梅光明，常家琪，朱羽莊，嚴(yán) 國(guó)，孟春英

(浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021)

海產(chǎn)品是人體攝入砷的主要貢獻(xiàn)者[1-3]，特別是貝類、蟹類為砷元素的高富集品種。為了提高海產(chǎn)品的可口性，通常會(huì)對(duì)其進(jìn)行烹飪加工，不同的加工方式有可能會(huì)使產(chǎn)品中的砷含量及形態(tài)發(fā)生變化，造成毒性降低或產(chǎn)生毒性更大的化合物[4]。有研究報(bào)道無毒的砷糖在一些人為條件下可轉(zhuǎn)化為二甲基砷酸、二乙基砷酰乙醇等毒性較強(qiáng)的砷化合物[5]。ICHIKAWA,et al 等[6]研究發(fā)現(xiàn)樣品經(jīng)過浸泡、蒸煮等步驟就能去除約90%的砷；SARTAL,et al[1]對(duì)煮熟海藻樣品、烹飪水以及模擬體外消化獲得的熟海藻透析液定量定性研究發(fā)現(xiàn)，海藻樣品中的部分砷會(huì)在烹飪過程中從海藻基質(zhì)移出并釋放到水中，不同砷化合物在不同品種海藻中的透析性或溶解性有所差異。因此科學(xué)評(píng)價(jià)海產(chǎn)品中砷污染帶來的健康影響程度，一方面需要對(duì)其進(jìn)行砷污染狀況測(cè)定，另一方面還要關(guān)注樣品中砷化合物的生物可給性和生物利用度研究。生物可給性指從胃腸道中的基質(zhì)中釋放出類可用于腸吸收的部分，生物利用度指的是能夠到達(dá)全身循環(huán)代謝的外部劑量。生物可給性可以通過體外或者體內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)是研究污染物生物可給性的主要評(píng)價(jià)方法[7-8]。采用與人體結(jié)構(gòu)相似的動(dòng)物模型進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一般被認(rèn)為是準(zhǔn)確可靠的，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)因其所需周期長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)成本高、不可控因子多等因素導(dǎo)致其應(yīng)用受到限制[9-10]。體外環(huán)境模擬實(shí)驗(yàn)成為研究污染物在人體生物有效性的又一有效方法，該方法因具有簡(jiǎn)單易操作、可重現(xiàn)性良好、精確度高且實(shí)驗(yàn)成本低等優(yōu)點(diǎn)而獲得廣泛應(yīng)用[11-14]。本實(shí)驗(yàn)以砷元素富集能力較強(qiáng)的厚殼貽貝Mytilus coruscus 和三疣梭子蟹Portunus trituberculatus 為研究對(duì)象，采用體外仿生消化模擬實(shí)驗(yàn)，分別對(duì)原料樣品、蒸煮樣品、蒸煮水和胃腸仿生消化處理樣品中的總砷及砷形態(tài)進(jìn)行定量與定性測(cè)定，初步探討食品加工處理和胃腸消化下砷元素化合物轉(zhuǎn)化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梭子蟹和貽貝均購(gòu)于浙江舟山豐茂菜場(chǎng)，正值上市銷售的健康鮮活品。三疣梭子蟹規(guī)格為300～400 g/只，厚殼貽貝殼長(zhǎng)8～9 cm/粒。

砷甜菜堿AsB 溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW 08670)、一甲基砷MMA 溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW 08668)、二甲基砷DMA 溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW 08669)、砷酸根As(Ⅴ)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW 08667)、亞砷酸根As(Ⅲ)溶液(GBW 08666)，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；砷單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg·mL-1，GSB04-1714-2004)，國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；大蝦粉(GBW10050)生物成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、紫菜粉(GBW10023)生物成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，地球物理地球化學(xué)勘查研究所；BCR-627 金槍魚組織中砷不同形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，歐洲標(biāo)準(zhǔn)局；碳酸銨，德國(guó)Sigma 公司；正己烷(色譜純)，德國(guó)Merck 公司；濃硝酸(農(nóng)殘級(jí))，美國(guó)J.T.Baker 公司；濃鹽酸、氨水，均為優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；質(zhì)譜調(diào)諧液(10 μg·L-1Ce、Co、Li、Tl、Y)和內(nèi)標(biāo)溶液(100 μg·mL-1Rh)，美國(guó)Agilent 公司；PIPES(哌嗪-1,4-雙(2-乙磺酸)二鈉鹽)，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；膽酸鈉和脫氧膽酸鈉，東京化成工業(yè)株式會(huì)社；胰液素(CFAD-P1750，來源于豬胰腺) 和胃蛋白酶(CFADP7012)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q 制備超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm)。

1.2 儀器與設(shè)備

AcquityTM H-class 液相色譜儀，美國(guó)Waters 公司；7900 型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent 公司；Centrifuge 5810 高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；MS2 漩渦混合器，德國(guó)IK 公司；AL204 型電子天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；pH 計(jì)，德國(guó)Sartorius 公司；ETHOS 1 型微波消解儀，附有聚四氟乙烯消解罐，意大利Milestone 公司；EH20A plus 型微控?cái)?shù)顯電熱板，北京菜伯泰科儀器股份有限公司；氣浴恒溫振蕩器，江蘇常州國(guó)華電器公司；FreeZone 型冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Labconco 公司；Spectra/pro 6 Dialysis Menbrane(10 KD)，美國(guó)Spectrum Laboratories 公司；Dionex IonPac As19 陰離子交換柱(250 mm×4 mm×10 μm)及保護(hù)住(50 mm×4 mm)，美國(guó)Thermo 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶液配制

透析溶液：稱量PIPES(哌嗪-1,4-雙(2-乙磺酸)二鈉鹽)5.194 8 g，超純水定容至100 mL。

模擬新鮮胃液：準(zhǔn)確稱量0.3 g(精確至0.01 g)胃蛋白酶，用0.1 M 硝酸定容至5 mL。

模擬新鮮腸液：準(zhǔn)確稱取胰液素0.4 g，膽酸鈉和脫氧膽酸鈉各1.25 g，均溶于0.1 M 碳酸氫鈉溶液中，超聲均勻后用0.1 M 碳酸氫鈉溶液定容至100 mL。

1.3.2 樣品制備

1.3.2.1 原料樣品制備

按照《GB/T 30891-2014 水產(chǎn)品抽樣規(guī)范》[15]采集樣品并處理后作為原料樣品。

1.3.2.2 樣品的蒸煮過程

將約1 kg 的梭子蟹(整蟹)置于煮鍋內(nèi)，鍋內(nèi)添加2 000 mL 超純水，電磁爐功率設(shè)置2 000 W，進(jìn)行梭子蟹蒸煮(3～5 min)。1 kg 貽貝蒸煮過程同上，時(shí)間控制5～8 min。兩種樣品的蒸煮水經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾后儲(chǔ)存聚乙烯瓶中保存。

1.3.2.3 樣品的干燥

取上述煮熟后的梭子蟹和貽貝取可食組織后用研缽充分研細(xì)得到均勻樣品(稱煮熟樣品)，和原料樣品一起經(jīng)冷凍干燥36 h 后取出，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.4 胃腸仿生消化處理

準(zhǔn)確稱量0.5 g（精確至0.000 1 g）置于100 mL 錐形瓶中，加入20 mL 超純水充分振搖15 min 后用6 mol·L-1的HCl 調(diào)節(jié)溶液pH 至2.0。加入模擬新鮮胃液0.15 g，振搖均勻后用保鮮膜將錐形瓶封口，置于150 r·min-1、37 ℃恒溫條件的氣浴搖床孵育2 h。取出后于冰水浴中放置10～15 min 進(jìn)行停止酶反應(yīng)。溶液恢復(fù)至室溫后，準(zhǔn)確移取5 mL 模擬新鮮腸液加入上述錐形瓶?jī)?nèi)，同時(shí)在10 KD 透析袋內(nèi)加入20 mL 透析溶液后用專用封口夾將其兩端緊封后置于錐形瓶?jī)?nèi)，然后再次將錐形瓶置于150 r·min-1、37 ℃恒溫條件的氣浴搖床孵育2 h，取出后冰水浴10～15 min 停止酶反應(yīng)。用超純水沖洗透析袋表面后，將里面透析液轉(zhuǎn)移至聚乙烯瓶中并稱重，得到透析樣品，置于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 總砷測(cè)定前處理

準(zhǔn)確稱量0.2 g（精確至0.000 1 g）冷凍干燥過的樣品于聚四氟乙烯消解罐中，依次加入6.0 mL 硝酸、2.0 mL 過氧化氫溶液，搖勻后加蓋放置過夜，使樣品進(jìn)行預(yù)消解。次日將消解罐放入微波消解系統(tǒng)中，設(shè)置適宜的微波消解程序（表1），按照相關(guān)消解步驟進(jìn)行消解。消解完畢后，170～180 ℃下于趕酸架上加熱趕酸至1～2 mL，冷卻至室溫后用超純水定容至50 mL，采用ICP-MS 上機(jī)測(cè)定。同時(shí)做試劑空白實(shí)驗(yàn)，采用大蝦粉和紫菜粉作為質(zhì)控樣進(jìn)行結(jié)果質(zhì)量控制。

蒸煮水樣品的總砷含量測(cè)定參照《HJ 700-2014 水質(zhì)65 種元素的測(cè)定 電感耦合等離子體質(zhì)譜法》[16]中的前處理進(jìn)行。

表1 微波消解程序Tab.1 Microwave digestion procedure

1.3.4 砷形態(tài)前處理

準(zhǔn)確稱量0.25 g（精確至0.000 1 g）冷凍干燥后的待測(cè)樣品于50 mL 離心管中，加入20 mL 0.15 mol·L-1硝酸溶液，3 000 r·min-1渦旋1 min，置于氣浴恒溫振蕩器中(50 ℃、150 r·min-1)，過夜振蕩提取，提取完畢后次日取出，冷卻至室溫，3 000 r·min-1渦旋30 s，6 000 r·min-1離心8 min。移取5 mL 上清液于15 mL 離心管中，加入正己烷3 mL，3 000 r·min-1渦旋1 min 后再6 000 r·min-1離心8 min，棄去上方正己烷層。吸取下層清液，經(jīng)0.22 μm 水相濾膜過濾后進(jìn)行HPLC-ICP-MS 分析。按相同操作方法做試劑空白實(shí)驗(yàn)，同時(shí)采用樣品加標(biāo)計(jì)算回收率。

蒸煮水樣品直接經(jīng)0.22 μm 水相濾膜過濾后進(jìn)行HPLC-ICP-MS 分析。

1.3.5 測(cè)定方法

1.3.5.1 總砷含量測(cè)定

使用1.0 μg·L-1Ce、Co、Li、Tl、Y 的調(diào)諧液在線優(yōu)化ICP-MS 各項(xiàng)參數(shù)，使分辨率和靈敏度等各項(xiàng)儀器性能達(dá)到最佳?？偵楹繙y(cè)定時(shí)采用1.0 μg·mL-1103Rh 溶液在線加入內(nèi)標(biāo)，用于校正儀器響應(yīng)信號(hào)的變化。優(yōu)化后ICP-MS 的主要參數(shù)見表2。將砷元素標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液從低濃度到高濃度依次于ICP-MS 中進(jìn)樣，測(cè)定相應(yīng)的信號(hào)值。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的信號(hào)值(CPS 計(jì)數(shù))為縱坐標(biāo)，儀器自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品濃度與相應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度成正比。采用外標(biāo)法定量分別測(cè)定總砷含量。

表2 ICP-MS 主要參數(shù)Tab.2 The major parameters of ICP-MS

同時(shí)用大蝦粉（GBW10023）和紫菜粉（GBW10050）生物成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)驗(yàn)證樣品總砷含量測(cè)定方法的準(zhǔn)確性。兩種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值、測(cè)定值和RSD 值見表3。由表3 可知，2 種質(zhì)控樣品總砷含量測(cè)定值都在標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi)說明該方法準(zhǔn)確度高、精密度好。

表3 質(zhì)控樣品總砷含量水平的測(cè)定(n=8)Tab.3 Determination of total arsenic levels in quality control samples(n=8)

1.3.5.2 砷形態(tài)的測(cè)定

色譜條件：Dionex IonPac As19 陰離子交換柱(250 mm×4 mm×10 μm)及保護(hù)柱(50 mm×4 mm)；進(jìn)樣量50 μL；樣品室溫度10 ℃，柱溫40 ℃；流動(dòng)相為50 mmol·L-1、pH=9.5 的碳酸銨溶液；等度洗脫；流速1.0 ml·min-1。

質(zhì)譜條件：采用具有同心霧化器的電感耦合等離子體質(zhì)譜儀；選擇元素75As；m/z 75；采集模式：TRA模式；As 積分時(shí)間：0.3 s；蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速：0.5 r·s-1

砷形態(tài)測(cè)定方法的準(zhǔn)確度用BCR-627 金槍魚組織中砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來驗(yàn)證。準(zhǔn)確稱量BCR-627 金槍魚組織中砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.5 g，其中含砷甜菜堿參考值為3.9±0.225 mg·kg-1，二甲基砷含量參考值0.15±0.022 5 mg·kg-1。按照本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行的6 次平行測(cè)定結(jié)果為：砷甜菜堿含量范圍為3.794～4.056 mg·kg-1，二甲基砷測(cè)定值范圍0.132 8～0.167 4 mg·kg-1，相對(duì)偏差分別為4.2%和4.6%，均在參考值范圍內(nèi)，說明本方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度高。

2 結(jié)果與討論

2.1 用ICP-MS 測(cè)定樣品中的總砷

通過ICP-MS 分別測(cè)定未經(jīng)加工的貽貝和梭子蟹樣品原料樣品、二者煮熟樣品、蒸煮水和胃腸模擬消化液處理樣品的總砷含量。未經(jīng)加工的原始樣品中貽貝含砷量為11.36±1.8 mg·kg-1，梭子蟹總砷含量為78.97±3.7 mg·kg-1；煮熟樣品中貽貝的砷含量為10.47±0.3 mg·kg-1，梭子蟹的砷含量為73.37±1.4 mg·kg-1（考慮到烹飪過程中的質(zhì)量損失，結(jié)果表示均以干重計(jì)）。對(duì)貽貝和梭子蟹的蒸煮水中總砷含量測(cè)定值分別為1.56±0.11 mg·kg-1和4.81±0.6 mg·kg-1。結(jié)果表明在蒸煮加熱過程中，貽貝樣品中13.7%±1.62%的總砷量和梭子蟹樣品中6.1%±0.92%的總砷量從樣品中轉(zhuǎn)移至蒸煮水中。在靜態(tài)體外胃腸模擬消化實(shí)驗(yàn)中，獲得的貽貝透析樣品總砷含量為0.24±0.06 mg·kg-1，梭子蟹透析樣品總砷含量為2.59±0.13 mg·kg-1。該結(jié)果表明煮熟的貽貝樣品中大約2.3%±0.47%的總砷量是可以經(jīng)過透析袋，煮熟的梭子蟹樣品中大約3.5%±0.75%的總砷量可透析。

圖1 貽貝和梭子蟹原樣、煮熟樣品、蒸煮液和模擬體外胃腸消化后獲得的透析樣品中總砷測(cè)定Fig.1 Total arsenic contents of mussels and crab in raw materials,cooked samples,cooking fluids and dialysis after vitro gastrointestinal digestion

2.2 通過陰離子交換HPLC-ICP-MS 分析砷形態(tài)

圖3 為梭子蟹和貽貝未經(jīng)加工時(shí)的原料樣品中的砷形態(tài)HPLC-ICP-MS 測(cè)定圖譜。與5 種砷化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(圖2)進(jìn)行對(duì)比后，發(fā)現(xiàn)梭子蟹原始樣品中砷元素存在形態(tài)以AsB 為主，含少量DMA；貽貝樣品中含有4 種砷化合物，含量大小為AsB>MMA>As(Ⅴ)>DMA。

圖2 5 種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of five arsenic speciation standard solution

圖3 HPLC-ICP-MS 測(cè)定梭子蟹原始樣品(左)和貽貝原始樣品(右)中的砷形態(tài)洗脫曲線Fig.3 Elution profiles of As species of mussels and crabs in raw by anion-exchange HPLC-ICP-MS

圖4 為梭子蟹和貽貝煮熟樣品中砷化合物的HPLC-ICP-MS 測(cè)定圖譜。從圖中發(fā)現(xiàn)，貽貝經(jīng)過蒸煮過程后并未引起砷形態(tài)的改變，其砷形態(tài)種類與未蒸煮前相同；但梭子蟹蒸煮后，除AsB 外，有微量As(Ⅴ)檢出。圖3 和圖4 比較可以看出，熱處理過程幾乎不會(huì)引起貽貝樣品中砷形態(tài)的變化，但對(duì)梭子蟹產(chǎn)生了較小影響。

圖5 顯示了兩種不同樣品進(jìn)行蒸煮后得到的蒸煮水中砷形態(tài)的HPLC-ICP-MS 測(cè)定圖譜。在蒸煮過程中，砷化合物被釋放到蒸煮水中，圖4 和圖5 比較發(fā)現(xiàn)，二者蒸煮水中的砷化合物種類與煮熟樣品中發(fā)現(xiàn)的相同，以AsB 含量為主。

接著對(duì)梭子蟹和貽貝煮熟樣品進(jìn)行體外胃腸模擬消化后獲得的透析樣品進(jìn)行砷形態(tài)定性研究。圖6是透析樣品的砷元素HPLC-ICP-MS 測(cè)定圖譜，結(jié)果表明體外胃腸模擬消化過程中沒有引起梭子蟹砷形態(tài)變化。而在貽貝透析樣品中，新出現(xiàn)一未知形態(tài)的砷峰。

圖4 HPLC-ICP-MS 測(cè)定梭子蟹(左)和貽貝(右)煮熟樣品中的砷形態(tài)分布曲線Fig.4 Elution profiles of As species of cooked mussels and crabs by anion-exchange HPLC-ICP-MS

圖5 HPLC-ICP-MS 測(cè)定梭子蟹(左)和貽貝(右)蒸煮水中的砷形態(tài)洗脫曲線Fig.5 Elution profiles of As species in the cooking water of mussels and crabs by anion-exchange HPLC-ICP-MS

圖6 HPLC-ICP-MS 測(cè)定梭子蟹(左)和貽貝(右)煮熟樣品透析液中砷形態(tài)分布曲線Fig.6 Elution profiles of As species in the in-vitro obtained dialysates of cooked mussels and crabs by anion-exchange HPLC-ICP-MS

表4 為梭子蟹和貽貝原始樣品、蒸煮樣品、蒸煮水以及透析樣品中5 種砷化合物的測(cè)定色譜峰面積相對(duì)百分比情況。結(jié)果表明AsB 作為梭子蟹和貽貝中含量最高的砷化合物，經(jīng)過蒸煮、胃腸模擬消化和透析后，AsB 仍是所有樣品中含量最高的砷形態(tài)物，其它砷形態(tài)物分布占比情況有所差別。AsB 是煮熟貽貝透析液中含量最高的砷形態(tài)，但透析液中As(Ⅴ)和MMA 增加了其相對(duì)面積百分比，AsB 和DMA 相對(duì)百分比減少，這表明在貽貝樣品中，DMA 相對(duì)As(Ⅴ)和MMA 的溶解性差或者透析性低。梭子蟹中砷化合物也始終以AsB 為主，其面積相對(duì)百分比均大于99%。梭子蟹原始樣品中有少量的DMA 檢出，而在煮熟樣品和透析樣品中均沒有檢出DMA，而產(chǎn)生了微量的As(Ⅴ)，在梭子蟹蒸煮水中僅檢測(cè)出AsB。研究結(jié)果表明，加熱蒸煮、胃腸模擬消化和透析等過程對(duì)樣品中的砷形態(tài)物改變影響不顯著。

表4 原始樣品、煮熟樣品、蒸煮水和煮熟樣品透析液中砷形態(tài)的相對(duì)面積百分比(n=8)Tab.4 Relative area percentages of arsenic species in raw samples,cooked samples,cooking water and dialysates of cooking samples(n=8)

3 結(jié)論

通過建立靜態(tài)體外胃腸模擬實(shí)驗(yàn)，分別對(duì)梭子蟹和貽貝原料樣品、蒸煮樣品、蒸煮水和蒸煮樣品經(jīng)胃腸模擬消化及透析后的樣品中砷形態(tài)分布特征進(jìn)行定量與定性研究。結(jié)果顯示貽貝樣品中13.7%±1.62%的總砷和梭子蟹樣品中6.1%±0.92%的總砷量在蒸煮過程中可以從樣品基質(zhì)轉(zhuǎn)移并釋放到蒸煮水中；煮熟的貽貝樣品經(jīng)模擬胃腸消化液處理后有2.3%±0.47%的總砷量和煮熟的梭子蟹樣品經(jīng)模擬胃腸消化液處理后有3.5%±0.75%的總砷量可透析并最終可能參與人體循環(huán)代謝；定性研究發(fā)現(xiàn)，加熱蒸煮和胃腸模擬消化等過程對(duì)樣品中的砷形態(tài)物種類及含量影響改變不顯著。