周榮榮，李培碩，關(guān)偉，王麗萍，李彥文，李志勇

(1.山西中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，晉中 030600；2.吉林省鎮(zhèn)賚縣人民醫(yī)院，白城 030024；3.中國中醫(yī)科學院中醫(yī)藥信息研究所，北京 100700；4.中央民族大學藥學院，北京 100081)

有關(guān)研究表明，原發(fā)性頭痛是卒中的危險因素[1]，偏頭痛可增加全腦卒中、缺血性卒中的風險[2]。近年來，頭痛的患病率升高，已引起全球性重視。據(jù)調(diào)查，偏頭痛已上升為2013年全球疾病負擔(Global Burden of Disease，GBD)的第6位[3]，在全世界致殘疾病的第3位[4]；當前頭痛主要依靠藥物和預(yù)防性治療，如阿片類藥物或靜脈注射氯胺酮等治療方法[5]，但治療效果并不樂觀，頭痛的防治越來越成為亟待解決的問題。

頭痛屬中醫(yī)學“頭痛”“頭風”范疇。《普濟方》認為：“氣血俱虛，風邪傷于陽經(jīng)...，則令人頭痛”；現(xiàn)代研究總結(jié)頭痛多因感受外邪、肝火上擾、肝陽上亢、痰瘀阻絡(luò)、風痰上擾、氣血虧虛等所致[6]。天麻為蘭科植物天麻(GastrodiaelataBl.)的干燥塊莖，以“赤箭”之名始見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性味甘，平，歸肝經(jīng)；功效能息風止痙，平抑肝陽，祛風通絡(luò)，天麻是治療頭痛肝陽上亢、痰阻經(jīng)絡(luò)證的基礎(chǔ)藥。如李東垣《脾胃論》言：“足太陰痰厥頭痛......眼黑頭眩，風虛內(nèi)作，非天麻不能除”；《本草匯言》言天麻：“主頭風，頭痛，頭暈虛眩......一切中風，風痰”?，F(xiàn)代研究也表明天麻具有調(diào)節(jié)促進突觸可塑性和神經(jīng)修復(fù)、抑制神經(jīng)細胞凋亡等作用[7]，但天麻治療頭痛的機制仍不十分明確。

中藥整合藥理學計算平臺V1.0(http：//www.tcmip.cn/)是以中醫(yī)藥大數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，通過人工智能、數(shù)據(jù)挖掘與網(wǎng)絡(luò)藥理學、分子生物學等學科結(jié)合的方法，一站式完成“中藥-多成分-多靶點-疾病”之間網(wǎng)絡(luò)關(guān)系計算，可有效預(yù)測中藥的潛在藥效、分子作用機制等[8]。筆者通過中藥整合藥理學平臺，探究天麻有效化學成分及治療頭痛的分子機制，為天麻臨床實驗研究提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1資料來源 數(shù)據(jù)由中藥整合藥理學計算平臺的中藥材數(shù)據(jù)庫、中藥成分數(shù)據(jù)庫、疾病/癥狀靶標數(shù)據(jù)庫提供。與中藥、疾病相關(guān)的靶標基因及相關(guān)生物信息資源來源于Drugbank，OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)，HPO(Human Phenotype Ontology)，GO(gene ontology)，TTD(Therapeutic Target Database)，KEGG( Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)等數(shù)據(jù)庫。蛋白-蛋白相互作用信息(PPI)整合藥理學平臺鑲嵌HAPPI，Reactome，OPHID，In Act，HPRD，PDZBase，MINT，DIP等數(shù)據(jù)庫中蛋白-蛋白相互作用數(shù)據(jù)。3種拓撲結(jié)構(gòu)特征值“連接度(degree)”“介度(betweenness)”“緊密度(closeness)”設(shè)定以確定中藥矯正疾病失衡網(wǎng)絡(luò)的候選靶標。通過GO和KEGG數(shù)據(jù)庫，確定靶標基因、蛋白質(zhì)分子功能、細胞內(nèi)定位及其所參與的生物學反應(yīng)和通路。

1.2研究步驟

1.2.1信息設(shè)定 登陸中藥整合藥理學平臺，新建“天麻-頭痛”任務(wù)，檢索中藥材數(shù)據(jù)庫將“天麻”信息添加保存，得到21種化學成分；以“頭痛”相關(guān)的英文名稱“Headache”“Migraine”作為關(guān)鍵詞進行檢索，將檢索結(jié)果保存得到頭痛疾病相關(guān)的靶標。

1.2.2靶標預(yù)測 設(shè)置相似性分數(shù)0.8，整合藥理學平臺，通過化學成分二維結(jié)構(gòu)(.mol或.sdf)相似性與美國食品藥品管理局(food and drug administration，F(xiàn)DA)上市藥物進行比對，以Tanimoto系數(shù)定義的相似度計量方法進行相似性打分，信息設(shè)定與相似性分數(shù)設(shè)置完成后，點擊“確認”。

1.2.3一站式計算 平臺智能進行“靶標預(yù)測、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作(PPI)、網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、核心靶標(Core targets)的篩選、可視化等”一站式分析，生成報告。

1.2.4拓撲特征值 以“節(jié)點連接度”的 2倍中位數(shù)為卡值，選取中藥靶標-疾病基因互作網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點；在此基礎(chǔ)上，選取同時滿足節(jié)點“連接度”“緊密度”“介度”中位數(shù)的節(jié)點，構(gòu)建中藥潛在靶標與疾病靶標之間相互作用的關(guān)鍵靶標網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1天麻所含化學成分和藥物靶標預(yù)測 天麻化學成分21種，主要有酚類、多糖類、氨基酸、甾醇類等多種化學成分，研究表明天麻素(gastrodin)、香草醇(vanillyl alcohol)、4-(4'-羥基芐氧基)芐基甲基醚(4-(4'-Hydroxybenzyloxy)benzyl methyl ether)、p-羥基苯甲醇(p-Hydroxybenzyl alcohol)、香草醛(vanillin)等是天麻的主要神經(jīng)藥理學活性成分[9]，尤其是天麻素已明確其在痙攣性疾病、頭暈和頭痛、神經(jīng)損傷等方面有顯著效果[10]；對天麻的化學成分進行靶標預(yù)測，相似性分數(shù)為0.8時，天麻的預(yù)測靶標數(shù)355個，其中天麻素預(yù)測靶標數(shù)71個、雙(4-羥基苯基)乙醚預(yù)測靶標數(shù)68個、蔗糖預(yù)測靶標數(shù)83個、十六烷酸(棕櫚酸)預(yù)測靶標數(shù)49個等。

2.2天麻預(yù)測靶標GO富集分析、KEGG通路富集分析 對天麻的預(yù)測靶標進行GO富集分析、KEGG通路富集分析，結(jié)果均差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，得到GO富集分析結(jié)果486條和KEGG通路富集分析結(jié)果35條，發(fā)現(xiàn)天麻的預(yù)測靶標與檸檬酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle)、琥珀酸代謝過程(succinate metabolic process)、異檸檬酸代謝過程( isocitrate metabolic process)、琥珀酸脫氫酶活性(succinate dehydrogenase activity)等生物功能，功能定位在線粒體(mitochondrion)、succinate dehydrogenase complex(線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅱ、琥珀酸脫氫酶復(fù)合體)等；發(fā)現(xiàn)天麻的預(yù)測靶標與檸檬酸循環(huán)(citrate cycle)、碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)、脂質(zhì)代謝(lipid metabolism)、過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPAR)信號通路、2-氧代羧酸代謝(2-oxocarboxylic acid metabolism)脂肪酸代謝等生物代謝通路有關(guān)。

2.3天麻“藥物-靶標-疾病”網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(Hub)分析 通過整合藥理學平臺得到40個頭痛相關(guān)的靶點，并利用蛋白-蛋白相互作用模塊構(gòu)建天麻潛在靶標與頭痛靶標相互作用關(guān)系，平臺設(shè)定同時滿足大于節(jié)點“連接度”“介度”“緊密度”的中位數(shù)為卡值，選取關(guān)鍵核心靶標，并進行核心靶標的GO富集分析、KEGG通路富集分析，根據(jù)連接度值排名前100位的靶點信息繪制的核心靶標網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)。

圖1 核心靶點網(wǎng)絡(luò)

結(jié)果得到核心靶標信息118條，其中潛在藥物靶標(putative drug target)9條，如GCK、ATP1A1、RPIA、ITPA、YWHAE、CPB1、RCVRN、LY96、PPARG，已知疾病靶標(known disease target)27條，如HTR2B、HTR1B、HTR1D、PIK3CA、HTR1A、HTR1F、ADORA2A、HRH4、IMPA1、ADORA1、HTR7、PIK3CB、CALCB等(表1)。

2.4關(guān)鍵靶標GO富集分析和KEGG通路富集分析 平臺對天麻干預(yù)頭痛的關(guān)鍵靶標分析，得到GO富集分析結(jié)果949條和KEGG通路富集分析結(jié)果137條。GO富集分析顯示天麻參與生物功能主要定位在質(zhì)膜(plasma membrane)、細胞質(zhì)(cytosol)、神經(jīng)遞質(zhì)、樹突等，參與G-蛋白耦聯(lián)5-羥色胺受體活性(G-protein coupled serotonin receptor activity)、血清素受體信號通路( serotonin receptor signaling pathway)、第二信使環(huán)核苷酸耦聯(lián)的G-蛋白耦聯(lián)受體信號通路(G-protein coupled receptor signaling pathway，coupled to cyclic nucleotide second messenger)、血清素結(jié)合(serotonin binding)、血小板活化(platelet activation)、肌醇磷酸代謝過程(inositol phosphate metabolic process)、磷脂酶C活性( phospholipase C activity)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)、胞質(zhì)內(nèi)游離鈣離子的釋放(release of sequestered calcium ion into cytosol)、磷脂酶C活性的激活(activation of phospholipase C activity)等，見表2；KEGG通路分析預(yù)測天麻在關(guān)于神經(jīng)系統(tǒng)(nervous system)、炎癥遞質(zhì)調(diào)節(jié)色氨酸通道(inflammatory mediator regulation of TRP channels)、5-羥色胺能神經(jīng)突觸(Serotonergic synapse)、雌激素信號通路(estrogen signaling pathway)、Calcium signaling pathway(鈣信號通路)、神經(jīng)營養(yǎng)因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(neurotrophin signaling pathway)、縫隙連接(gap junction)、信號通路(cGMP - PKG signaling pathway，cGMP PKG)、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)( phosphatidylinositol signaling system)、膽堿能突觸(cholinergic synapse)、碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)、神經(jīng)活性的配體-受體相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)等主要疾病靶標通路，見表3。

表1 天麻治療頭痛核心靶標表(排名前20位)

Tab.1CoretargetsofGastrodiarhizomaforthetreatmentofheadache(Top20)

種類核心靶標連接度緊密度介度已知疾病靶標HTR2B430.606 217 625.898 305 08 潛在藥物靶標 GCK420.567 961 174.872 881 36已知疾病靶標HTR1B320.529 411 760.00E+00已知疾病靶標HTR1D320.529 411 760.101 694 92潛在藥物靶標ATP1A1310.521.402 542 37已知疾病靶標PIK3CA310.522 321435.495 762 71已知疾病靶標HTR1A310.527 027 030.00E+00已知疾病靶標HTR1F310.527 027 031.398 305 08已知疾病靶標ADORA2A300.559 808 613.313 559 32已知疾病靶標HRH4280.430 147 063.220 338 98已知疾病靶標IMPA1270.455 252 923.436 440 68已知疾病靶標 ADORA1270.455 252 920.673 728 81已知疾病靶標 HTR7250.513 157 891.025 423 73已知疾病靶標CALCA210.473 684 212.118 644 07其他PLCB2200.517 699 120.419 491 53已知疾病靶標PIK3CD190.471 774 192.588 983 05已知疾病靶標PIK3CB190.434 944 241.694 915 25其他PLCB3190.508 695 651.326 271 19 已知疾病靶標 ALCB170.431 734 320.525 423 73

表2 天麻治療頭痛的GO生物功能表(排名前10位)

Tab.2BiologicalfunctionofGastrodiarhizomaforthetreatmentofheadache(Top10)

編號條目(術(shù)語)P值GO:0004993G-蛋白耦聯(lián)5-羥色胺受體活性(G-protein 1.06E-18 coupled serotonin receptor activity)GO:0007210血清素受體信號通路(serotonin receptor 1.09E-16 signaling pathway)GO:0007187與環(huán)核苷酸第二信使耦聯(lián)的G-蛋白耦聯(lián)受體3.56E-15 信號通路(G-protein coupled receptor signaling pathway,coupled to cyclic nucleotide second messenger)GO:0005886質(zhì)膜(plasma membrane)5.97E-15GO:0005829細胞質(zhì)(cytosol)3.76E-12

表3 天麻治療頭痛的主要通路表(排名前10位)

Tab.3MainpathwaysofGastrodiarhizomaforthetreatmentofheadache(Top10)

編號條目(術(shù)語)P值#神經(jīng)系統(tǒng)(nervous system)6.78E-20hsa04750炎癥遞質(zhì)調(diào)節(jié)色氨酸通道(inflammatory 2.72E-18 mediator regulation of TRP channels)hsa047265-羥色胺能神經(jīng)突觸(serotonergic synapse)5.97E-17hsa04915雌激素信號通路(estrogen signaling pathway)1.88E-14hsa04020鈣信號通路(calcium signaling pathway)7.80E-14

“#”代表大通路

“#” means the systematic pathway

2.5“中藥-成分-關(guān)鍵藥靶-通路”網(wǎng)絡(luò)可視化圖分析 按照核心靶標的KEGG通路P值前30位進行繪制的“中藥-成分-關(guān)鍵藥靶-通路”網(wǎng)絡(luò)可視化圖(圖2)，可以觀察到天麻的6種化學成分天麻素(TCMIP105357)、雙(4-羥基苯基)醚-β-D-喃葡萄糖(TCMIP105353)、枸櫞酸(TCMIP100469)、蒼耳苷/β-谷甾醇3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(TCMIP100352)、蔗糖(TCMIP100350)、十六烷酸(TCMIP100276)和6個潛在的關(guān)鍵靶標GCK、ATP1A1、RPIA、YWHAE、LY96、PPARG關(guān)聯(lián)密切，并參與神經(jīng)系統(tǒng)(nervous system)、神經(jīng)營養(yǎng)因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路( neurotrophin signaling pathway)、碳水化合物代謝( carbohydrate metabolism)、胃酸分泌( gastric acid secretion)、細胞生長與死亡(cell growth and death)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)、循環(huán)系統(tǒng)( circulatory system)、內(nèi)分泌系統(tǒng)(endocrine system)等通路。

3 結(jié)束語

筆者通過整合藥理學平臺 V1.0預(yù)測天麻防治頭痛的有效成分及其潛在作用靶點，從整體上探究天麻活性成分與疾病關(guān)鍵靶標的密切關(guān)系以及主要的生物功能通路過程。平臺發(fā)現(xiàn)天麻素、雙(4-羥基苯基)醚-β-D-喃葡萄糖、枸櫞酸、蒼耳苷/β-谷甾醇3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、十六烷酸等成分與頭痛預(yù)測的核心靶標有高度相關(guān)性。天麻富含酚類物質(zhì)和多糖，已證實天麻素和4-羥基芐基醇等酚類成分都有顯著的神經(jīng)保護、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化等作用[11-12]。27條“天麻-頭痛”已知靶標中HTR2B、HTR1B、HTR1D、PIK3CA等具有很高的網(wǎng)絡(luò)拓撲特征值，COROMINAS等[13]證明5-羥色胺受體2B (HTR2B)在有先兆偏頭痛和無先兆偏頭痛疾病均有不同的參與過程； YUCEL等[14]研究發(fā)現(xiàn)偏頭痛患者表現(xiàn)為系統(tǒng)性5-羥色胺濃度降低和腦內(nèi)5-羥色胺合成率的變化，5-HTR2A、5-HTR2C參與誘發(fā)頭痛，5-HTR1A、5-HTR1B、5-HT1D受體能迅速緩解曲坦類藥物導(dǎo)致的偏頭痛和叢集性頭痛；PIK3CA(磷脂酰肌醇3-激酶)是參與細胞增殖、G蛋白耦聯(lián)受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面的重要基因，參與癌癥基因表達等，可能與膠質(zhì)神經(jīng)元腫瘤引起的頭痛有關(guān)[15]。9個關(guān)于頭痛的潛在藥物靶標中葡萄糖激酶(glucokinase，GCK)、ATPA1的網(wǎng)絡(luò)拓撲特征值相對較高，分別排在第2位和第5位，GCK是維持人體葡萄糖體內(nèi)平衡的傳感器[16]，平臺顯示GCK與Gastrodin、Bis(4-hydroxybenzyl)ether mono-β-D-glucopyranoside、sucrose密切相關(guān)，相關(guān)研究也表明天麻素有顯著的降血糖作用，能調(diào)節(jié)脂代謝紊亂等[17]，推測天麻素藥理作用與GCK有一定關(guān)系；ATP1A1(鈉/鉀轉(zhuǎn)運的堿性磷酸酶亞基α-1)是通過對Na和K離子通過質(zhì)膜進行電化學梯度建立和維護的膜蛋白，研究發(fā)現(xiàn)它與高血壓病有關(guān)[18]；RPIA(5-磷酸糖異構(gòu)酶A)也是相對網(wǎng)絡(luò)拓撲特征值較高的潛在靶標，它主要參與戊糖磷酸途徑，與腦白質(zhì)病、周圍神經(jīng)疾病等有關(guān)[19]，此外還有YWHAE、LY96、PPARG等拓撲值相對較小的潛在藥物靶標。

綠色：中藥；紫色：成分；藍色：關(guān)鍵靶標；紅色：通路

生物活性成分和疾病靶標的鑒定與研究是中藥研究的一個重要領(lǐng)域[20]，本研究基于中藥整合藥理學平臺有效證實天麻活性化學成分，并預(yù)測出天麻防治頭痛的潛在藥物靶標及作用機制，但只考慮中藥成分和疾病靶標與目標蛋白之間的相互作用，還不足以解釋中醫(yī)藥對疾病基因表達更深層面的影響，還需要進一步的實驗證明和探究。