張文杰,李曉芳,張紅偉,樊 騰,徐璐丹,楊明月,胡淋淋,秦鵬宇,岳修勤

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院麻醉科,河南 衛(wèi)輝 453100)

開胸手術后肺損傷一般指各種胸部外科手術后以非心源性肺水腫和持續(xù)低氧血癥為癥狀的臨床綜合征。胸段硬膜外阻滯(thoracic epidural block，TEB)可有效阻滯相應階段的交感神經(jīng)，降低交感神經(jīng)張力，擴張相應階段的小動脈，從而改善阻滯區(qū)域的血流和微循環(huán)，降低胸部外科手術后患者心肺并發(fā)癥發(fā)生率及病死率[1]。但是，TEB對缺氧性肺損傷炎性因子的影響目前研究較少。本研究擬建立大鼠急性缺氧性肺損傷模型，觀察TEB對急性缺氧性肺損傷大鼠血清和支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)等炎性因子水平的影響，進一步探究TEB的作用機制，為其臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選取45只健康雄性清潔級Wistar 大鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)，鼠齡80～100 d，體質(zhì)量(350±20)g；在統(tǒng)一標準飼料和清潔級恒溫(25 ℃)環(huán)境下飼養(yǎng)1周，自由飲水,實驗前12 h 禁食。整個實驗過程均嚴格按照動物倫理學要求處置實驗動物。

1.2 主要試劑與儀器含體積分數(shù)14%氧的氮氧混合壓縮空氣、含體積分數(shù)21%氧的氮氧混合壓縮空氣(新鄉(xiāng)市北普特種氣體有限公司)，大鼠TNF-α、IL-6、 IL-10檢測試劑盒(上海越研生物科技有限公司)；RGZ-120型體質(zhì)量計(河南曙光健士醫(yī)療器械集團股份有限公司)，多功能生物信息采集系統(tǒng)、ALC-V8小動物呼吸機(上海奧爾科特生物科技有限公司)，多功能臺式高速冷凍離心機、全波長掃描酶標儀(美國Thermo Scientific 公司)，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)，化學發(fā)光熒光成像系統(tǒng)(美國GE公司)。

1.3 動物分組及實驗方法將45只大鼠隨機分為對照組、缺氧組和TEB組，每組15只。各組大鼠腹腔注射100 g·L-1水合氯醛(300 mg·kg-1)進行麻醉，行胸段硬膜外腔置管并留管，TEB組大鼠經(jīng)胸段硬膜外腔給予5 g·L-1羅哌卡因0.125 mL·kg-1[2],通過皮溫變化(0.5～1.0 ℃)間接判斷TEB是否成功[3]；對照組與缺氧組大鼠經(jīng)胸段硬膜外腔給予等量的生理鹽水。TEB模型制備成功10 min后，各組大鼠行頸動脈置管術并氣管插管，連接小動物呼吸機行機械通氣，缺氧組與TEB組大鼠吸入含體積分數(shù)14%氧的氮氧混合氣體，連續(xù)監(jiān)測大鼠的生命體征及通氣參數(shù)，并每隔 5 min (T5 min、T10 min、T15 min)抽取頸動脈血0.3～0.5 mL，測動脈血氣，直至動脈血氧合指數(shù)<300為急性缺氧性肺損傷模型建立成功；對照組大鼠持續(xù)吸入含體積分數(shù)21%氧的氮氧混合氣體。建立急性缺氧性肺損傷模型期間，TEB組大鼠每2 h追加5 g·L-1羅哌卡因0.125 mL·kg-1,對照組與缺氧組大鼠追加相同劑量生理鹽水，共追加2次。于氣管插管前(T0)、急性缺氧性肺損傷模型建立成功后4 h(T1)進行各組大鼠動脈血氣分析。

1.4 各組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10水平檢測于氣管插管前(T0)、急性缺氧性肺損傷模型建立成功后4 h(T1)時，經(jīng)右側(cè)頸總動脈采血0.5 mL,4 ℃ 5 000 r·min-1離心10 min，取上層血清，-20 ℃ 冰箱過夜后置于-70 ℃冰箱內(nèi)保存待測。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10 水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5 各組大鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-10水平檢測急性缺氧性肺損傷模型建立成功后4 h(T1)，取血后處死大鼠。大鼠處死后沿腹正中線向上做切口至胸腔，在右主支氣管上端剪下大鼠右肺，將16G套管針緩緩插入右主支氣管后用絲線固定，接5 mL注射器，吸取4 ℃無菌生理鹽水2 mL，緩慢注入肺內(nèi)，停留10 s后緩慢回抽，然后再緩慢注入肺內(nèi)，連續(xù)操作3次，將回抽液置于10 mL滅菌離心管內(nèi)；重復上述灌洗操作3 次，共收集4～5 mL灌洗液。將灌洗液經(jīng)單層紗布過濾后4 ℃ 3 000 r·min-1離心10 min，取上清液。經(jīng)-20 ℃冰箱過夜后置于-70 ℃冰箱內(nèi)保存。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測大鼠BALF中TNF-α、IL-6和IL-10水平[4-5]，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠造模情況實驗過程中因液體負荷過大死亡4只大鼠，其中對照組2只，缺氧組1只，TEB組1只；反復插管死亡3只，每組1只；TEB過程中死亡3只，每組1只；采血過程中死亡3只，每組1只；缺氧組大鼠因麻醉死亡1只；TEB組大鼠胸段硬膜外腔注藥死亡1只。最終每組10只大鼠納入研究。

2.2 3組大鼠急性缺氧性肺損傷造模前后動脈血氧合指數(shù)比較結(jié)果見表1。對照組、缺氧組、TEB組大鼠T0時動脈血氧合指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。隨著時間的延長，缺氧組和TEB組大鼠T0、T5 min、T10 min、T15 min、T1時動脈血氧合指數(shù)逐漸降低，缺氧組和TEB組大鼠T1時動脈血氧合指數(shù)低于T0時，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。缺氧組和TEB組大鼠T1時動脈血氧合指數(shù)低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。TEB組大鼠T1時動脈血氧合指數(shù)高于缺氧組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 3組大鼠不同時間點動脈血氧合指數(shù)比較

nT0T5 minT10 minT15 minT110552.9±82.9529.1±89.1500.5±69.6486.2±50.9463.8±41.910550.5±77.6468.6±55.7358.6±45.7254.3±31.4219.3±28.6abTEB10547.1±75.7500.7±49.3386.4±42.1286.4±27.9251.4±15.0abc

注：與T0比較aP<0.05;與對照組比較bP<0.05；與缺氧組比較cP<0.05。

2.3 3組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10水平比較結(jié)果見表2。對照組、缺氧組、TEB組大鼠T0時血清TNF-α、IL-6、IL-10水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，T1時血清TNF -α、IL-6、IL-10水平高于T0時，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。缺氧組和TEB組大鼠T1時血清TNF-α、IL-6和IL-10水平高于與對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。TEB組大鼠T1時血清TNF-α、IL-6和IL-10水平低于缺氧組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 3組大鼠不同時間點血清TNF-α、IL-6、IL-10水平比較

nTNF-α/(ng·L-1)IL-6/(ng·L-1)IL-10/(ng·L-1)10 T058.67±3.3250.97±2.5023.39±1.61 T168.37±4.13a61.60±2.67a35.44±1.94a10 T058.62±3.4051.29±2.9327.66±1.77 T1147.78±4.94ab137.72±3.95ab73.01±1.86abTEB10 T058.81±3.6051.13±3.2227.49±1.78 T1114.76±4.18abc107.62±2.58abc53.94±1.78abc

注：與T0時比較aP<0.05；與對照組比較bP<0.05；與缺氧組比較cP<0.05。

2.4 3組大鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-10水平比較結(jié)果見表3。缺氧組和TEB組大鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-10水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。TEB組大鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-10水平低于缺氧組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3 3組大鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-10水平比較

nTNF-α/(ng·L-1)IL-6/(ng·L-1)IL-10/(ng·L-1)1055.71±4.0538.64±4.1522.82±1.3810139.67±3.78a141.62±3.06a64.69±2.67aTEB10109.18±4.40ab98.50±1.84ab48.55±2.81ab

注：與對照組比較aP<0.05；與缺氧組比較bP<0.05。

3 討論

單肺通氣是一種非生理性通氣模式，在開胸手術過程當中可通過多種病理生理過程誘發(fā)局部甚至全身的應激反應。開胸手術過程中因單肺通氣引起低氧血癥的發(fā)生率高達9%～27%，相關動物實驗也表明，單肺通氣超過 30 min氧合指數(shù)會低于300[6]，這主要是因為單肺通氣會造成通氣/血流比例失衡，肺內(nèi)分流量增加，造成機體氧合降低，因此，單肺通氣比雙肺通氣更容易造成術后急性肺損傷。近年來，隨著胸外科大手術的日益增多和對肺保護策略研究的深入，缺氧性肺損傷越來越受到重視。除單肺通氣造成機體缺氧外，嚴重感染、多發(fā)性創(chuàng)傷、休克和中毒等因素也常常引起急性肺損傷(acute lung injury，ALI)，甚至導致急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory dis-tress syndrome，ARDS)，進而發(fā)展為多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，如果救治不及時往往導致死亡。ALI頑固性低氧血癥的主要原因是因為在多種炎性遞質(zhì)及效應細胞共同參與下造成肺泡上皮和血管內(nèi)皮被廣泛破壞，導致彌漫性肺實質(zhì)損傷，肺泡及肺間質(zhì)水腫，通氣/血流比例嚴重失調(diào)[7]。在ALI/ARDS炎癥反應發(fā)生、發(fā)展過程中，IL-6和TNF-α是最主要的促炎性細胞因子，而IL-10是最主要的抗炎性細胞因子，當促炎性細胞因子和抗炎性細胞因子失去平衡，會促使ALI向ARDS發(fā)展，甚至進展為MODS，直至死亡[8]。目前對ALI/ARDS尚缺乏有效的治療方法，病死率仍居高不下。因此，如何有效抑制手術或麻醉刺激引起的炎性因子釋放，減弱或中斷呈級聯(lián)放大的瀑布樣炎癥反應，控制ALI的進一步發(fā)展，減少ARDS的發(fā)生，進而降低患者的病死率，改善預后，減少術后康復所需時間，已經(jīng)成為臨床工作中迫切需要解決的問題。

通過TEB神經(jīng)阻滯的麻醉方法，可降低麻醉藥物的濃度，能夠使其主要阻滯交感神經(jīng)，而對感覺和運動神經(jīng)影響較小[9]。TEB阻滯范圍為T1～T5，阻滯了交感神經(jīng)通路，減少了去甲腎上腺素的釋放，使血漿去甲腎上腺素水平減低，交感神經(jīng)張力降低，血管平滑肌舒張，可減輕缺氧引起的肺血管收縮，增加肺組織的血流供應，與此同時還能擴張支氣管，改善通氣/血流比例和氧合狀態(tài)，緩解機體缺氧，改善機體呼吸功能[10]。本研究結(jié)果顯示，TEB組大鼠T1時動脈血氧合指數(shù)高于缺氧組，差異有統(tǒng)計學意義。推測TEB可減輕缺氧所致肺血管和支氣管收縮，改善機體的呼吸功能。

TEB能夠有效阻斷胸段交感神經(jīng)，抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)，使血管緊張素Ⅱ水平下降，減少對機體神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌系統(tǒng)的刺激[11]。本研究結(jié)果顯示，對照組大鼠T1時血清TNF-α、IL-6和IL-10水平高于T0時，說明即使機體不缺氧，麻醉、手術、機械通氣也會成為一種傷害性刺激引發(fā)機體產(chǎn)生炎癥反應[12]；缺氧組大鼠T1時血清TNF-α、IL-6、IL-10水平高于對照組，說明缺氧刺激引發(fā)了全身炎癥反應；本研究結(jié)果顯示，TEB組大鼠T1時血清和BALF中TNF-α、IL-6、IL-10水平高于對照組，但低于缺氧組，說明TEB具有較強的抗炎作用[13]，TEB在減輕全身與肺組織炎癥反應的同時，還能糾正促炎癥反應和抗炎癥反應失衡，減輕全身炎癥反應，對機體具有一定的保護作用。

綜上所述，TEB可減少急性缺氧性肺損傷大鼠炎性細胞因子的釋放，糾正炎癥反應和抗炎反應失衡，對機體有一定的保護作用。