郭天賜，趙石磊，劉石生，*

（1.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南 ?？?570228；2.海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228）

β-葡萄糖苷酶（β-D-glucoside，EC3.2.1.21）可以水解糖基原子與烴基或芳香基團(tuán)結(jié)合的糖苷鍵生成葡萄糖和相應(yīng)的配基，它屬于一種水解酶[1-2]，Liebig 和Wohler 在研究苦杏仁汁時(shí)，該酶才被第一次報(bào)道[3]。大豆異黃酮具有抑制癌癥[4-5]、抗氧化[6]、防止骨質(zhì)疏松[7]、防治動(dòng)脈硬化[8]、抵抗神經(jīng)退化疾病[9]、防糖尿病[10]等保健作用，研究發(fā)現(xiàn)其生物學(xué)功能的發(fā)揮主要依靠游離型苷元形式[11]，β-葡萄糖苷酶可水解大豆異黃酮糖苷[12-17]成游離型苷元。姚軼俊等[18]、周熒等[19]研究了固定化β-葡萄糖苷酶在大豆異黃酮水解上的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)其水解率得到明顯的提升。Hsieh M C 等[20]、W Fang 等[21]從不同霉菌中提取獲得β-葡萄糖苷酶，結(jié)果顯示來源于真菌的該酶對(duì)大豆異黃酮的水解具有很好的效果。大豆異黃酮在大豆中含量最高，而豆?jié){是大眾最常飲用、最受歡迎的大豆食品，因而本課題研究在豆?jié){中添加苦杏仁β-葡萄糖苷酶，對(duì)其中大豆異黃酮糖苷水解的影響，有利于豆?jié){營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的提升。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生苦杏仁：市售；東北大豆：海口市鵬泰興超市。

氯化鈉、石油醚（60～90）、十二水和磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、酒石酸、乙酸鋅、氯化鎂、硝酸鋁、無水甲醇、磷酸、無水乙醇：海南擎峰試劑有限公司，均為分析純；乙腈（色譜純）：默克化工技術(shù)有限公司。

對(duì)硝基苯-β-D-葡萄糖苷（4’-nitrophenyl-beta-D-glucopyranoside，pNPG，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、考馬斯亮藍(lán)R-250、大豆苷、染料木苷、黃豆黃苷、大豆苷元、染料木素、黃豆黃素：上海源葉生物科技有限公司，均為生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

XL-130B 粉碎機(jī)、IKA；HH-S26S 電熱恒溫水浴鍋：金壇市大地自動(dòng)化儀器廠；FSH-Ⅱ型勻漿器：江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；TG16G 離心機(jī)：湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；BS124S 電子天平：德國(guó)Sartorius 公司；PHS-3C pH 計(jì)：上海雷磁儀器廠；7230G 可見分光光度計(jì)：上海精科實(shí)業(yè)有限公；XO-5200TDT 超聲波清洗機(jī)：南京先歐儀器制造有限公司；1-14 小型臺(tái)式離心機(jī)：Sigma 公司；安捷倫1260 液相色譜儀：安捷倫科技（中國(guó)）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 高效液相色譜測(cè)定條件

色譜柱：Agilent TC-C18 柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；保護(hù)柱芯：ZORBAX Eclipse Plus，12.5 mm×4.6 mm，5 μm；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：A（pH 3 的磷酸水溶液）、B（乙腈）；后運(yùn)行時(shí)間：5 min；梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 The condition of gradient elutiom

1.3.2 大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精確稱取大豆苷（D）、大豆苷元（De）、黃豆黃苷（Gl）、黃豆黃素（Gle）、染料木苷（G）、染料木素（Ge）標(biāo)樣各5.0 mg，加入80%的甲醇溶液，超聲溶解，定容至刻度，即為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精準(zhǔn)吸取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成不同濃度的混合標(biāo)樣溶液，用0.45 μm 有機(jī)系的濾膜過濾，濾液裝入進(jìn)樣品瓶中，高效液相色譜 （high performance liquid chromatography，HPLC）分析，測(cè)定各組分的峰面積。以大豆異黃酮各組分的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，計(jì)算大豆苷、大豆苷元、黃豆黃苷、黃豆黃素、染料木苷、染料木素標(biāo)準(zhǔn)曲線。

大豆異黃酮含量的計(jì)算：

樣品濃度=（樣品峰面積/標(biāo)樣峰面積）×標(biāo)樣濃度×稀釋倍數(shù)

1.3.3 豆?jié){的制備方法

準(zhǔn)確稱取東北大豆100 g，洗凈放入燒杯中，加入蒸餾水500 mL 于25 ℃條件下浸泡8 h～10 h，再用蒸餾水定量至1 000 mL，倒入豆?jié){機(jī)中制成豆?jié){（干濕模式），濾網(wǎng)過濾，冷卻后放入冰箱冷藏（4 ℃）待用。

1.3.4 苦杏仁β-葡萄糖苷酶酶液的制備方法

參考王佩環(huán)[22]的方法，稱取一定量苦杏仁，粉碎，與丙酮按料液比 1 ∶3（g/mL）脫脂，抽濾，待丙酮揮干，加水[料液比 1 ∶5（g/mL）]復(fù)溶，高速勻漿后離心過濾，加與濾液等量的丙酮再次沉淀，離心后棄去上清液，待丙酮揮干，將沉淀重新用蒸餾水溶解，勻漿，即為所需酶液，于冰箱4 ℃冷藏保存。

1.3.5 測(cè)定β-葡萄糖苷酶酶活性方法

參考李斐然等[23]的方法，對(duì)β-葡萄糖苷酶的活力進(jìn)行測(cè)定。

測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=17.071X-0.000 9，R2=0.999 8。

酶活/（U/mL）=0.5x/（30×0.1）×C，C 為稀釋倍數(shù)。

1.3.6 樣品的制備

于25 mL 具塞試管中加入5 mL 豆?jié){，再加入適量稀釋后的β-葡萄糖苷酶液，在水浴鍋中（不同溫度）反應(yīng)一段時(shí)間后沸水浴5 min，冷卻至25 ℃，得到反應(yīng)液。于10 mL 容量瓶中加入2 mL 反應(yīng)液和80%甲醇溶液，50 ℃超聲30 min 后冷卻至25 ℃，用80%甲醇溶液定容，得到樣品溶液。將樣品溶液置于2 mL 離心管中，12 000 r/min 離心15 min，吸取上清液過0.45 μm的有機(jī)濾膜，濾液收集于進(jìn)樣小瓶中，4 ℃冷藏待用。

1.3.7 苦杏仁β-葡萄糖苷酶對(duì)大豆異黃酮糖苷的水解試驗(yàn)

將苦杏仁β-葡萄糖苷酶液和豆?jié){于一定條件下反應(yīng)，通過調(diào)節(jié)加酶量（A）、酶解時(shí)間（B）、酶解溫度（C）以獲得更多的大豆苷元（De）、黃豆黃素（Gle）、染料木素（Ge）。

1.3.7.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以大豆苷（D）、大豆苷元（De）、黃豆黃苷（Gl）、黃豆黃素（Gle）、染料木苷（G）、染料木素（Ge）為指標(biāo)，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)為：加酶量（0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 U/5 mL）、酶解時(shí)間（0、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5 h）、酶解溫度（30、35、45、55、65、75 ℃）

1.3.7.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以大豆苷元（De）、黃豆黃素（Gle）、染料木素（Ge）含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，各因素水平見設(shè)計(jì)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 2 The factors and levels of response surface analysis

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆異黃酮各組分標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以大豆異黃酮的濃度為橫坐標(biāo)，HPLC所測(cè)峰面積的平均值為縱坐標(biāo)，以峰面積Y 與質(zhì)量濃度X（μg/mL）進(jìn)行回歸分析，得到線性方程?；貧w方程見表3。

表3 6 種大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 3 Standard curve of six soy isoflavone standards

2.2 大豆異黃酮色譜圖

對(duì)6 種大豆異黃酮的混標(biāo)進(jìn)行色譜分析，根據(jù)單標(biāo)的保留時(shí)間確定依次出峰為大豆苷（D）、黃豆黃苷（Gl）、染料木苷（G）、大豆苷元（De）、黃豆黃素（Gle）、染料木素（Ge），對(duì)應(yīng)出峰時(shí)間分別是 13.844、14.618、20.350、32.293、33.616、43.319 min。

圖1 6 種大豆異黃酮混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 The chromatograms of six soy isoflavone in standards substance

2.3 苦杏仁β-葡萄糖苷酶對(duì)大豆異黃酮糖苷水解影響

2.3.1 加酶量對(duì)大豆異黃酮水解的影響

控制酶解溫度為45 ℃，酶解時(shí)間為0.5 h，改變加酶量，HPLC 檢測(cè)大豆異黃酮各組分的含量變化，結(jié)果見圖2。

圖2 加酶量對(duì)大豆異黃酮糖苷水解的影響Fig.2 The effect of enzyme addition on soybean isoflavone hydrolysis

隨著加酶量的上升，大豆異黃酮糖苷（D、G、Gl）的含量急劇下降，大豆異黃酮苷元（De、Ge、Gle）的含量呈上升趨勢(shì)。當(dāng)加酶量超過1 U/5 mL 時(shí)，隨著酶量的增加，大豆異黃酮各組分呈現(xiàn)穩(wěn)定的趨勢(shì)。這是因?yàn)閯偧用笗r(shí)，大豆異黃酮糖苷底物濃度高，大大超過酶的濃度，酶的濃度與反應(yīng)速度呈量效關(guān)系，當(dāng)酶的濃度增加時(shí)，酶水解速度加快，大豆異黃酮糖苷（D、G、Gl）的含量迅速下降，大豆異黃酮苷元（De、Ge、Gle）的含量逐漸升高，此時(shí)影響大豆異黃酮各組分含量的決定因素是酶的加入量。隨著酶量的增加，大豆異黃酮苷元（De、Ge、Gle）的濃度增高，此時(shí)影響各組分含量的決定性因素是底物含量，此時(shí)再增加酶的用量對(duì)大豆異黃酮糖苷的水解影響不大。為了降低生產(chǎn)成本，并得到理想的處理效果，優(yōu)選加酶量為1 U/5 mL。

2.3.2 酶解時(shí)間對(duì)大豆異黃酮水解的影響

控制加酶量為1 U/5 mL，酶解溫度為45 ℃，改變酶解時(shí)間，HPLC 檢測(cè)大豆異黃酮各組分的含量變化，結(jié)果見圖3。

圖3 時(shí)間對(duì)大豆異黃酮糖苷水解的影響Fig.3 The effect of time on soybean isoflavone hydrolysis

隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，大豆異黃酮苷（D、G、Gl）呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，大豆異黃酮苷元（De、Ge、Gle）的含量不斷增加。當(dāng)酶解時(shí)間超過0.5 h 時(shí)，隨著時(shí)間的增加，所測(cè)6 種大豆異黃酮的含量變化趨于穩(wěn)定狀態(tài)。因?yàn)榉磻?yīng)剛開始時(shí)，苦杏仁β-葡萄糖苷酶與底物作用的時(shí)間太短，不能有效的將糖苷型大豆異黃酮水解。隨著酶與底物接觸時(shí)間的增加，可以看出大豆異黃酮糖苷（D、G、Gl）的含量逐漸降低，大豆異黃酮苷元（De、Ge、Gle）的含量逐漸增加。當(dāng)酶解到達(dá)一定程度時(shí)，受到大豆異黃酮產(chǎn)物濃度的抑制作用，水解反應(yīng)達(dá)到平衡，大豆異黃酮各組分的含量不再變化。因此選擇酶解時(shí)間為0.5 h。

2.3.3 酶解溫度對(duì)大豆異黃酮水解的影響

控制加酶量為1 U/5 mL，酶解時(shí)間為0.5 h，改變酶解溫度，HPLC 檢測(cè)大豆異黃酮各組分的含量變化，結(jié)果見圖4。

圖4 溫度對(duì)大豆異黃酮糖苷水解的影響Fig.4 The effect of temperature on soybean isoflavone hydrolysis

溫度低于 45 ℃時(shí)，大豆異黃酮糖苷（D、G、Gl）的含量隨著溫度的升高呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，而大豆異黃酮苷元（De、Ge、Gle）的含量則隨溫度的升高不斷升上。當(dāng)溫度超過 45 ℃時(shí)，大豆異黃酮糖苷（D、G、Gl）的含量與溫度呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系，大豆異黃酮苷元（De、Ge、Gle）的含量隨溫度升高含量逐漸下降。這是因?yàn)樵跍囟容^低時(shí)，溫度對(duì)分子碰撞概率的影響比較大，溫度升高可以加快分子運(yùn)動(dòng)速率，提高分子碰撞概率，酶與底物的碰撞概率增加，從而使反應(yīng)速率加快。當(dāng)溫度高于45 ℃時(shí)，酶的部分蛋白質(zhì)開始變形，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，溫度升高對(duì)酶蛋白的變形作用更加嚴(yán)重，導(dǎo)致酶的活力下降，酶水解的反應(yīng)速率下降，大豆異黃酮糖苷（D、G、Gl）的含量會(huì)逐漸增加，大豆異黃酮苷元（De、Ge、Gle）的含量逐漸下降。因此選擇最佳溫度為45 ℃。

2.3.4 苦杏仁β-葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮糖苷的響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken 中心設(shè)計(jì)原理，以苦杏仁β-葡萄糖苷酶的加酶量（A）、酶解時(shí)間（B）、酶解溫度（C）作為響應(yīng)因素，以大豆異黃酮苷元（De、Gle、Ge）濃度作為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 The response surface design and experimental result

利用Design-expert 7.0.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到各因素與大豆苷元（De）濃度Y1回歸方程為：

Y1=37.31+2.38A+2.38B+0.18C-0.042AB+0.065AC-0.043BC-2.8A2-1.72B2-4.17C2。De 回歸模型方差分析見表5。

表5 De 回歸模型方差分析表Table 5 The variance analysis of regression model of De

由表5所示可知，方程模型是極顯著的（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.521 5＞0.05），說明該模型擬合良好，可以用于分析和預(yù)測(cè)苦杏仁β-葡萄糖苷酶水解大豆苷（D）的試驗(yàn)條件。該模型一次項(xiàng)中的A、B，二次項(xiàng)中的A2、B2、C2對(duì)苦杏仁β-葡萄糖苷酶水解有極顯著的影響，二次項(xiàng)中的AB、BC、AC 交互作用對(duì)苦杏仁β-葡萄糖苷酶水解的影響不顯著，一次項(xiàng)中C 對(duì)水解反應(yīng)的影響顯著，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.976 1，說明試驗(yàn)誤差較小。而R2Adj=0.945 3，說明可信度較高。通過結(jié)果可以看出，本試驗(yàn)中3 個(gè)因素影響大豆苷元（De）濃度的次序?yàn)锽＞A＞C。

利用Design-expert 7.0.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到各因素與黃豆黃素（Gle）濃度Y2回歸方程為：

Y2=5.57+0.8A+0.86B+0.22C-0.034AB-0.36AC+2.25×10-3BC-0.69A2-0.49B2-1.25C2。Gle 回歸模型方差分析見表6。

表6 Gle 回歸模型方差分析表Table 6 The variance analysis of regression model of Gle

由表6所示可知，在失擬項(xiàng)不顯著的前提下，得到的回歸方程極其顯著。該結(jié)果表明，采用軟件模擬的方程模型是理想的。所得的相關(guān)系數(shù)R2=0.976 3，說明方程預(yù)測(cè)的結(jié)果與試驗(yàn)結(jié)果擬合性較好，而R2Adj=0.945 7，說明可信度高。響應(yīng)面回歸模型中A、B、A2、B2、C2（P＜0.01）對(duì)苦杏仁β-葡萄糖苷酶酶解反應(yīng)的影響極顯著，C、AC 對(duì)苦杏仁β-葡萄糖苷酶水解的影響顯著。AB、BC（P＞0.05）交互因素項(xiàng)對(duì)黃豆黃素（Gle）的濃度的影響不顯著。通過結(jié)果可以看出，本試驗(yàn)中3個(gè)因素影響黃豆黃素（Gle）濃度的次序?yàn)锽＞A＞C。

利用Design-expert 7.0.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到各因素與染料木素（Ge）濃度Y3回歸方程為：

Y3=41.74+6.38A+4.84B+1.35C-0.41AB-0.55AC+2BC-3.65A2-4.85B2-6.97C2。Ge 回歸模型方差分析見表7。

表7 Ge 回歸模型方差分析表Table 7 The variance analysis of regression model of Ge

由表7所示可知，在失擬項(xiàng)不顯著的前提下，得到的回歸方程極其顯著。結(jié)果表明，采用軟件模擬的方程模型是理想的。所得的相關(guān)系數(shù)R2=0.979 3，說明了方程預(yù)測(cè)的結(jié)果與試驗(yàn)結(jié)果擬合性較好。而R2Adj=0.952 6，說明可信度高。從各因素A、B、C 對(duì)染料木素（Ge）濃度的影響來看，A、B、A2、B2、C2的影響均為極其顯著（P＜0.01），BC 的交互作用對(duì) Ge 的濃度影響顯著（P＜0.05）。而 C 與 AB、AC 的交互作用對(duì)染料木素（Ge）的濃度影響不顯著。通過方程結(jié)果可以看出，試驗(yàn)中3 因素的影響穩(wěn)定性系數(shù)值得次序?yàn)椋篈＞B＞C；由方程及方差分析結(jié)果可看出各因素與染料木素（Ge）濃度之間的關(guān)系呈二次關(guān)系。

優(yōu)化3 個(gè)影響因素的最佳組合為：加酶量為1.28 U/5 mL，酶解時(shí)間0.66 h，酶解溫度為45.6 ℃，預(yù)測(cè)大豆苷元、黃豆黃素、染料木素的濃度分別為38.561、6.135、45.255 μg/mL。在試驗(yàn)條件下：加酶量為1.4 U/5mL，反應(yīng)時(shí)間40 min，反應(yīng)溫度46.0 ℃，測(cè)得大豆異黃酮苷元（De、Gle、Ge）的濃度分別為（36.954±1.67）、（5.119±0.275）、（38.643±2.03）μg/mL，與模型預(yù)估值相差不大，說明軟件模擬出的模型是可信的。

3 結(jié)論

將苦杏仁β-葡萄糖苷酶添加到豆?jié){中進(jìn)行反應(yīng)，通過控制加酶量、酶解溫度和酶解時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)。以單因素為基礎(chǔ)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得到3 個(gè)影響因素的最佳組合為：加酶量為1.4 U/5mL，反應(yīng)時(shí)間40 min，反應(yīng)溫度46.0 ℃，測(cè)得大豆異黃酮苷元（De、Gle、Ge） 的濃度分別為（36.954±1.67）、（5.119±0.275）、（38.643±2.03）μg/mL。

已有研究分別從大豆、鷹嘴豆、黃熱厭氧芽孢桿菌、土曲霉等[15，24-25]中提取β-葡萄糖苷酶，用以水解大豆異黃酮糖苷，并進(jìn)一步將其進(jìn)行固定化，結(jié)果顯示微生物來源的β-葡萄糖苷酶比植物來源的熱穩(wěn)定性更強(qiáng)，最適水解溫度更加寬泛，水解效果更好，且固定化β-葡萄糖苷酶相比之下提高了利用重復(fù)率，反應(yīng)過程更易控制。目前研究最廣泛水解大豆異黃酮糖苷的酶是β-葡萄糖苷酶，其次是半乳糖苷酶[26]，少數(shù)有機(jī)酸[27-28]也能水解大豆異黃酮，更多水解大豆異黃酮的方法有待進(jìn)一步研究。