于曉晴，鐘根深，熊熙文，梁銀明，王 輝，章小英，葉建平

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南省分子診斷與醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)法醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；4.上海交通大學(xué)第六人民醫(yī)院中心實驗室，上海 201306)

細(xì)胞內(nèi)三磷腺苷(adenosine triphosphate，ATP)主要在線粒體內(nèi)合成，是細(xì)胞維持多種生命活動的能源[1-2]。線粒體合成ATP依賴三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)。三羧酸循環(huán)是葡萄糖和脂肪酸釋放能量的關(guān)鍵步驟，糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸和脂肪酸經(jīng)β氧化產(chǎn)生的乙酰輔酶A均需經(jīng)過三羧酸循環(huán)為呼吸鏈提供電子，推動OXPHOS反應(yīng)，合成ATP[1]。線粒體呼吸鏈的H+-ATP合酶具有合成和水解ATP 2種活性，參與細(xì)胞內(nèi)ATP水平的調(diào)節(jié)。在心肌細(xì)胞和肝臟細(xì)胞中，H+-ATP合酶活性受線粒體ATP酶抑制因子1(ATPase inhibitory factor 1，ATPIF1)的調(diào)節(jié)，其分子機制是ATPIF1作用于H+-ATP合酶的F1區(qū)域，抑制ATP合酶的合成和水解功能[3-4]。這種調(diào)節(jié)的生物學(xué)意義是既防止ATP過度合成，也避免ATP過度水解消耗，從而維持細(xì)胞內(nèi)ATP的動態(tài)平衡。在轉(zhuǎn)基因小鼠肝細(xì)胞中，通過過表達(dá)ATPIF1基因增加ATPIF1基因的活性，引起H+-ATP合酶活性減弱，細(xì)胞內(nèi)ATP水平降低[5]。此外，ATPIF1通過抑制ATP合成，可增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，觸發(fā)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)[6-8]。但是，ATPIF1的這些作用在巨噬細(xì)胞中還未見報道。本課題組前期研究結(jié)果表明，ATPIF1基因敲除增加了轉(zhuǎn)基因小鼠成纖維細(xì)胞中的ATP水平，也促進(jìn)成纖維細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化[9]，但ATPIF1基因敲除對巨噬細(xì)胞代謝的影響尚不清楚。本實驗通過檢測細(xì)胞內(nèi)ATP水平、氧耗量、三羧酸循環(huán)基因表達(dá)等指標(biāo)，比較ATPIF1基因敲除小鼠和野生型(wide type,WT)小鼠巨噬細(xì)胞氧化磷酸化相關(guān)指標(biāo)的區(qū)別，探討ATPIF1基因敲除對小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞(bone marrow derived macrophages，BMDM)內(nèi)ATP水平的影響及調(diào)節(jié)機制，確定ATPIF1基因調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞能量代謝的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物WT雄性C57BL/6健康小鼠5只(WT組)，8～10周齡，體質(zhì)量25～27 g；雄性ATPIF1基因敲除小鼠5只(KO組)，8～10周齡，體質(zhì)量26～31 g。小鼠均由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。小鼠飼養(yǎng)在無特定病原體級環(huán)境中，12 h 明暗交替，環(huán)境溫度22～26 ℃，濕度40%～60%，低脂飼料喂養(yǎng)，自由攝食和飲水。

1.2 主要試劑與儀器達(dá)爾伯克改良伊戈爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)購自美國HyClone公司，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國Gibco公司，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)購自美國PepTech公司，脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)干粉購自美國Sigma公司，紅細(xì)胞裂解液、ATP檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，線粒體壓力試劑盒購自美國安捷倫科技有限公司，TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR green熒光染料購自大連寶生物工程有限公司；酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司，4 ℃低溫離心機購自美國Eppendorff公司，Seahorse XFe24細(xì)胞能量代謝分析儀購自美國安捷倫科技有限公司。

1.3 小鼠BMDM的獲取與培養(yǎng)2組小鼠均使用100 g·L-1水合氯醛麻醉，脫頸處死，取雙側(cè)股骨與脛骨，在超凈臺內(nèi)用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡3 min，小心剔除肌肉組織，完整暴露骨質(zhì)，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗干凈。切斷骨質(zhì)兩端暴露骨髓腔，用1 mL注射器吸取低糖型DMEM沖洗出骨髓。獲得的骨髓沖洗液經(jīng) 1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，用3 mL 1×紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，冰上孵育5 min，每分鐘搖晃1次離心管，去掉紅細(xì)胞。加入10 mL PBS終止去紅細(xì)胞反應(yīng)，經(jīng)1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，獲得純化的骨髓細(xì)胞。用含1 g·L-1低糖DMEM、 10 μg·L-1M-CSF、體積分?jǐn)?shù)10%FBS和體積分?jǐn)?shù)1%雙抗的低糖完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，在體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃環(huán)境下培養(yǎng)，分別在第3、5天更換新鮮培養(yǎng)基，第7天獲得成熟的BMDM。

1.4 細(xì)胞處理成熟的BMDM用含4.5 g·L-1葡萄糖DMEM、體積分?jǐn)?shù)10%FBS和體積分?jǐn)?shù)1%雙抗的高糖完全培養(yǎng)基在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔使用2.5 mL高糖完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，留取未經(jīng)LPS刺激的細(xì)胞作為基礎(chǔ)狀態(tài)組，其余每孔加入25 μL濃度為 100 mg·mL-1的LPS分別刺激細(xì)胞2、4 h，用于進(jìn)行下一步實驗。

1.5 BMDM內(nèi)ATP水平檢測將6孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上，用預(yù)冷的PBS洗2次，每孔加入80 μL預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞刮收集巨噬細(xì)胞，轉(zhuǎn)至1.5 mL的EP管中，置于冰上繼續(xù)裂解30 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，取上清液，采用ATP檢測試劑盒檢測上清液中ATP水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 線粒體氧消耗率(oxygen consumption rate，OCR)檢測在熒光探針傳感器板中，每孔加入 1 mL 海馬儀水化液，置于37 ℃無CO2的培養(yǎng)箱孵育過夜；并將誘導(dǎo)成熟的BMDM按照每孔5×105個細(xì)胞鋪在Seahorse細(xì)胞板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。實驗開始前將細(xì)胞板中培養(yǎng)基換為上機檢測液，于37 ℃無CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。取出活化好的熒光探針傳感器板，在加藥倉中加入相應(yīng)所需藥物：A孔每孔加入 10 μmol·L-1寡霉素 56 μL，B孔每孔加入20 μmol·L-1解偶聯(lián)劑即三氟甲氧基苯腙羰基氰化物[carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone，F(xiàn)CCP]62 μL。加藥以后將熒光探針傳感器板放入Seahorse YFe24細(xì)胞能量代謝分析儀中，通過熒光探針傳感器板先平衡好機器的溫度和pH。平衡完成后，用已經(jīng)處理好的海馬細(xì)胞培養(yǎng)板替換下探針板，按照試劑盒說明書操作步驟檢測線粒體的氧耗率。加入寡霉素后檢測結(jié)果為細(xì)胞的基礎(chǔ)氧耗量；加入寡霉素后減少的氧耗量為機體用于ATP合成的氧耗量；加入FCCP后的氧耗量為線粒體的最大氧耗量。

1.7 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測三羧酸循環(huán)相關(guān)酶mRNA表達(dá)水平根據(jù)試劑盒說明書，用TRIzol試劑從細(xì)胞中提取和純化總RNA。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后用SYBR Green qPCR Master Mix進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，檢測丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PKm)、異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)、檸檬酸合酶 (citrate synthase，CS)、α-酮戊二酸脫氫酶(α-oxoglutarate dehydrogenase complex，OGDC)mRNA表達(dá)；反應(yīng)體系為20 μL，體系包括SYBR Green Master Mix、cDNA模板、配對引物和無RNA酶H2O。磷酸甘油醛脫氫酶(reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH)上游引物序列為5′-GACGGCCGCATCTTCTTGT-3′，下游引物序列為5′-CACACCGACCTTCACCATTTT-3′；PKm上游引物序列為5′-CTCTGGGCTTTGCTT-CTGTA-3′，下游引物序列為5′-AGTCAGGAGACA-AAAGA-3′；IDH上游引物序列為5′-CTCCTGTGAC-CCAGCCTAA-3′，下游引物序列為5′-ACCGTTT-GGATTTCTGCTGA-3′；CS上游引物序列為5′-GTCCTCTCTCAGCAGGTC-3′，下游引物序列為5′-ACTATCTTCTGACCTTGG-3′；OGDC上游引物序列為5′-GAACAGAACCCTATGTGGCT-3′，下游引物序列為5′-AGGAGTAGTTTCATCTTGCTA-3′。以GAPDH為內(nèi)參，WT組基礎(chǔ)表達(dá)量為參照值“1”，使用2-△△Ct法計算目的基因相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 2組小鼠BMDM內(nèi)ATP水平比較結(jié)果見表1。在基礎(chǔ)狀態(tài)下，KO組小鼠BMDM內(nèi)ATP水平顯著高于WT組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；LPS刺激2、4 h后，KO組小鼠BMDM內(nèi)ATP水平顯著高于WT組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 WT組和KO組小鼠BMDM內(nèi)ATP水平比較

nATP/(μmol·L-1)LPS2 hLPS4 hWT533.52±0.343.04±0.208.40±0.54KO544.55±1.7222.84±1.4628.87±1.85t-1.870-2.761-2.481P0.0470.0110.017

2.2 2組小鼠BMDM內(nèi)OCR比較結(jié)果見表2?；A(chǔ)狀態(tài)下，KO組小鼠BMDM內(nèi)基礎(chǔ)氧耗量、用于ATP合成的氧耗量和最大氧耗量均顯著高于WT組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；LPS刺激2、4 h，KO組小鼠BMDM內(nèi)基礎(chǔ)氧耗量、用于ATP合成的氧耗量和最大氧耗量均顯著高于WT組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表2 WT組和KO組小鼠BMDM內(nèi)OCR比較

n/(pmol·min-1)ATP/(pmol·min-1)/(pmol·min-1)WT5 384.61±10.20199.18±6.95448.04±4.93 LPS2 h249.03±5.1489.44±3.04533.43±10.55 LPS4 h260.55±4.8398.39±4.11587.19±27.35KO5 449.72±3.42a272.64±11.82a574.05±6.10a LPS2 h364.49±15.23a140.48±4.79a660.60±20.41a LPS4 h373.47±9.37a146.05±8.85a773.08±39.46a

注：與WT組比較aP<0.05。

2.3 2組小鼠BMDM內(nèi)三羧酸循環(huán)相關(guān)酶的mRNA相對表達(dá)量比較結(jié)果見表3。在基礎(chǔ)狀態(tài)下，KO組小鼠BMDM內(nèi)三羧酸循環(huán)相關(guān)酶PKm、IDH、CS、OGDC mRNA相對表達(dá)量均高于WT組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。LPS誘導(dǎo)2、4 h后，KO組小鼠CS、OGDC mRNA相對表達(dá)量高于WT組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；PKm、IDH mRNA相對表達(dá)量與WT組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 WT組和KO組小鼠BMDM內(nèi)三羧酸循環(huán)相關(guān)酶mRNA相對表達(dá)量比較

nPKm mRNACS mRNAIDH mRNAOGDC mRNAWT5 1.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.00 LPS2 h0.99±0.020.14±0.020.97±0.080.95±0.06 LPS4 h0.32±0.020.96±0.200.33±0.020.77±0.27KO5 1.94±0.04a1.37±0.01a1.72±0.03a1.57±0.10a LPS2 h0.93±0.051.84±0.48b0.92±0.031.28±0.07b LPS4 h0.30±0.012.34±0.21b0.30±0.012.26±0.03b

注：與WT組比較aP<0.01，bP<0.05。

3 討論

ATPIF1是線粒體H+-ATP合酶的主要調(diào)節(jié)蛋白，其活性受磷酸化修飾調(diào)節(jié)[10-11]。研究表明，在小鼠心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中，ATP需求增加時，ATPIF1蛋白磷酸化水平增加，蛋白活性降低，從而提高H+-ATP合酶催化功能，線粒體產(chǎn)生ATP增加[3]。cAMP依賴蛋白激酶(protein kinase A，PKA)是目前已知唯一的ATPIF1磷酸化酶，在細(xì)胞能量需求增加時被激活，通過磷酸化ATPIF1提高H+-ATP合酶的催化作用[12]。在能量需求低時，ATPIF1蛋白磷酸化水平降低，蛋白活性增加，從而減少線粒體合成ATP。ATPIF1也過表達(dá)于結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌等大多數(shù)常見腫瘤中，腫瘤中高表達(dá)的ATPIF1處于去磷酸化活躍狀態(tài)，可以抑制三羧酸循環(huán)并增強糖酵解，減少ATP的合成，促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展[13-14]。ATPIF1通過抑制H+-ATP合酶的合成和分解，在細(xì)胞應(yīng)激條件下加劇線粒體損傷，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)呼吸鏈活動下降時，如藥物毒性引起的細(xì)胞反應(yīng)，會導(dǎo)致線粒體膜電位下降，這時，H+-ATP合酶可通過水解ATP，維持線粒體膜電位，保護細(xì)胞[12，15]。如果ATPIF1被激活，可降低H+-ATP合酶的這種保護作用，從而增加細(xì)胞損傷。文獻(xiàn)提示，ATPIF1在肌肉、神經(jīng)和腫瘤細(xì)胞中通過調(diào)控線粒體功能來調(diào)節(jié)ATP水平[3，13-14]，但其在巨噬細(xì)胞中的功能還不清楚。本研究通過對ATPIF1基因敲除小鼠BMDM的分析發(fā)現(xiàn)，ATPIF1基因敲除后BMDM內(nèi)ATP水平明顯升高，提示ATPIF1在巨噬細(xì)胞中也發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

有文獻(xiàn)報道，在腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠中，過表達(dá)ATPIF1基因可降低腫瘤細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)ATP水平[7，15]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，ATPIF1基因敲除小鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)ATP水平升高，并促進(jìn)其向脂肪細(xì)胞分化，分化過程中細(xì)胞內(nèi)三酰甘油含量明顯增加[9]。本研究結(jié)果顯示，在基礎(chǔ)狀態(tài)和LPS刺激下KO組小鼠BMDM內(nèi)ATP水平、基礎(chǔ)氧耗量和最大氧耗量均高于WT組。在基礎(chǔ)狀態(tài)下，KO組三羧酸循環(huán)功能提高，表現(xiàn)為CS、OGDC、PKm、IDH mRNA相對表達(dá)量高于WT組。在LPS誘導(dǎo)2、4 h時，KO組小鼠BMDM內(nèi)CS和OGDC mRNA相對表達(dá)量高于WT組。這些結(jié)果表明，在基礎(chǔ)狀態(tài)和LPS刺激的應(yīng)激狀態(tài)下，ATPIF1基因敲除提高了巨噬細(xì)胞內(nèi)ATP水平，其作用機制是增加線粒體功能，包括提高三羧酸循環(huán)和呼吸鏈運轉(zhuǎn)水平，增加ATP合成。

LPS會引發(fā)促炎性免疫反應(yīng)，這不僅能夠清除入侵的致病原，還會導(dǎo)致線粒體功能障礙，對宿主組織造成損傷，因此，在必要時抑制LPS誘導(dǎo)的過激炎癥反應(yīng)是很重要的[16]。ATPIF1基因敲除對巨噬細(xì)胞免疫功能的影響還未見報道，本研究結(jié)果顯示，在基礎(chǔ)狀態(tài)和應(yīng)激狀態(tài)下，ATPIF1基因敲除小鼠BMDM內(nèi)ATP水平均高于WT組，而ATP能參與調(diào)節(jié)炎癥過程，這已經(jīng)在免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞中被證實[17-19]。ATP被釋放到細(xì)胞外后，成為細(xì)胞外ATP(extracellular adenosine triphosphate，eATP)，通過與細(xì)胞膜上的特異腺苷受體相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌[16]。在巨噬細(xì)胞中，eATP通過介導(dǎo)NLRP3的活化，促進(jìn)炎癥小體的聚集和炎性因子(白細(xì)胞介素-1和白細(xì)胞介素-18)的釋放[20]。本課題組前期研究結(jié)果表明，細(xì)胞內(nèi)ATP(intracellular adenosine triphosphate，iATP)可通過激活絲氨酸激酶誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)[19]。本研究結(jié)果表明，在基礎(chǔ)狀態(tài)和LPS刺激2、4 h，KO組小鼠BMDM內(nèi)基礎(chǔ)氧耗量、用于ATP合成的氧耗量和最大氧耗量均高于WT組，提示ATPIF1基因敲除可提高巨噬細(xì)胞線粒體抵抗LPS毒性的能力。

綜上所述，ATPIF1基因敲除可通過促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞中三羧酸循環(huán)活動，提高線粒體合成ATP水平和線粒體OXPHOS水平，增強巨噬細(xì)胞功能。