王 旭，王丹生，羅永成

(遼東學院農(nóng)學院，遼東學院海岸帶生物技術(shù)研究所，遼寧丹東 118003)

水霉病具有高度傳染性，發(fā)病率及死亡率高，各種淡水成魚、稚魚和魚卵都可發(fā)生，是淡水養(yǎng)殖魚類的世界性病害[1]。該病病原為水霉屬真菌[2]。其中，寄生水霉Saprolegnia parasitica 是目前已發(fā)現(xiàn)的致病水霉中最為重要的病原菌，其孢子萌發(fā)快，侵襲能力強，幾乎能夠感染包括鯽、斑馬魚、鱘及鱸魚等在內(nèi)的所有淡水魚類及卵[3-6]?？兹甘G曾是治療水霉病最有效的化學試劑，但因其強致畸、致癌及高殘留，已被禁止使用。目前水霉病防治主要采用抗生素、殺菌劑、中草藥和氧化劑等[7-13]。這些方法易造成水霉的耐藥性，且存在效果不明顯、成本高，使用受限，有效濃度超出安全限量等問題[14]。研究表明，一些微生物來源的活性成分可以抑制真菌的生長和感染，且具有綠色、環(huán)保、安全、高效的優(yōu)點[15-17]。本試驗以寄生水霉為靶標菌，通過平板對峙培養(yǎng)篩選對水霉生長具有抑制作用的菌株，并對其安全性和抑菌穩(wěn)定性進行初步分析，以期為水霉病的生物防治提供優(yōu)良菌種資源和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

寄生水霉菌株SMJ-1、SMJ-2、SMJ-3、SMJ-4 分別由筆者分離自遼寧省東港市淡水養(yǎng)殖池塘的散鱗鏡鯉Cyprinus carpio var.specularis、彭澤鯽Carassius auratus var.pengze、大鱗副泥鰍Paramisgurnus dabryanus 的發(fā)病組織及散鱗鏡鯉魚卵。經(jīng)純化、致病性測定和分子鑒定，確定其均為寄生水霉。待篩選菌株為筆者分離自丹東地區(qū)淡水養(yǎng)殖池塘周圍土壤樣品中的21 株放線菌。所有菌株均保存于遼東學院農(nóng)學院微生物工程實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、瓊脂20.0 g、水1 000 mL，自然pH 值，用于寄生水霉的培養(yǎng)和平板對峙試驗；高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20.0 g，硝酸鉀1.0 g，氯化鈉0.5 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂20.0 g，水1 000 mL，pH 7.2，用于放線菌傳代培養(yǎng)；ISP1 培養(yǎng)基：酪蛋白胨5 g，酵母提取物3，pH 6.8～7.2，用于拮抗菌液體培養(yǎng)。

1.1.3 試驗用魚

試驗用散鱗鏡鯉、彭澤鯽和大鱗副泥鰍稚魚由丹東市水產(chǎn)科學研究所提供。其中，散鱗鏡鯉平均體長4.45±0.75 cm、體質(zhì)量2.08±0.43 g，彭澤鯽平均體長4.82±0.57 cm、體質(zhì)量1.64±0.36 g，大鱗副泥鰍平均體長9.54±0.52 cm、體質(zhì)量8.33±1.51 g。

1.1.4 主要試劑

Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR、Premix Taq Version 2.0 (Loading dye mix)、DNA Marker(DL-2000)購自寶生物工程(大連)有限公司，引物1492R/27F(1492R：5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’；27F：5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌篩選

采用平板對峙法進行初篩，將活化后的寄生水霉用直徑0.6 cm 的無菌打孔器制備菌餅，接種于PDA平板中央，18 ℃培養(yǎng)24 h 后，采用十字交叉法，在距離靶標菌餅2 cm 處對稱接種待篩選菌株，以不接菌一側(cè)為對照。置于18 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至對照一側(cè)長滿平板后測量抑菌帶寬度，確定待篩菌株的抑菌效果。

采用發(fā)酵液抑菌試驗確定其抑菌率，將初篩所得拮抗菌接種于裝量為40%的ISP1 液體培養(yǎng)基中，28 ℃發(fā)酵72 h。發(fā)酵液經(jīng)微孔濾膜(孔徑0.22 μm)過濾后，按照1 :5 的比例與55 ℃的PDA 培養(yǎng)基混合均勻，制備平板。冷卻后，在平板中央接種寄生水霉菌餅，設(shè)無菌水為對照，每個處理3 次重復(fù)，于18 ℃培養(yǎng)至對照長滿平板后，測量各處理的菌落直徑，計算抑菌率。抑菌率(%)=(對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑/對照菌落生長直徑)×100。

1.2.2 拮抗菌鑒定

拮抗菌形態(tài)特征測定參照文獻[18-19]的方法進行。拮抗菌16S rRNA 基因序列分析方法如下：將待測菌株接種在高氏一號平板培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3 d，用滅菌的槍頭刮取適量菌體置于50 μL 菌體裂解液Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR 中，80 ℃水浴15 min，5 000 r·min-1離心5 min，取上清液作為PCR 模板。選用通用引物27F：5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’和1492R：5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’進行16SrRNA 基因擴增。擴增體系為：1×Taq PCR Master Mix 25 μL，DNA 模板2 μL (1～10 ng)，引物(10 μmol·L-1)各1 μL，ddH2O 21 μL。PCR 反應(yīng)程序為：94 ℃，4 min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，2 min，30 個循環(huán)；72 ℃，10 min，4 ℃終止反應(yīng)。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，由生工生物工程(上海)有限公司進行純化、測序拼接。獲得的基因序列在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)進行Blast 檢測，下載同源性較高的菌種序列，用Clustal X 2.0 程序進行多重序列比對，利用MEGA 7.0 軟件的鄰接法(Neighbor-joining method)進行1 000 次步長計算，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[20]。

1.2.3 拮抗菌安全性測定

拮抗菌發(fā)酵濾液的制備方法同1.2.1。試驗用魚室內(nèi)暫養(yǎng)7 d 后進行試驗。每種魚分別設(shè)置實驗組和對照組，每組設(shè)置3 個重復(fù)，每個重復(fù)選取30 尾稚魚。實驗組加入拮抗菌發(fā)酵濾液原液(與水體體積比為1 :10)，對照組加入等量滅菌的ISP1 培養(yǎng)基。試驗期間水溫(24±2) ℃，充氣使溶解氧不低于6 mg·L-1，氨氮和亞硝酸鹽濃度不高于0.1 mg·L-1，光周期為自然周期，7 d 后統(tǒng)計稚魚存活率，根據(jù)稚魚存活率分析拮抗菌的安全性。

1.2.4 拮抗菌傳代穩(wěn)定性測定

拮抗菌株于高氏一號培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)，每48 h 轉(zhuǎn)接1 次，連續(xù)傳代10 次，每個處理3 次重復(fù)。平板對峙試驗測定出發(fā)菌株與傳代菌株對寄生水霉的抑菌效果，根據(jù)抑菌帶寬度變化分析傳代對拮抗菌抑菌效果的影響。

1.2.5 拮抗菌發(fā)酵液熱穩(wěn)定性測定

拮抗菌發(fā)酵采用ISP1 液體培養(yǎng)基，以5%的接種量，將拮抗菌菌液接種于裝量為40%的500 mL 三角瓶中，28 ℃，120 r·min-1，培養(yǎng)72 h。發(fā)酵液采用微孔濾膜(孔徑0.22 μm)過濾，濾液4 ℃冷藏備用。

各取發(fā)酵濾液15 mL 分別加入到20 mL 直口離心管中，置于10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃下處理2 h。之后按照1 :5 的比例，將處理后的發(fā)酵濾液分別與滅菌后冷卻至55 ℃的PDA 培養(yǎng)基混合均勻制備平板。每個平板中央接種寄生水霉菌餅，每個處理重復(fù)3 次，設(shè)無菌水為對照18 ℃培養(yǎng)至對照長滿平板后，測量各處理菌落直徑，計算抑菌率，分析不同溫度處理對試驗菌株發(fā)酵濾液抑菌活性的影響。

1.2.6 拮抗菌發(fā)酵液酸堿穩(wěn)定性測定

拮抗菌發(fā)酵濾液的制備方法同1.2.5。各取發(fā)酵濾液15 mL 分別加入到20 mL 直口離心管中，用1 mol·L-1HCl 和1 mol·L-1NaOH 分別調(diào)整pH 至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，室溫靜置24 h 后，將各管中的pH調(diào)回至未經(jīng)處理的發(fā)酵濾液pH 6.8。之后按照1 :5 的比例，將處理后的發(fā)酵濾液分別與滅菌后冷卻至55 ℃的PDA 培養(yǎng)基混合均勻制備平板。每個平板中央接種寄生水霉菌餅，每個處理重復(fù)3 次，18 ℃培養(yǎng)至對照長滿平板后，測量各處理菌落直徑，計算抑菌率，分析不同pH 處理對試驗菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌篩選

平板對峙試驗結(jié)果顯示，菌株FX11 對4 株不同來源的寄生水霉菌株SMJ-1、SMJ-2、SMJ-3、SMJ-4均表現(xiàn)出明顯拮抗作用，其中抑菌帶平均寬度最大為18.30±1.52 mm，見圖1。發(fā)酵液抑菌試驗結(jié)果顯示，菌株FX11 的抑菌率為68.40%。

2.2 拮抗菌鑒定

2.2.1 拮抗菌FX11 的形態(tài)特征

菌株FX11 在高氏一號培養(yǎng)基上菌落微黃色、干燥，基內(nèi)菌絲淺黃色，氣生菌絲黃白色，無可溶性色素，見圖2。孢子絲直、長。分生孢子柱形或卵圓形，表面光滑，見圖3、4。對照《放線菌的分類與鑒定》和《鏈霉菌鑒定手冊》，菌株FX11 的形態(tài)與鏈霉菌屬Streptomyces 特征一致。

圖1 菌株FX11 對寄生水霉的拮抗作用Fig.1 Antagonistic activity of strain FX11 against S.parasitica

圖2 菌株FX11 的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of strain FX11

圖3 菌株FX11 的孢子絲(×1000)Fig.3 Spore hypha of strain FX11 (×1000)

圖4 菌株FX11 的分生孢子(×1000)Fig.4 Conidiospore of strain FX11 (×1000)

2.2.2 拮抗菌FX11 的16S rRNA 基因序列分析

以菌株FX11 的基因組DNA 為模板，1492R/27F為通用引物，經(jīng)PCR 擴增、測序獲得長度為1 183 bp的堿基序列(GenBank accession number：MN759326)。所測序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行Blast 檢索，結(jié)果顯示該菌株與Streptomyces polychromogenes 的16S rRNA 基因序列相似性為98%。選取并下載典型菌株序列，以小單孢菌屬種類Micromonospora viridifaciens為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果如圖5 所示，菌株FX11 與Streptomyces polychromogenes 聚類在一個分支上，結(jié)合其形態(tài)結(jié)構(gòu)特征的初步鑒定結(jié)果，菌株FX11 鑒定為Streptomyces polychromogenes。

圖5 基于菌株FX11 的16S rRNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of strain FX11 and related species

2.3 拮抗菌FX11 的安全性測定

拮抗菌FX11 的發(fā)酵濾液與散鱗鏡鯉、彭澤鯽、大鱗副泥鰍稚魚共同培養(yǎng)7 d 后，統(tǒng)計存活率。結(jié)果顯示，3 種稚魚的實驗組和對照組存活率均無顯著差異(P>0.05)，可見拮抗菌FX11 的發(fā)酵產(chǎn)物對試驗用魚沒有毒性，具有良好的安全性，見圖6。

圖6 菌株FX11 的發(fā)酵濾液對試驗用魚存活率的影響Fig.6 Effects of fermentation filtrate of strain FX11 on survival rate

2.4 拮抗菌傳代穩(wěn)定性測定

拮抗菌株FX11 和其傳代菌株分別與寄生水霉進行平板對峙培養(yǎng)，結(jié)果見表1，拮抗菌FX11 繼代培養(yǎng)菌株與出發(fā)菌株之間抑菌效果差異不顯著(P>0.05)，可見該拮抗菌抑菌效果傳代穩(wěn)定。

表1 FX11 及其繼代培養(yǎng)菌株對寄生水霉的抑制作用Tab.1 Inhibitory effect of FX11 and its subculture strains on S.parasitica

2.5 溫度變化對拮抗菌發(fā)酵液抑菌活性的影響

溫度變化對菌株FX11 發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性的影響結(jié)果見圖7，10～70 ℃范圍內(nèi)處理的樣品其抑菌活性無顯著性差異(P>0.05)，表明溫度變化對菌株FX11 發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)的活性沒有影響，該菌株發(fā)酵液對溫度變化具有良好的耐受性。

2.6 拮抗菌發(fā)酵液酸堿穩(wěn)定性

pH 變化對FX11 發(fā)酵液抑菌活性的影響結(jié)果見圖8，試驗菌株發(fā)酵濾液的抑菌活性對酸堿度變化較為敏感，pH 值低于6.0 或高于8.0，抑菌率顯著下降，僅在Ph 6.0～8.0 范圍內(nèi)抑菌活性較為穩(wěn)定，表明菌株FX11 發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的活性受pH 影響較大，在pH 6.0～8.0 范圍內(nèi)抑菌作用穩(wěn)定。

圖7 不同溫度處理對拮抗菌FX11 發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.7 Effects of different temperature treatments on antibacterial activity of FX11 fermentation broth

圖8 不同酸堿度處理對拮抗菌FX11 發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.8 Effects of different pH treatments on antibacterial activity of FX11 fermentation broth

3 討論

以化學藥物、抗生素、疫苗及中草藥等方法防治水霉病存在各自的缺點和不足。利用拮抗菌及其發(fā)酵產(chǎn)物對水霉病進行防治具有綠色、環(huán)保、安全、高效的優(yōu)點，已成為水霉病防控研究的主流方向[3]。研究表明，一些細菌如芽孢桿菌Bacillus 和放線菌Actinomyces 對水霉菌具有良好的抑制作用。張書俊等[21]篩選獲得一株對水霉菌菌絲體生長與孢子萌發(fā)具有明顯抑制作用的粘質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens 菌株LD038。賀鳳等[22]從海底沉積物中分離、篩選水霉拮抗菌株海洋鏈霉菌Streptomyces sp.S26，其產(chǎn)生的活性物質(zhì)對病原水霉真菌有較強的抑制作用，并對外界環(huán)境變化有較強的適應(yīng)能力。梁永增、申慧等等[23-24]篩選的芽孢桿菌Bacillus sp.菌株JL04 和短小芽孢桿菌Bacillus pumilus JL50 對水霉菌均具有顯著抑制作用，2 株拮抗菌對魚體沒有毒性，且傳代穩(wěn)定。本研究從實驗室分離保存的21 株放線菌中篩選獲得一株對寄生水霉具有顯著拮抗作用的鏈霉菌菌株FX11，試驗結(jié)果表明該菌株對不同來源的多株寄生水霉均顯示出明顯的抑制作用。經(jīng)過對其形態(tài)學特征及16S rRNA 基因序列比對分析，可知菌株FX11 為鏈霉菌屬Streptomyces polychromogenes。該結(jié)果是Streptomyces polychromogenes 對水霉菌具有拮抗作用的首次報道。

Streptomyces polychromogenes FX11 的發(fā)酵濾液對供試稚魚無毒性。該菌株經(jīng)傳代培養(yǎng)后，對水霉菌拮抗作用穩(wěn)定，表明其具有良好的傳代穩(wěn)定性。該菌發(fā)酵濾液經(jīng)10～70 ℃低溫及高溫處理后，抑菌活性穩(wěn)定。淡水養(yǎng)殖水體的溫度變化范圍一般為0～34.6 ℃[25]，試驗表明菌株FX11 發(fā)酵產(chǎn)物表現(xiàn)出對養(yǎng)殖環(huán)境溫度變化的良好適應(yīng)性。該菌的發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性對環(huán)境的pH 波動較為敏感，僅在pH 6～8 范圍內(nèi)具有顯著的抑菌效果。一般來說，淡水養(yǎng)殖水體的pH 變化范圍為6.8～8.5[26]，可見該菌的發(fā)酵產(chǎn)物在淡水養(yǎng)殖水體中應(yīng)用具有較好的酸堿適應(yīng)性。本次試驗為進一步研究開發(fā)水霉病生防菌劑提供了優(yōu)質(zhì)菌種資源和基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)，后續(xù)試驗還將對該菌株的防治效果進行測定，以期為該菌開發(fā)為新型生物菌劑奠定基礎(chǔ)。