趙 鳳， 李小義， 張效平， 楊 興， 蔣曉紅

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 水產(chǎn)研究所， 貴州 貴陽 550025)

傳統(tǒng)的發(fā)酵魚是將鮮魚處理后，整條或切塊、腌漬、風(fēng)干，配上輔料，自然條件下密封發(fā)酵而成。這樣制作的腌魚具有保質(zhì)期長、蛋白質(zhì)含量高、脂肪含量低、游離氨基酸種類多等特點。貴州黔東南苗族、侗族自治州的腌魚做法是，以稻田養(yǎng)殖的鯉魚為原料，剖開魚體，除去內(nèi)臟，腌制24 h左右，拌入糯米飯、香辛料、辣椒等輔料，層魚層輔料入壇，自然條件下避光發(fā)酵。腌魚味道鮮美、口感軟嫩，可以直接食用，也可以蒸、炸，是當(dāng)?shù)鼐用裾写腿说拿牢都央?。在國外，如日本、東南亞和非洲等地也有發(fā)酵魚產(chǎn)品的制作和食用習(xí)慣[1-3]。

由于發(fā)酵魚是在自然條件下發(fā)酵，環(huán)境條件、發(fā)酵魚種類、地區(qū)差異等導(dǎo)致產(chǎn)品中的微生物種群分布、菌落演替、結(jié)構(gòu)組成等各不相同[4]；而不同種類的微生物對產(chǎn)品的安全、感官、色澤、質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味等有主要影響，所以研究發(fā)酵魚產(chǎn)品中微生物群落結(jié)構(gòu)可以調(diào)控和提升產(chǎn)品的質(zhì)量。目前，國內(nèi)主要應(yīng)用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和生理生化實驗手段對發(fā)酵魚制品中的微生物進(jìn)行研究[5-6]，但是這種傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法有很大的局限性，比如分離的微生物不全面[7]，不能很好地展示產(chǎn)品中的菌相情況。高通量測序技術(shù)可以準(zhǔn)確快速地獲得大量的測序數(shù)據(jù)[8-9]，此方法具有對微生物不需要分離培養(yǎng)，可以檢測豐度很低的微生物，準(zhǔn)確而全面地展示樣品中的微生物群落情況等特點，被廣大研究者應(yīng)用在發(fā)酵食品中[10-12]。

目前，在食品發(fā)酵研究中，韓國學(xué)者利用高通量測序技術(shù)對海鮮醬、魚醬和泡菜[13-15]等的發(fā)酵微生物多樣性進(jìn)行了解析，國內(nèi)學(xué)者也利用此技術(shù)對腌干魚加工過程的微生物群落[16]和不同發(fā)酵工藝條件下微生物多樣性[17]進(jìn)行了分析，但是關(guān)于鱘魚發(fā)酵過程中微生物的演替規(guī)律和多樣性分析還未見報道。本實驗以傳統(tǒng)發(fā)酵鱘魚為研究對象，擬采用溴化十六烷三甲基銨(cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB)法提取總細(xì)菌DNA，基于Illumina HiSeq高通量測序平臺，利用雙末端測序(paired-end)的方法，對16S rDNA V4～V5區(qū)進(jìn)行測序；希望獲得發(fā)酵魚制品中細(xì)菌數(shù)量和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，揭示樣品微生物物種構(gòu)成以及不同發(fā)酵階段樣品之間的差異關(guān)系，旨在為傳統(tǒng)發(fā)酵鱘魚的制作者調(diào)控發(fā)酵環(huán)境和發(fā)酵工藝提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及處理

新鮮鱘魚，由貴州省水產(chǎn)研究所惠水養(yǎng)殖基地提供。

操作要點：取鮮活的鱘魚宰殺，去頭、去尾、去內(nèi)臟，取肉瀝干。將魚片切成每塊重20～30 g，添加魚塊重量3%的食鹽和各種香辛料(辣椒、花椒、姜等)，攪拌均勻，在4 ℃條件下腌制2 d；在50～60 ℃的條件下干燥3 h，干燥至水分含量約55%～60%，冷卻至室溫；在容器底部鋪上部分糯米粉，按一層魚一層糯米粉，壓緊，頂部鋪上一層糯米粉后夯實，加蓋、封嚴(yán)。20～24 ℃，對裝滿壇子的魚肉發(fā)酵5～6周，直至pH值達(dá)到4.1～4.4，制得即食休閑風(fēng)味發(fā)酵魚制品。

樣品采集：采集新鮮、腌制、發(fā)酵5，10，20，25 d和35 d 7個時期的鱘魚發(fā)酵樣品(編號分別為CX、CTA、CTB、TCC、CTD、CTE、CTF)，每個時期取3個樣品作為平行實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1DNA的提取與檢測

取樣品10 g，加入100 mL滅菌生理鹽水中，均質(zhì)拍打2 min 后，至4 ℃搖床震蕩30 min， 靜置10 min，取上清液離心，棄上清液備用。采用CTAB法對DNA進(jìn)行提取。分別使用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳判斷DNA樣品的濃度和純度。

1.2.2PCR擴(kuò)增及高通量測序

擴(kuò)增的目標(biāo)區(qū)域是16S rDNA基因的V4～V5區(qū)域，引物序列515F：GTGCCAGCMGCCGCGG，907R：CCGTCAATTCMTTTRAGTTT[18]。PCR反應(yīng)20 μL體系：10 μL 5×Primes STAR Buffer，1 μL DNA 模板，1 μL each primer (0.1 mol/L), 0.5 μL Primes STAR HS DNA polymerase。PCR 反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性1 min，98 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，27個循環(huán)，72 ℃完全延伸5 min。擴(kuò)增結(jié)束后，利用瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增效果。每個時間點采集3個平行樣品，樣品的PCR產(chǎn)物，送至廣州賽哲生物科技股份有限公司，在Illumina HiSeq平臺上進(jìn)行高通量測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

為獲得更為精準(zhǔn)、高質(zhì)量的生物學(xué)信息，需要對數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制。采用 Mothur 軟件將得到的16S rDNA基因序列在RDP(ribosomal database project)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行嵌合體檢驗，充分去除嵌合體序列。為了得到每個操作分類單元(OTU)對應(yīng)的物種分類信息，采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，用Mothur軟件構(gòu)建稀釋性曲線，利用QIIME軟件分析Alpha多樣性(Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)和ACE指數(shù))。用非加權(quán)組平均法構(gòu)建樹狀結(jié)構(gòu)，用于微生物群落相似度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鱘魚發(fā)酵樣品的微生物Alpha多樣性分析

利用稀釋曲線來評價測序量是否覆蓋所有類群，并間接反映樣品中物種的豐富度。通過OTU相對比例和數(shù)量的期望值繪制稀釋曲線，見圖1。圖1中曲線趨勢比較平緩，說明本次測序深度已基本覆蓋樣品中的所有物種，且能很好地體現(xiàn)樣品細(xì)菌的多樣性和分布，測序結(jié)果可代表鱘魚發(fā)酵樣品中細(xì)菌群落的真實情況。

圖1 OTU稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve of OTU

不同發(fā)酵階段的各個樣品的多樣性指數(shù)如表1。對測序進(jìn)行拼接、過濾，得到有效序列，7個不同發(fā)酵階段的鱘魚樣品平均獲得46 463條序列。將相似度97%的序列聚類為OTUs，其中CX、CTA、CTB、CTC、CTD、CTE和CTF各組的平均OTU數(shù)量分別為1 064、952、454、442、327、372和356。從表1中可以看出，起始階段細(xì)菌菌群的豐富度和多樣性明顯高于其他樣本，說明原料和發(fā)酵開始時細(xì)菌種類最為豐富，這些微生物可能來源于肉和腌制料中；一旦發(fā)酵啟動，細(xì)菌菌群的豐富度和多樣性迅速下降，說明大多數(shù)外源微生物因不能適應(yīng)環(huán)境，消失或生長暫時受到抑制。

2.2 鱘魚不同發(fā)酵時期的物種注釋

通過高通量測序得到7組不同發(fā)酵階段的鱘魚樣品在門水平上，共38門。門水平上鱘魚發(fā)酵樣品的菌群變化如圖2。從圖2中可以看出，細(xì)菌群落中門水平平均含量大于1%的是放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)。Proteobacteria的相對含量從新鮮鱘魚到發(fā)酵成熟逐漸降低；Firmicutes在腌制樣品中相對含量很低，但是發(fā)酵過程及結(jié)束時，豐度越來越大，成為優(yōu)勢菌屬。菌落變化主要原因可能是，隨著發(fā)酵時間延長，pH值降低，抑制了大量微生物繁殖，僅有少量適應(yīng)酸性環(huán)境的微生物生長。Firmicutes中很多藍(lán)藻細(xì)菌可以產(chǎn)生內(nèi)生孢子，孢子可以抵抗惡劣環(huán)境，所以在發(fā)酵中后期，F(xiàn)irmicutes的豐度最大[19]。藍(lán)藻門、擬桿菌門僅在鱘魚新鮮和腌制兩個階段檢測到，其他階段基本沒有。

使用平臺測序數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋，得到7組不同發(fā)酵階段鱘魚樣品在科水平上共196科。科水平上鱘魚發(fā)酵樣品菌群變化如圖3。從圖3中可以看出，細(xì)菌群落中門水平平均含量大于1%的是腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、腸球菌科(Enterococcaceae)、乳桿菌科(Lactobacillaceae)、 明串珠菌科(Leuconostocaceae)、 莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、 葡萄球菌科(Staphylococcaceae)和 鏈球菌科(Streptococceae) 。在整個發(fā)酵過程中葡萄球菌科(Staphylococcaceae)的相對含量先增高后降低，乳桿菌科(Lactobacillaceae)的相對含量逐漸升高。

表1 各樣品的生物群落豐富度和多樣性指數(shù)

Chao1 指數(shù)和 Shannon 指數(shù)值越高，說明群落物種的豐富度越高；Simpson 指數(shù)反映樣品的多樣性程度，Simpson值越大說明樣品群落多樣性越低。

圖2 門水平上鱘魚發(fā)酵樣品細(xì)菌群落變化Fig.2 Changes in bacterial community in sturgeon during fermentation at phylum level

圖3 科水平上鱘魚發(fā)酵樣品細(xì)菌群落變化Fig.3 Changes in bacterial community in sturgeon during fermentation at family level

熱圖可以用來表示在屬的水平上各樣本物種的相對豐度。使用豐度表格進(jìn)行豐度聚類熱圖的繪制，計算距離的方式是歐氏距離，聚類方式是用了最長距離法。對熱圖進(jìn)行column標(biāo)準(zhǔn)化，圖4為鱘魚發(fā)酵各樣品的聚類熱圖。

圖4 各樣本在屬水平的熱圖Fig.4 Heatmap of all samples at genus level

對鱘魚發(fā)酵樣本進(jìn)行樣品聚類和物種聚類分析(熱圖上側(cè)是樣本的聚類樹，左側(cè)是OTU的聚類樹)。圖4中，橫坐標(biāo)是樣本，縱坐標(biāo)是物種，顏色從藍(lán)到紅豐度越來越高。從圖中可以看出，大部分物種的相對豐度都比較低，只有少部分物種的相對豐度較高。在CX階段菌屬豐度大于1%的主要優(yōu)勢菌屬是葡萄球菌屬(Staphylococcus)，CTA階段屬豐度大部分小于1%，發(fā)酵初期CTB階段菌屬豐度大于1%的主要優(yōu)勢菌屬是葡萄球菌屬(Staphylococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、乳球菌屬(Lactobacillus)；發(fā)酵中期至結(jié)束，菌屬豐度大于1%的主要優(yōu)勢菌屬是明串珠菌屬(Leuconostos)、乳球菌屬(Lactococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和腸球菌屬(Enterococcus)。乳酸菌屬、葡萄球菌屬、腸桿菌屬等是水產(chǎn)品加工和保藏的優(yōu)勢菌屬，如李改燕[20]研究的糟魚發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬、葡萄球菌、乳酸菌和酵母菌；Kuda等[21]研究的日本發(fā)酵魚制品中的優(yōu)勢菌屬是乳酸菌和乳酸球菌屬；而本實驗結(jié)表明，葡萄球菌、明串菌屬、乳球菌屬、乳桿菌屬和乳酸球菌屬為整個發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌屬。這些研究結(jié)果的差異可能與發(fā)酵的產(chǎn)品組成和發(fā)酵參數(shù)的影響有關(guān)。乳酸球菌屬具有良好的生物安全性和益生特性，常作為益生菌而被應(yīng)用到發(fā)酵食品中[22]，本研究中，乳酸球菌在發(fā)酵的開始到結(jié)束一直保持著較高的豐度，與前者的研究結(jié)果類似。

2.3 鱘魚發(fā)酵不同階段樣品中細(xì)菌群落的比較

為比較發(fā)酵過程中每組樣本的細(xì)菌群落相似性，采用最長距離法對樣品進(jìn)行聚類分析(HCA)和主成分分析(PCA)，樣本間的距離越小說明樣本間的細(xì)菌群落越相似。

圖5 各組樣品的聚類分析和主成分分析Fig.5 HCA and PCA analysis of different groups

圖5為發(fā)酵樣品的聚類分析和主成分分析結(jié)果。從聚類分析結(jié)果可以看出，整個發(fā)酵過程中每個階段的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有較大差異，并且CX與其他樣本的細(xì)菌群落分別位于兩個不同的分支。PCA分析結(jié)果的二維主成分圖展示了各樣品在第一和第二主成分上面的投影，樣品間距離越遠(yuǎn)表示樣品的物種組成差異越大[23]。通常，當(dāng)?shù)谝恢鞒煞纸忉尦潭雀哂?0%，且第一和第二主成分的解釋程度高于90%時，同一組的樣品能較好地“聚”在一起。從圖5中可以看出，第一和第二主成分的解釋程度為93.4%，大于90%，說明樣品適合PCA分析。圖5中，PC1坐標(biāo)軸解釋了樣品細(xì)菌主成分差異的82.6%，在此方向上，CTB與其他所有組分群落組成差異較大，說明腌制對樣品的菌落組成影響較大；在PC2方向上，CX與CTF的距離最遠(yuǎn)，說明發(fā)酵成熟后，樣品的菌落組成發(fā)生了較大變化。CTA 、CTC、CTD和CTE的距離較近，說明其群落組成較相近，CTB、CX以及CTF之間的距離較遠(yuǎn)，說明群落組成差異較大。

2.4 鱘魚發(fā)酵不同時期樣品組間物質(zhì)差異性分析

圖6 各組樣品的Cladogram圖Fig.6 Cladogram analysis of different groups

差異性(LDA effect size，LEfSe)分析可以用于多個分組間的比較，也可實現(xiàn)組內(nèi)比較，以找出組間在豐富度上具有顯著性差異的物種。該分析方法強(qiáng)調(diào)統(tǒng)計意義及生物相關(guān)性，通過Kruskal- Wallis秩和檢驗及線性判別分析完成檢測[24]。對有詳細(xì)注釋和符合閾值篩選的差異微生物，繪制Cladogram圖，結(jié)果如圖6。從圖6中可以看出，各組的優(yōu)勢菌特征不同，其中CTC組的優(yōu)勢特征菌有 Listeriaceae，Carnobacteriaceae， Enterococcaceae，Pseudoalteromonadac和Vibrionales；CTD組的優(yōu)勢特征菌有Lactobacillaceae，Streptococcaceae，Lactobacillales和Bacilli；CTA組的優(yōu)勢特征菌有Rickettsiales，F(xiàn)lavobacteriia，Streptophyta，Chloroplast和ML635J21；CTF組的優(yōu)勢特征菌有Corynebacteiaceae，Actinomycetales和Actinobacteria；CX組的優(yōu)勢特征菌有Myxococcales，Enterobacteriales，Bacillales和Clostridiales；CTB組的優(yōu)勢特征菌有Leuconostocaeae和Erythrobacteraceae；CTE沒有找到特征菌，說明這組菌的豐度跟其他組有差異。

在進(jìn)化分支圖中，由內(nèi)至外輻射的圓圈代表了由門至種的分類級別。在不同分類級別上的每一個小圓圈代表該水平下的一種微生物，小圓圈直徑大小與相對豐度大小呈正比。無顯著差異的物種統(tǒng)一著色為黃色，每個圓圈顏色代表的分組如圖6左上角圖例所示。

3 結(jié) 論

運用HiSeq高通量測序技術(shù)對7個發(fā)酵階段的鱘魚中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：HiSeq高通量測序技術(shù)能充分反映樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及優(yōu)勢菌種；隨著糟制時間的延長，菌相差別越來越大，樣品豐富度越來越少，多樣性下降，均勻度變差，并且發(fā)現(xiàn)在傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵魚中細(xì)菌多樣性豐富，主要由38個門和196個科組成。

在門水平上，不同發(fā)酵時期的鱘魚細(xì)菌的群落分布主要為厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)。在新鮮鱘魚肉內(nèi)Firmicutes和Proteobacteria占的比例大致相同，各占35%左右，但是腌制過后，F(xiàn)irmicutes迅速下降，Cyanobacteria占優(yōu)勢；發(fā)酵開始后，F(xiàn)irmicutes占優(yōu)勢，而且比例越來越多；隨著發(fā)酵時間的延長，變形菌門的比例逐漸下降。樣品中Proteobacteria和Firmicutes的數(shù)量最多，原因是魚體本身攜帶的微生物大多數(shù)是革蘭氏陰性菌。

在科水平上，鮮魚中優(yōu)勢菌科為葡萄球菌科(Staphylococcaceae)和腸桿菌科(Enterobacteiaceae)，隨著發(fā)酵時間的延長，這兩個菌科的比例都逐漸下降。鏈球菌科(Streptococcaceae)隨著發(fā)酵時間的延長，在發(fā)酵中期成為優(yōu)勢菌科，占30%，到發(fā)酵后期雖有略微下降，但依然是優(yōu)勢菌科；明串珠菌科(Leuconostoceae)隨著發(fā)酵時間的延長，比例逐漸增大，在后期成為優(yōu)勢菌科。

LEfSe分析得出，不同樣品組間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在一定差異?；谛乱淮咄繙y序的宏基因組學(xué)分析，不僅可以快速準(zhǔn)確地分析鱘魚發(fā)酵過程中微生物群落的結(jié)構(gòu)，并且可確定各種微生物的豐度，對于研究發(fā)酵過程中微生物的動態(tài)變化具有重要應(yīng)用價值，希望這些微生物的演替規(guī)律可以為發(fā)酵魚的工業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)參考。