葛志文 高瑀瓏 劉 慧 鄭云飛 邱偉芬

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210023)

作為世界上最大的稻谷生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，我國(guó)稻谷種植面積廣闊，且稻谷儲(chǔ)藏的安全與防控問題一直備受關(guān)注。稻谷的儲(chǔ)藏期一般為3年，儲(chǔ)藏過程中，微生物在適宜的環(huán)境條件下滋生，容易引起儲(chǔ)藏稻谷發(fā)霉、腐爛和變色，直接或間接地影響儲(chǔ)藏稻谷的質(zhì)量和安全[1]。平板計(jì)數(shù)法、菌落形態(tài)特征觀察和菌種鑒定技術(shù)常被使用，然而這些方法存在操作規(guī)程復(fù)雜、分析耗時(shí)、低精度和低重復(fù)性等缺點(diǎn)[2]。為了評(píng)估儲(chǔ)藏稻谷中微生物污染情況，本研究采用一種BIOLOG ECO平板生物學(xué)方法來評(píng)估儲(chǔ)藏稻谷中微生物污染狀況，具有重要意義。

BIOLOG ECO平板法的原理在于：由于微生物的種類和數(shù)量與微生物群落的代謝功能密切相關(guān)，因此通過四唑染色測(cè)定法對(duì)微生物群落代謝功能特性進(jìn)行分析。該測(cè)定法根據(jù)四唑鹽類由原初氧化態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原態(tài)時(shí)呈現(xiàn)的明顯顏色變化，實(shí)現(xiàn)快速表征儲(chǔ)藏稻谷中微生物群落狀況[3]。BIOLOG ECO平板法在很多研究中已有應(yīng)用，如用于研究沉積物[4]、廢水[5]、活性污泥[6]和土壤等[7]。此類平板上有96個(gè)微孔，每32個(gè)微孔為一個(gè)生物學(xué)平行，每板共計(jì)3個(gè)生物學(xué)平行。每個(gè)平行中除對(duì)照孔外各個(gè)孔內(nèi)都含有一種不同的單一碳源和相同含量的四唑紫染料。群落中微生物在利用碳源的過程中產(chǎn)生自由電子，與四唑紫染料反應(yīng)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生顏色變化，孔的吸光度變化反映了微生物對(duì)碳源的利用程度，即反映了環(huán)境樣品微生物群落的代謝功能特性。不同微生物類群利用碳源的能力不同，產(chǎn)生的不同吸光度變化即可表征微生物群落差異[8]。

但是，在稻谷儲(chǔ)藏領(lǐng)域，目前對(duì)微生物群落水平代謝功能性的研究很少。在本研究中，利用BIOLOG ECO平板對(duì)儲(chǔ)藏稻谷微生物群落的代謝功能特性進(jìn)行了分析，探討了不同儲(chǔ)藏期限與儲(chǔ)藏稻谷微生物群落之間的關(guān)系，為稻谷安全儲(chǔ)藏與防控提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

稻谷樣品依照三層五點(diǎn)法(糧庫(kù)上、中、下三層，每層四個(gè)角落和中間設(shè)為采樣點(diǎn))從安徽省現(xiàn)代糧食物流中心庫(kù)采集，包括未儲(chǔ)藏、儲(chǔ)藏1年、儲(chǔ)藏2年和儲(chǔ)藏3年四種樣品，四種稻谷樣品均來自相同地域。稻谷樣品在溫度(20±5)℃和相對(duì)濕度(50±5)%的糧庫(kù)常規(guī)儲(chǔ)藏條件下進(jìn)行儲(chǔ)藏。取樣后，每種樣品每層每點(diǎn)稱量10 g，混合均勻，制得150 g的混合樣品，分別標(biāo)記為S0、S1、S2和S3，在均質(zhì)袋中4 ℃保藏。

1.2 儀器

SF-CF-2A超凈工作臺(tái)；VOSHIN-600R無菌均質(zhì)機(jī)；ES-08B電子天平；BIOLOG ECO平板；SpectraMax M2e多功能酶標(biāo)儀。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理與平板加樣

分別稱取25.00 g稻谷樣品于250 mL三角瓶中，加入225 mL 0.85%無菌生理鹽水，在4 ℃以200 r/min振蕩浸提1 h，靜置3 min后分別將樣品梯度稀釋至10-2倍，每個(gè)樣品做三個(gè)平行，將三個(gè)平行的菌液混合均勻后，用8道加樣槍吸取150 μL至 BIOLOG ECO平板的微孔中，在25 ℃下培養(yǎng)，每隔24 h用酶標(biāo)儀在590 nm(顏色+濁度)和750 nm(濁度)讀取數(shù)據(jù)。

1.3.2 AWCD值的計(jì)算

BIOLOG ECO平板上的平均吸光度變化值(AWCD)用以衡量微生物利用不同碳源的能力，通常經(jīng)過對(duì)一系列單時(shí)間點(diǎn)的AWCD值變化趨勢(shì)，以及樣品間AWCD值單因素方差分析來比較樣品間微生物群落代謝特性的不同。一般認(rèn)為AWCD值較大的樣品具有較高的碳源利用能力，也往往具有較高的微生物豐度。某時(shí)刻平板內(nèi)平均色度的計(jì)算公式為:

(1)

式中：Ci為不同時(shí)刻除對(duì)照孔外的各反應(yīng)孔在590 nm和750 nm下的吸光度差值，R為對(duì)照孔在590 nm和750 nm下的吸光度差值，n為碳源數(shù)。Ci-R小于0.06的孔計(jì)算時(shí)記為零[9]。

1.3.3 多樣性指數(shù)的計(jì)算

除AWCD值之外，多樣性指數(shù)的計(jì)算也是一種常用的單時(shí)間點(diǎn)計(jì)算單一數(shù)值指標(biāo)的方法。依照度量動(dòng)植物多樣性的思想，Zak[10]等提出基于BIOLOG ECO微平板的功能多樣性指數(shù)的計(jì)算方法。

1.3.3.1 Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H′)

H′=-∑PilnPi

(2)

Pi=(Ci-R)/∑(Ci-R)

式中:Pi為每一孔吸光度除以所有孔吸光度的和。通過(Ci-R)與除法對(duì)變量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，消除在點(diǎn)樣及培養(yǎng)過程中對(duì)吸光度變化帶來的影響誤差。

1.3.3.2 Shannon均勻度指數(shù)(E)

E=H′/lnS

(3)

式中：S為微生物可以利用的碳源數(shù)目，即顏色有變化的孔數(shù)。

1.3.3.3 Simpson 多樣性指數(shù)(D)

D=1-∑Pi2

(4)

1.3.3.4 McIntosh多樣性指數(shù)(U)

(5)

式中：ni為第i孔的相對(duì)吸光值(Ci-R)。

1.3.3.5 McIntosh均勻度指數(shù)(E)

(6)

式中：S為顏色變化的孔的數(shù)目，N是相對(duì)吸光度值總和。

以上指數(shù)均表征微生物群體利用碳源能力的多樣性，同普通生態(tài)學(xué)中多樣性指數(shù)含意。

1.3.4 主成分分析(PCA)

本研究?jī)煞N基于對(duì)單一數(shù)值的比較方法具有方便直觀的特點(diǎn)，但由于這種計(jì)算方法不考慮碳源的分布方式，無差異的對(duì)待不同碳源產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，與樣品真實(shí)情況產(chǎn)生差異，因此本研究也從多維數(shù)據(jù)角度進(jìn)行分析。

一個(gè)BIOLOG ECO微孔板上含有31種碳源類型，其中分為羧酸類、碳水化合物類、氨基酸類、聚合物類、雙親化合物類和胺類。為避免微生物群落代謝差異對(duì)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果產(chǎn)生影響，利用對(duì)采集的吸光度數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)變換后獲得的Rsi值進(jìn)行PCA分析。

Rsi= (Ci-R) /AWCD

(7)

式中：Ci為不同時(shí)刻除對(duì)照孔外的各反應(yīng)孔在590 nm下的吸光度值；R為對(duì)照孔的吸光值。

經(jīng)過BIOLOG ECO平板培養(yǎng)第9天后，儲(chǔ)藏稻谷的微生物群落代謝功能達(dá)到穩(wěn)定期，選取該時(shí)間點(diǎn)的吸光度值進(jìn)行主成分分析，得出的結(jié)果更為接近儲(chǔ)藏稻谷微生群落代謝功能的真實(shí)狀態(tài)。采用SPSS 19.0和Origin 8.5軟件進(jìn)行分析與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同儲(chǔ)藏年限稻谷微生物群落在培養(yǎng)期間內(nèi)平均色度變化率

AWCD(Average well color development，平均色度變化率)是反映儲(chǔ)藏稻谷微生物群落代謝活性，即微生物利用單一碳源能力的重要指標(biāo)[11]。在試驗(yàn)中，應(yīng)用BIOLOG ECO生態(tài)微板在單時(shí)間點(diǎn)上計(jì)算單個(gè)值(AWCD)來確定碳源的代謝率，更準(zhǔn)確地對(duì)儲(chǔ)藏稻谷微生物群落的碳源代謝活性與多樣性進(jìn)行比較。根據(jù)式(1)，繪制本研究中不同儲(chǔ)藏年限稻谷樣品微生物群落利用總碳源的AWCD變化曲線，如圖1所示。

圖1 不同儲(chǔ)藏年限稻谷AWCD隨時(shí)間的變化

結(jié)果顯示，四種不同儲(chǔ)藏期限稻谷微生物群落的AWCD值在培養(yǎng)第1天均處于延滯期。從第2天起，AWCD值均呈現(xiàn)明顯增加趨勢(shì)并持續(xù)升高，表明微生物群落開始在平板上代謝利用有機(jī)碳源物質(zhì)。選擇4種樣品第1天到第9天的AWCD值進(jìn)行代謝活性分析，在這段期間內(nèi)的斜率代表微生物群落代謝的平均速率。AWCD值的增加速率在第3天以后越來越小，在培養(yǎng)第9天，AWCD值變化達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，表明微生物群落中可培養(yǎng)微生物在培養(yǎng)期內(nèi)利用碳源的功能相對(duì)穩(wěn)定。

未儲(chǔ)藏新鮮稻谷(S0)的AWCD值明顯高于其他儲(chǔ)藏年限的稻谷，從0增加到0.969 8。儲(chǔ)藏1年稻谷的微生物群落代謝速率最小，從0增加到0.731 3，表明稻谷在未儲(chǔ)藏期，其微生物群落代謝功能最旺盛，而儲(chǔ)藏1年后，稻谷的微生物群落代謝功能明顯小于其他儲(chǔ)藏年限的稻谷。在儲(chǔ)藏期，儲(chǔ)藏稻谷中微生物群落的代謝功能呈現(xiàn)出先減小后增加的趨勢(shì)，在儲(chǔ)藏1年后微生物群落代謝功能達(dá)到最低，其后隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，微生物群落利用碳源的能力逐漸增加。以上結(jié)果分析可得，不同儲(chǔ)藏年限稻谷微生物群落間的代謝功能多樣性存在差異，且未儲(chǔ)藏的稻谷微生物群落與儲(chǔ)藏一定期限的稻谷微生物群落間存在差異。

2.2 不同儲(chǔ)藏年限稻谷微生物群落利用不同種類碳源的動(dòng)力學(xué)特征

根據(jù)化學(xué)基團(tuán)的性質(zhì)，將ECO板上的31種碳源分成6類，即氨基酸類、聚合物類、雙親化合物類、胺類、羧酸類、碳水化合物類[12]。為考察儲(chǔ)藏稻谷微生物對(duì)不同碳源類型的利用情況，按照式(1)計(jì)算每類碳源的AWCD值并分別作圖。

由圖2可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，儲(chǔ)藏稻谷微生物對(duì)6類碳源利用的AWCD值均呈現(xiàn)不斷增加的趨勢(shì)。不同的微生物群落，其對(duì)6類碳源的利用能力不同。碳水化合物的AWCD值最高，氨基酸類和聚合物類的AWCD值相近且略低于碳水化合物，最低的是雙親化合物類，這表明儲(chǔ)藏稻谷微生物群落對(duì)碳水化合物類碳源的代謝利用率最高，對(duì)雙親化合物類碳源的利用率最低。

圖2 不同儲(chǔ)藏年限稻谷對(duì)不同碳源的利用

對(duì)不同碳源的4種儲(chǔ)藏稻谷樣品AWCD值之間進(jìn)行方差分析(表1)，結(jié)果表明：在6類碳源中，儲(chǔ)藏稻谷微生物群落對(duì)于氨基酸類、聚合物類、雙親化合物類、羧酸類和碳水化合物類的碳源利用率沒有顯著差異。但是，在利用胺類碳源上，儲(chǔ)藏稻谷的微生物群落的碳源利用率呈顯著差異 (P<0.05)，利用能力大小順序?yàn)镾0>S1>S3>S2。

在儲(chǔ)藏過程中，由于田間微生物與儲(chǔ)藏微生物的演替以及糧庫(kù)通風(fēng)、熏蒸等措施，均會(huì)對(duì)儲(chǔ)藏稻谷的微生物群落產(chǎn)生影響[13]。此外，稻谷儲(chǔ)藏年限不同，其微生物群落對(duì)6類碳源中胺類碳源的利用存在顯著差異，可依此作為辨別儲(chǔ)藏稻谷微生物污染滋生程度的指標(biāo)開發(fā)建立快速識(shí)別方法，這是今后需研究解決的問題。

表1 不同碳源四種儲(chǔ)藏稻谷AWCD值的方差分析

2.3 多樣性指數(shù)

微生物群落的代謝功能多樣性可由功能多樣性指數(shù)反映，表2顯示了不同儲(chǔ)藏年限稻谷微生物群落的Shannon多樣性指數(shù)(H')、Shannon均勻度指數(shù)(E)、Simpson指數(shù)(D)、McIntosh多樣性指數(shù)(U)、McIntosh均勻度指數(shù)(E)。Shannon多樣性指數(shù)(H')在很大程度上受到群落物種豐富度的影響。多樣性指數(shù)越高，表明儲(chǔ)藏稻谷微生物群落的代謝功能多樣性越大。Shannon均勻度指數(shù)(E)越高，微生物群落中物種數(shù)分布越均勻[14]。

由表2知，S0的微生物群落在Shannon多樣性指數(shù)和Shannon均勻度指數(shù)上與其他儲(chǔ)藏年限稻谷有顯著差異(P<0.05)。S0的Shannon多樣性和均勻度指數(shù)最高，其次是S1、S2和S3，表明稻谷在未儲(chǔ)藏時(shí)，儲(chǔ)藏稻谷中微生物的豐富性和均勻性最高，儲(chǔ)藏環(huán)境使得微生物群落豐富性和均勻性有所下降。隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，多樣性指數(shù)和均勻度均有相應(yīng)地增加。然而，四種儲(chǔ)藏稻谷的Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù)間沒有顯著的差異，表明四種儲(chǔ)藏稻谷微生物群落中最常見的物種是相似的。

2.4 主成分分析

主成分分析被應(yīng)用在多元分析中，用來評(píng)估在特定環(huán)境下微生物群落的碳源代謝情況并區(qū)分不同樣品微生物群落之間的差異。通過降維，不同儲(chǔ)藏年限稻谷間微生物群落代謝特征的差異通過在主向量空間中的點(diǎn)位置差異直接反映出來。如圖3所示，多元向量被轉(zhuǎn)換成兩個(gè)不相關(guān)的主分量向量。第1、2主成分分別占總變異的62.696%和13.157%，第1主成分是變異的主要來源。由圖知，稻谷樣品S0,S1,S2分布點(diǎn)的位置與其他稻谷樣品的分布點(diǎn)的位置存在顯著的間距，而其他稻谷樣品間的點(diǎn)位置均相近，說明未儲(chǔ)藏新鮮稻谷的微生物群落代謝功能特性與儲(chǔ)藏期內(nèi)稻谷的微生物群落代謝功能特性存在顯著差異，儲(chǔ)藏期內(nèi)稻谷間微生物群落的代謝功能特性差異不顯著，說明儲(chǔ)藏環(huán)境會(huì)對(duì)儲(chǔ)藏稻谷微生物群落代謝功能產(chǎn)生一定的影響。

表2 稻谷微生物群落代謝功能多樣性指數(shù)比較

注：表格中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n=4。對(duì)每類多樣性指數(shù)采用Duncan多重范圍檢驗(yàn)分析，每一列不同的小寫字母(a,b)表示樣品間差異的顯著性(P<0.05)，樣品間字母相同表示之間差異不顯著，不同則表示差異顯著。

表3 BIOLOG ECO平板上31種碳源在第1、2主成分上的載荷值

注：未儲(chǔ)藏新鮮稻谷3組平行樣品標(biāo)記為S01,S02,S03;儲(chǔ)藏1年稻谷標(biāo)記為S11,S12,S13;儲(chǔ)藏2年稻谷標(biāo)記為S21,S22,S23;儲(chǔ)藏3年稻谷標(biāo)記為S31,S32,S33。圖3 不同儲(chǔ)藏年限稻谷微生物群落功能特性主成分分析得分圖

從6類碳源中31種碳源在2個(gè)主成分上的載荷值在表4中可見，除吐溫40，α-環(huán)式糊精，D-木糖，D-半乳糖醛酸，D-葡萄糖氨酸，衣康酸和L-蘇氨酸外，其余24種碳源均集中在第1主成分上，決定了主成分1的變異，主要包括雙親化合物類、氨基酸類、羧酸類、碳水化合物類和胺類。影響主成分2變異的碳源主要包括1-磷酸葡萄糖，D,L-α-磷酸甘油，4-羥基苯甲酸，衣康酸，苯乙胺和腐胺，主要屬于雙親化合物類和胺類。綜合第1、2主成分結(jié)果，被稻谷微生物群落特異利用的碳源有：D-木糖，衣康酸與主成分1呈顯著負(fù)相關(guān)，而與主成分2呈顯著正相關(guān)；丙酮酸甲酯，N-乙酰-D-葡萄糖胺，2-羥基苯甲酸與主成分1呈顯著正相關(guān)，而與主成分2呈顯著負(fù)相關(guān)。

3 結(jié)論

稻谷在未儲(chǔ)藏期，其微生物群落代謝功能最旺盛，在儲(chǔ)藏1年后微生物群落代謝功能達(dá)到最低，其后隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，微生物群落代謝功能逐漸增加。

在6類碳源利用中，4種稻谷樣品的微生物群落對(duì)碳水化合物類碳源的代謝利用能力最強(qiáng)，且其對(duì)胺類碳源的代謝利用間存在顯著差異(P<0.05)。

未儲(chǔ)藏新鮮稻谷的微生物群落多樣性最大，進(jìn)入儲(chǔ)藏期后，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，微生物群落多樣性呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。

通過主成分分析發(fā)現(xiàn)，未儲(chǔ)藏新鮮稻谷微生物群落的代謝功能與其他儲(chǔ)藏年限稻谷微生物群落的代謝功能存在顯著的差異。