回 薔，林時(shí)秀，郭冰玉，常 鵬，徐志山，陶 凱

0 引言

增生性瘢痕通常繼發(fā)于燒傷、創(chuàng)傷及手術(shù)后，表現(xiàn)為局部組織僵硬、發(fā)紅、瘙癢和隆起于皮膚表面，好發(fā)于頦部、耳部、雙上臂及胸前區(qū)等部位，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)生攣縮，造成關(guān)節(jié)畸形和器官移位，不僅影響美觀，還會(huì)給患者的日常生活帶來(lái)困擾[1]。成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖、以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)成分異常沉積是增生性瘢痕形成的機(jī)制之一，因此，對(duì)成纖維細(xì)胞作用的研究成為治療增生性瘢痕的關(guān)鍵[2]。

芒柄花黃素又名刺芒柄花素、芒柄花素，是從豆科植物紅車軸草的花序及帶花枝葉或刺芒柄花全草中提取的異黃酮類成分之一。越來(lái)越多的研究表明，芒柄花黃素具有抗氧化、抗腫瘤和抗炎等多種藥理作用[3]。有文獻(xiàn)報(bào)道，芒柄花黃素能夠抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4]，因此，推斷芒柄花黃素對(duì)增生性瘢痕也具有一定的治療作用。

本研究初步探討了芒柄花黃素對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖與凋亡的作用，并對(duì)細(xì)胞周期蛋白與抗凋亡蛋白的變化進(jìn)行了分析，旨在為增生性瘢痕的預(yù)防與臨床治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶(北京索萊寶科技有限公司)，Annexin V-FITC、PI、NP-40裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，二甲基亞砜(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，芒柄花黃素(美國(guó)Selleck生物科技有限公司)，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑、總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR試劑盒(寶生物工程大連有限公司)，Cyclin D1抗體、Bcl-2抗體和GAPDH抗體(艾博抗上海貿(mào)易有限公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞提取與培養(yǎng) 隨機(jī)選取2017年3-8月于我院整形外科就診的8位患者，手術(shù)切除創(chuàng)傷愈合后的增生性瘢痕組織，留取局部皮瓣轉(zhuǎn)移修復(fù)后剩余的正常皮膚，提取成纖維細(xì)胞后進(jìn)行培養(yǎng)。將切取的新鮮增生性瘢痕組織與正常皮膚的真皮層置于5 ml 0.25%的胰蛋白酶溶液中，4 ℃冷消化過(guò)夜。加入適量含10%胎牛血清的DMEM，置于37 ℃ 5% CO2飽和濕度的孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

2.2 MTT試驗(yàn) 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成纖維細(xì)胞，胰蛋白酶消化后進(jìn)行離心，重新制成單細(xì)胞懸液。以1×103/孔的密度將成纖維細(xì)胞接種于96孔板中，12 h后加入二甲基亞砜(DMSO)、10 μmol/L和20 μmol/L的芒柄花黃素處理細(xì)胞，每組3個(gè)復(fù)孔。避光條件下，分別于第0、12、24、36、48小時(shí)在每孔中加入5 mg/ml的MTT，37 ℃孵箱中孵育4 h。用1 ml無(wú)菌注射器吸去上清液，分別加入100 μl DMSO溶解形成的MTT-甲臜結(jié)晶，使用酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm處的吸光值。

2.3 流式細(xì)胞檢測(cè) 以1×106/L的濃度將細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后分別加入DMSO，10、20 μmol/L的芒柄花黃素處理細(xì)胞24 h。胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，加入預(yù)冷的70%乙醇固定過(guò)夜。以800 r/min的速度離心5 min，棄上清，PBS洗滌細(xì)胞。在每管細(xì)胞中加入500 μl染色緩沖液，充分緩慢混勻，制成單細(xì)胞懸液。加入25 μl碘化丙啶(PI)染色液并充分混勻，再加入10 μl Rnase，37 ℃條件下避光染色30 min，進(jìn)行流式檢測(cè)。

2.4 AV-PI染色 分別以DMSO及10、20 μmol/L的芒柄花黃素處理細(xì)胞24 h，胰蛋白酶消化后離心5 min，收集下層的細(xì)胞沉淀，PBS洗滌后制成單細(xì)胞懸液。在每管細(xì)胞中加入500 μl的Binding Buffer進(jìn)行重懸，依次加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI。輕輕混勻細(xì)胞，室溫下避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

2.5 Hoechest 33258染色 分別用DMSO及10、20 μmol/L的芒柄花黃素處理細(xì)胞24 h，依次在每孔中加入100 μl Hoechest 33258染色液，室溫條件下孵育15 min，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的染色情況。

2.6 Western blot試驗(yàn) 以DMSO及10、20 μmol/L的芒柄花黃素處理細(xì)胞24 h，NP-40裂解液裂解細(xì)胞，制備細(xì)胞裂解液。分別取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜后置于5%的脫脂奶粉中，室溫封閉1 h。加入一抗Cyclin D1、Bcl-2和GAPDH，4 ℃條件下孵育過(guò)夜。洗膜，加入二抗室溫孵育1 h。采用ECL發(fā)光法檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況。

2.7 RT-PCR試驗(yàn) 應(yīng)用DMSO及10、20 μmol/L的芒柄花黃素處理細(xì)胞24 h，按照試劑盒說(shuō)明書的操作步驟提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。計(jì)算相對(duì)于GAPDH水平的基因表達(dá)水平，合成的引物序列為Cyclin D1,F(5′-3′):CCGAGGAGCTGCTGCAAATGGAGC，R(5′-3′):TGAAATCGTGCGGGGTCATTGCGGC;Bcl-2,F(5′-3′):GGTGAACTGGGGGAGGATTG，R(5′-3′) GGCAGGCATGTTGACTTCAC;GAPDH,F(5′-3′):AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，R(5′-3′):AGGGGCCATCCACAGTCTTC。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度芒柄花黃素對(duì)正常皮膚與增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的作用 分別加入10、20 μmol/L的芒柄花黃素處理24 h，其對(duì)正常皮膚組織成纖維細(xì)胞的增殖影響較小，與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1A。而增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖均受到明顯抑制，且藥物濃度越高、作用時(shí)間越長(zhǎng)，抑制作用越明顯，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1B。

3.2 不同濃度芒柄花黃素對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞周期的影響 通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)芒柄花黃素處理的成纖維細(xì)胞大部分阻滯于G1期，進(jìn)入S期的細(xì)胞減少，細(xì)胞周期的進(jìn)程受到阻斷。細(xì)胞增殖受抑制程度與藥物的濃度呈正比，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

3.3 不同濃度芒柄花黃素對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡的影響 Annexin V-FITC/PI雙染色法顯示，芒柄花黃素作用后，成纖維細(xì)胞的早期凋亡率有所增加，并且隨著藥物濃度的遞增，促凋亡作用愈加明顯(P<0.05)，見表1。在熒光顯微鏡下觀察Hoechest 33258染色后的細(xì)胞凋亡情況，與對(duì)照組比較，經(jīng)芒柄花黃素處理的成纖維細(xì)胞凋亡率有所增加，當(dāng)濃度為20 μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡最顯著，見圖3。

圖1 不同濃度芒柄花黃素對(duì)正常皮膚(A)與增生性瘢痕(B)成纖維細(xì)胞的作用

圖2 不同濃度芒柄花黃素對(duì)成纖維細(xì)胞周期的影響

表1 不同濃度芒柄花黃素對(duì)成纖維細(xì)胞凋亡的影響

注：UL：壞死細(xì)胞，UR：晚期凋亡，LL：正常細(xì)胞，LR：早期凋亡。*與DMSO組比較，P<0.05；#與10 μmol/L組比較，P<0.05

圖3 不同濃度芒柄花黃素對(duì)成纖維細(xì)胞凋亡的影響

3.4 芒柄花黃素對(duì)成纖維細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的影響 芒柄花黃素對(duì)Cyclin D1具有一定程度的抑制作用，且藥物濃度越高，抑制作用越強(qiáng)，見圖4。RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，芒柄花黃素能夠在RNA水平上下調(diào)Cyclin D1的表達(dá)，隨著藥物濃度的升高，Cyclin D1 mRNA的表達(dá)水平逐漸下降，見圖5。

圖4 芒柄花黃素對(duì)成纖維細(xì)胞Cyclin D1的影響

圖5 芒柄花黃素對(duì)成纖維細(xì)胞Cyclin D1 mRNA表達(dá)的影響

3.5 芒柄花黃素對(duì)成纖維細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響 通過(guò)Western blot和RT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，不同濃度的芒柄花黃素對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2均有影響，能夠有效抑制凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)。處理細(xì)胞的藥物濃度越高，其對(duì)Bcl-2的抑制作用越明顯(P<0.05)，見圖6、圖7。

圖6 芒柄花黃素對(duì)成纖維細(xì)胞Bcl-2的影響

4 討論

增生性瘢痕是成纖維細(xì)胞對(duì)組織損傷應(yīng)答而形成的細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)量沉積的一種纖維化疾病，主要特征是真皮層成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖與活化、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白代謝紊亂[5]。增生性瘢痕突出于皮膚表面，形狀不規(guī)則、質(zhì)韌，伴有瘙癢感甚至灼痛感，對(duì)患者的外觀和骨骼肌功能造成了不利影響[6]。成纖維細(xì)胞是增生性瘢痕形成的重要效應(yīng)細(xì)胞之一，因此，抑制成纖維細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡是治療增生性瘢痕的關(guān)鍵。

圖7 芒柄花黃素對(duì)成纖維細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響

芒柄花黃素是一種具有生物活性的非甾體多酚，廣泛存在于多種植物中，具有類雌二醇分子結(jié)構(gòu)，是一種有效的植物雌激素[7]。諸多文獻(xiàn)報(bào)道，芒柄花黃素能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡[8]。Wang等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，芒柄花黃素能夠通過(guò)microRNA 149介導(dǎo)的EphB3下調(diào)和抑制PI3K/AKT與STAT3信號(hào)通路來(lái)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲。Zhang等[10]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，芒柄花黃素作用于卵巢癌細(xì)胞后，凋亡相關(guān)蛋白caspase 3/9表達(dá)與Bax/Bcl-2的比率呈劑量依賴性增加，表明芒柄花黃素能夠通過(guò)誘導(dǎo)凋亡來(lái)抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。增生性瘢痕是創(chuàng)傷后組織修復(fù)的異常結(jié)局，組織學(xué)特點(diǎn)是成纖維細(xì)胞大量增殖，臨床表現(xiàn)為瘤樣增生[11]。因此，我們推斷芒柄花黃素對(duì)增生性瘢痕也具有一定的抑制作用。

在本研究中，MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示，芒柄花黃素對(duì)正常皮膚成纖維細(xì)胞的增殖影響較小，對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用，且藥物濃度越高、作用時(shí)間越長(zhǎng)，抑制作用越明顯。通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)芒柄花黃素處理的成纖維細(xì)胞大多數(shù)阻滯于G1期，S期細(xì)胞的百分比顯著下降，表明芒柄花黃素可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。Cyclin D1是重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，調(diào)控細(xì)胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)化[12]。我們通過(guò)Western blot與RT-PCR對(duì)Cyclin D1蛋白水平及其mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，與對(duì)照組比較，人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞經(jīng)芒柄花黃素處理24 h后，Cyclin D1的蛋白水平及其mRNA表達(dá)水平顯著下降。Annexin-V-FITC/PI與Hoechest 33258染色法顯示，芒柄花黃素呈劑量依賴的形式誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的凋亡，當(dāng)濃度為20 μmol/L時(shí)，細(xì)胞的凋亡率最高。Bcl-2蛋白家族在細(xì)胞凋亡的線粒體通路中起著關(guān)鍵作用，Bcl-2是細(xì)胞凋亡的重要抑制因子之一[13]。Western blot檢測(cè)顯示，不同濃度的芒柄花黃素對(duì)Bcl-2表達(dá)均有抑制作用，且濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。RT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了芒柄花黃素能夠通過(guò)調(diào)節(jié)mRNA的表達(dá)水平來(lái)調(diào)控Bcl-2的蛋白表達(dá)。

綜上所述，芒柄花黃素通過(guò)抑制Cyclin D1表達(dá)影響人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞周期阻滯于G1/S期，通過(guò)下調(diào)Bcl-2的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可考慮用于增生性瘢痕的預(yù)防和臨床治療。