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        絲裂霉素C抑制PI3K/AKT信號(hào)通路抗宮腔黏連SD大鼠子宮內(nèi)膜纖維化的機(jī)制研究

        2019-06-14 07:30:40潘嬙微鄭加永夏淑琦陳玄宇沈曉露
        實(shí)用藥物與臨床 2019年5期
        關(guān)鍵詞:纖維細(xì)胞宮腔內(nèi)膜

        徐 芳,潘嬙微,鄭加永,夏淑琦,陳玄宇,沈曉露

        0 引言

        宮腔黏連(Intrauterine adhesions,IUA)是引起月經(jīng)稀少、閉經(jīng)、不孕及早期自然流產(chǎn)的重要原因之一,是不孕不育的首要宮腔病因[1-2]。子宮內(nèi)膜功能隨體內(nèi)激素水平及月經(jīng)周期發(fā)生周期性增生和脫落,其功能自主恢復(fù)主要依靠基底細(xì)胞轉(zhuǎn)化,一旦子宮內(nèi)膜基底發(fā)生損傷,造成腺體的大量丟失,刺激成纖維細(xì)胞的大量增殖,使大量膠原蛋白聚集形成瘢痕,最終形成宮腔黏連,對(duì)女性子宮會(huì)造成嚴(yán)重?fù)p傷[3-4]??箤m腔黏連瘢痕生長(zhǎng)的藥物能大幅度降低宮腔黏連的發(fā)生率,提高其治愈率,將是宮腔黏連治療方案中的突破點(diǎn)。絲裂霉素C(Mitomycin C,MMC)作為經(jīng)典抗瘢痕形成藥物,能有效抑制中外胚層細(xì)胞的異常增生,因此,MMC極可能抗宮腔黏連瘢痕形成[5]。本研究通過(guò)觀察宮腔黏連對(duì)SD雌性大鼠子宮內(nèi)膜的影響,以及MMC對(duì)其PI3K/AKT通道相關(guān)蛋白的作用機(jī)制,從而發(fā)現(xiàn)宮腔黏連的有效的治療方法。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選用健康清潔級(jí)的雌性SD大鼠40只,9~10周齡,體重約220~240 g,適應(yīng)飼養(yǎng)1周后,按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2,每組10只。

        1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 ELx808IU酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(US,Bio-Tek),蛋白電泳及轉(zhuǎn)印儀(US,Bio-Tek),絲裂霉素C注射液(浙江海正藥業(yè)股份有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H19999025),IGF-I(長(zhǎng)春金賽藥業(yè)股份有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字S20050024),石蠟切片機(jī)(Leica,型號(hào)2235),體視學(xué)顯微鏡(Leica,型號(hào)m205FA);圖像分析系統(tǒng)Image-Proplus5.1(Media Cybemetics Inc.USA,型號(hào)41N5100-44800),投射顯微鏡(HITACHI,JAPAN,型號(hào)H-7500),LAS1000 CCD曝光檢測(cè)系統(tǒng)(Fujifilm,Tokyo,Japan),兔抗PI3K多克隆抗體(Abcam,ab32089),兔抗AKT多克隆抗體(Abcam,ab179463),兔抗Bcl-2多克隆抗體(Abcam,ab32124),兔抗Bax多克隆抗體(Abcam,ab232479),兔抗IGF-I多克隆抗體(Abcam,ab232479),無(wú)水乙醇溶液(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),伊紅染液水溶性(珠海貝索生物技術(shù)有限公司),蘇木素染液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司),中性樹(shù)膠(Solarbio)

        1.3 模型制備 適應(yīng)飼養(yǎng)1周后開(kāi)始對(duì)模型組、實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2大鼠制備宮腔黏連模型。宮腔黏連模型制備參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-8]:用陰道涂片法確定雌性SD大鼠動(dòng)情期,腹腔注射水合氯醛,經(jīng)腹部中線切口暴露右側(cè)子宮,子宮中下段做3 mm的縱向切口,用21號(hào)刀片刮除子宮內(nèi)膜直至宮壁明顯粗糙,清洗后縫合切口,構(gòu)建宮腔黏連模型。術(shù)中及術(shù)后3、5 d,模型組大鼠不做任何處理。實(shí)驗(yàn)組1大鼠在術(shù)中給予1 mg/ml絲裂霉素C敷刮傷區(qū)域5 min,術(shù)后3、5 d分別用1 mg/ml的絲裂霉素C 0.2 ml進(jìn)行宮腔灌注。實(shí)驗(yàn)組2大鼠在實(shí)驗(yàn)組1的用藥基礎(chǔ)上,再給予雌激素口服進(jìn)行治療。對(duì)照組為正常雌性SD大鼠,不做任何處理。各組大鼠均于術(shù)后21 d處死,取出子宮組織。

        1.4 檢測(cè)方法 各組大鼠用2%戊巴比妥鈉腹腔深度麻醉(0.2 ml/10 g),剪開(kāi)腹腔,取出子宮組織剪碎,一部分子宮組織用0.1 mol/L的PBS(pH 7.4)液30 ml沖洗,經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h后常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)切片(厚約4 μm)貼附于防脫載玻片上,60 ℃烤箱過(guò)夜干燥備用。一部分子宮組織迅速放入凍存管,存于-80 ℃冰箱進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

        1.4.1 HE染色 石蠟切片65 ℃烘烤2 h;二甲苯Ⅰ脫蠟15 min;二甲苯Ⅱ脫蠟15 min;二甲苯Ⅲ脫蠟15 min;無(wú)水乙醇Ⅰ10 min;無(wú)水乙醇Ⅱ10 min;95%乙醇Ⅰ8 min;95%乙醇Ⅱ8 min;85%乙醇7 min;75%乙醇6 min;65%乙醇5 min;蘇木素染色8 min,流水沖洗3 min;0.1%鹽酸酒精分化2 s,流水沖洗3 min;氨水反藍(lán)2 min,流水沖洗3 min;伊紅染色8 min,流水沖洗3 min;70%乙醇脫水2 s;80%乙醇脫水2 s;95%乙醇脫水2 s;無(wú)水乙醇脫水2 s;二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各10 min;中性樹(shù)膠封片。HE 染色通過(guò)普通光學(xué)顯微鏡于400×物鏡下采圖,以觀察子宮組織細(xì)胞纖維化程度。

        1.4.2 Western blot檢測(cè) 從-80 ℃冰箱中取出子宮組織,加入蛋白裂解液提取總蛋白,Bradford蛋白定量法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定,取100 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè),電泳后轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶封閉1 h,分別加入p-AKT、p-PI3K、Bcl-2、Bax抗體(濃度1∶1 000),4 ℃搖床孵育過(guò)夜,洗膜,膜與HPR標(biāo)記的抗體孵育1 h,ECL顯色,X膠片顯影。以GAPDH為內(nèi)參,分析相關(guān)蛋白的光密度值。

        2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        2.1 MMC對(duì)各組宮腔黏連大鼠子宮內(nèi)膜組織形態(tài)的影響 對(duì)照組大鼠子宮組織HE染色可見(jiàn)子宮內(nèi)膜的黏膜層為單層柱狀上皮細(xì)胞,黏膜下層可見(jiàn)大量腺體和血管,以及少量成纖維細(xì)胞,未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞。模型組大鼠HE染色可見(jiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂,大量單層柱狀上皮細(xì)胞被上皮細(xì)胞覆蓋,黏膜下層腺體數(shù)量減少,細(xì)胞成纖維化增生增加。實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2大鼠HE染色可見(jiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)輕度紊亂,出現(xiàn)部分成纖維增生細(xì)胞,單層柱狀上皮細(xì)胞增生明顯,腺體數(shù)量有不同程度增加,與模型組比較,細(xì)胞胞漿及細(xì)胞核染色程度較淺,細(xì)胞成纖維化增生數(shù)量明顯減少,其中以實(shí)驗(yàn)組2大鼠最為顯著。見(jiàn)圖1。

        圖1 MMC對(duì)各組宮腔黏連大鼠子宮內(nèi)膜組織形態(tài)的影響

        2.2 MMC對(duì)各組宮腔黏連大鼠子宮組織中PI3K/AKT通道相關(guān)蛋白的影響 與對(duì)照組比較,模型組大鼠子宮組織中p-AKT、PI3K、Bcl-2蛋白均顯著升高,Bax蛋白表達(dá)顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較,各實(shí)驗(yàn)組大鼠p-AKT、PI3K、Bcl-2蛋白均顯著降低,Bax蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);且實(shí)驗(yàn)組2大鼠p-AKT、PI3K、Bcl-2蛋白含量明顯低于實(shí)驗(yàn)組1,Bax蛋白含量明顯高于實(shí)驗(yàn)組1(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖2。

        圖2 MMC對(duì)各組宮腔黏連大鼠PI3K/AKT通道相關(guān)蛋白的影響

        表1 MMC對(duì)各組宮腔黏連大鼠PI3K/AKT通道相關(guān)蛋白的影響

        注:與對(duì)照組比較,*P<0.01;與模型組比較,#P<0.05;與實(shí)驗(yàn)組1比較,△P<0.05

        3 討論

        宮腔黏連是宮腔損傷后繼發(fā)感染引起子宮內(nèi)膜基底層細(xì)胞損傷,成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖,形成瘢痕,最終形成宮腔黏連。宮腔黏連會(huì)引起患者月經(jīng)周期紊亂,甚至閉經(jīng),對(duì)患者受孕及孕期造成嚴(yán)重影響[9-10]。有研究認(rèn)為,減輕對(duì)子宮內(nèi)膜的損傷能有效降低宮腔黏連的發(fā)生率[11]。目前,臨床上常采用宮腔鏡下宮腔黏連分離術(shù)對(duì)黏連組織進(jìn)行分離,并剝離增生瘢痕組織,暴露內(nèi)膜基底層及腺體[12-13]。術(shù)后可放置宮內(nèi)節(jié)育器、Foley導(dǎo)尿管、COOK球囊等將分離后的兩側(cè)宮壁病灶區(qū)隔開(kāi)預(yù)防再次黏連[14]。研究發(fā)現(xiàn),宮腔鏡宮腔黏連剝離術(shù)后給予激素治療,可刺激基底層細(xì)胞及腺體增生遷移,能有效降低宮腔黏連的發(fā)生率,改善患者月經(jīng)狀況[15-17]。目前,治療宮腔黏連主要通過(guò)促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖,但通過(guò)促進(jìn)黏連使成纖維細(xì)胞凋亡抑制宮腔黏連的研究較少。PI3K/AKT通路參與多種生物信息的傳導(dǎo),參與調(diào)控細(xì)胞周期、啟動(dòng)凋亡和細(xì)胞侵襲性等。PI3K主要由p85和p110組成,受多種細(xì)胞分子和理化因子激活,從而激活下游因子AKT。AKT是PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心,下游因子有NF-κB、VEGF、FOXO、BAD、mTOR、Bcl-2等,參與多項(xiàng)生物學(xué)事件,調(diào)控細(xì)胞存活及凋亡等。有研究發(fā)現(xiàn),抑制PI3K/AKT信號(hào)通路可有效降低宮腔黏連的發(fā)生率,而MMC可通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[18]。研究證實(shí),MMC可誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞凋亡。MMC抗代謝、抗增殖,能有效抑制細(xì)胞增殖,尤其是抑制成纖維細(xì)胞增殖,可抑制成纖維細(xì)胞形成膠原蛋白,很大程度上降低了黏連的發(fā)生率[19-20],其作用機(jī)制與通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)[21-22]。已有研究發(fā)現(xiàn),雌激素可顯著降低卵巢早衰大鼠相關(guān)的ERβ、PI3K、AKT及mTOR、mRNA含量,這與上調(diào)PI3K/AKT和mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平有關(guān);亦有研究發(fā)現(xiàn),雌激素可直接激活信號(hào)通路,促進(jìn)細(xì)胞增生,下調(diào)子宮內(nèi)膜癌組織中PR表達(dá)[23-25]。

        本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),模型組大鼠子宮組織形態(tài)細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂,大量單層柱狀上皮細(xì)胞被上皮細(xì)胞覆蓋,黏膜下層腺體數(shù)量減少,細(xì)胞成纖維化增生增加;兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組大鼠細(xì)胞結(jié)構(gòu)輕度紊亂,出現(xiàn)部分成纖維增生細(xì)胞,單層柱狀上皮細(xì)胞增生明顯,腺體數(shù)量具有不同程度增加,說(shuō)明MMC可抑制成纖維細(xì)胞增生,促上皮細(xì)胞再生及腺體恢復(fù)。本研究通過(guò)Western blot檢測(cè)MMC對(duì)宮腔黏連大鼠子宮組織中p-AKT、PI3K、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,模型組大鼠p-AKT、PI3K、Bcl-2蛋白均顯著升高,Bax蛋白表達(dá)顯著降低。實(shí)驗(yàn)組2大鼠p-AKT、PI3K、Bcl-2蛋白含量明顯低于實(shí)驗(yàn)組1,Bax蛋白含量明顯高于實(shí)驗(yàn)組1。進(jìn)一步說(shuō)明MMC聯(lián)合雌激素通過(guò)誘導(dǎo)相關(guān)受體將酪氨酸蛋白酶激活,誘導(dǎo)PI3K活化,通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)至AKT,激活A(yù)KT,AKT中的PH結(jié)構(gòu)可以特異識(shí)別PI3K產(chǎn)物,二者的高親和力使AKT向細(xì)胞膜聚集,進(jìn)一步激活。AKT進(jìn)入胞質(zhì)胞核影響細(xì)胞因子如BAD、mTOR、Bcl-2等,引起后續(xù)的細(xì)胞凋亡。

        綜上所述,本研究通過(guò)建立SD大鼠機(jī)械損傷宮腔黏連模型,在動(dòng)物實(shí)體水平驗(yàn)證MMC對(duì)宮腔黏連大鼠PI3K/AKT信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用,通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜中成纖維細(xì)胞凋亡,降低膠原蛋白分泌,降低宮腔黏連的發(fā)生率,為后期在細(xì)胞水平分析MMC抗纖維化及評(píng)估藥物安全性提供支持。

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