量研究發(fā)現(xiàn)葡萄籽油具有預防高血壓、防止血栓形成，抗氧化、延緩衰老，清除沉積血管膽固醇、防治冠心病等功效，但筆者尚未見到關(guān)于改善甲狀腺功能方面的研究報道[9]。

甲狀腺功能的改變可引起細胞調(diào)節(jié)因子的紊亂，而細胞因子是介導免疫反應的重要調(diào)節(jié)因子，它和自身免疫性甲狀腺疾病的免疫病理生理過程密切相關(guān)，細胞因子不僅參與形成甲狀腺的免疫紊亂，而且影響著甲狀腺細胞的多種功能活動[10]。甲減患者細胞因子水平能夠?qū)е禄颊叱霈F(xiàn)異常的甲狀腺激素合成及分泌，同時還能夠造成患者的甲狀腺功能紊亂，主要通過影響濾泡上皮細胞功能的途徑產(chǎn)生作用。本研究發(fā)現(xiàn)，葡萄籽油可以顯著提高甲狀腺減退小鼠FT3和FT4的含量(P<0.05)，表明其對甲狀腺功能減退小鼠具有一定的保護作用。為了進一步研究其可能的保護作用機制，筆者檢測了細胞因子的表達水平。

A.正常對照組B.模型對照組；C.葡萄籽油組；與模型對照組比較，*1P<0.05；與正常對照組比較，*2P<0.05

A.normal control group；B.model control group；C.grape seed oil group； Compared with model control group，*1P<0.05；Compared with normal control group，*2P<0.05

圖2 3組小鼠甲狀腺大體觀及組織病理學(HE，×200)

Fig.2Morphologicalobservationandhistopathologyofthyroidinthreegroupsofmice(HE，×200)

A.正常對照組B.模型對照組；C.葡萄籽油組；與正常對照組比較，*1P<0.05；與模型對照組比較，*1P<0.05

A.normal control group；B.model control group；C.grape seed oil group； Compared with normal control group，*1P<0.05；Compared with model control group，*2P<0.05

臨床研究發(fā)現(xiàn)甲減患者血清IL-1、IL-2、IL-6等細胞因子的表達發(fā)生顯著變化[11-13]。IL-1由活化的單核-巨噬細胞產(chǎn)生，以自分泌方式作用于巨噬細胞本身，誘導其上調(diào)MHC-Ⅱ和各種粘附分子的表達水平；促使Th細胞活化，啟動免疫應答；作為重要的炎癥因子參與各種急、慢性炎癥反應。IL-2來源于活化的T淋巴細胞。其效應細胞是誘導活化T細胞及胸腺細胞，誘導T細胞產(chǎn)生淋巴因子，還參與機體的免疫應答、細胞分化，調(diào)控造血等多種生理及病理過程[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲減模型小鼠血清IL-1β和IL-2的含量顯著升高，其可能通過參與機體炎癥反應引起免疫應答來促進甲減疾病的發(fā)生發(fā)展過程。葡萄籽油干預后，IL-1β和IL-2的表達顯著降低，表明其可能通過調(diào)控IL-1β和IL-2的表達起到一定的保護作用。