張朝昱， 張 先， 趙 鵬， 李范洙

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延吉 吉林 133000)

氧化損傷是指有害刺激對機(jī)體作用時，體內(nèi)增加的自由基打破氧化與抗氧化系統(tǒng)的平衡，氧化水平高出了抗氧化系統(tǒng)的處理能力，從而導(dǎo)致的組織損傷[1-2]。男性的睪丸受氧化損傷時常伴隨有腎陽虛癥狀，動物實(shí)驗(yàn)證明，腎陽虛模型小鼠血清中丙二醛( malondialdehyde，MDA) 含量高，超 氧 化 物 歧 化 酶 ( Superoxide dismutase，SOD) 活 性 低[3]，機(jī)體抗氧化能力已不足以清除體內(nèi)多余的活性氧簇(ROS)，進(jìn)而導(dǎo)致體內(nèi)的組織細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，甚至凋亡等[4]。目前男性腎陽虛型氧化損傷涉及的一系列復(fù)雜生理過程尚未理清，臨床治療不切實(shí)際，而通過選擇天然保健品的研究開發(fā)，進(jìn)而安全有效防治腎陽虛癥狀的氧化損傷則是當(dāng)下的最佳選擇。寒蔥(AlliumVictorialisL.)學(xué)名茖蔥，別名旱蔥，為百合科多年生草本植物，享有“菜中靈芝”的美譽(yù)。和寒蔥同屬于百合科蔥屬類的韭菜提取物具有抗腎陽虛癥狀的氧化損傷作用[5-6]，因此，本試驗(yàn)檢測了各實(shí)驗(yàn)組大鼠血清中的SOD活性、MDA含量、睪酮(Testosterone，T)含量和生殖器官系數(shù)、睪丸組織，旨在探索寒蔥提取物對大鼠氧化損傷的修復(fù)和腎陽虛癥狀的改善作用，從而為天然保健食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

寒蔥取自于2017年吉林省延邊地區(qū)的野生寒蔥；SD雄性大鼠，月齡約4個月，體重為(200±20) g，[實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)2015-0001]，購于遼寧省長生生物技術(shù)有限公司，自由飲食飲水。

氫化可的松注射液(河南潤弘制藥股份有限公司)；SOD -ELISA 試劑盒,MDA -ELISA 試劑盒,睪酮試劑盒,蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染液(南京建成生物工程研究所)。

MultiskanMK3酶標(biāo)儀(Thermo fisher公司)；Q5000型超微量紫外分光光度計(jì)(美國Quawell公司)；CT15RT型臺式高速冷凍離心機(jī)(上海天美儀器設(shè)備工程有限公司)；CUT4062型石蠟切片機(jī)(德國SLEE公司)；O-lympusBH-2型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 寒蔥提取物的制備

1) 水提取物的制備 取寒蔥鮮葉1 kg，先用15 L蒸餾水浸泡24 h后回流提取2 h，過濾后再用10 L蒸餾水回流提取1 h，過濾后的濾渣加入5 L蒸餾水回流提取30 min后再次過濾，合并3次所得濾液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮成浸膏，將其放入-80 ℃速凍，再用冷凍干燥機(jī)凍干后取出研磨成粉末，置-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹7-8]。

2) 乙醇提取物的制備 取鮮葉1 kg，先用10 L 80%乙醇浸泡24 h后回流提取2 h，過濾后的濾渣加入10 L 80%乙醇回流提取2 h，過濾后的濾渣加入10 L 80%乙醇回流提取2 h后再次過濾，合并3次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙醇濃縮至浸膏，將寒蔥醇提取物放入-80 ℃下速凍，然后用冷凍干燥機(jī)凍干后取出研磨成粉末，置-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 寒蔥提取物的總酚與總黃酮的定量分析

總酚含量測定采用福林試劑法[9]。均勻稱取一定質(zhì)量寒蔥粗提物，放入250 mL燒杯中，加入60 mL 80%乙醇勻漿提取，然后過濾得到濾液，把殘?jiān)?0%乙醇再提取1次，抽濾合并2次濾液，最后定容到250 mL，即為待測液。

總黃酮含量的測定采用紫外分光光度法[10]。稱取2.0 g左右的寒蔥粗提物，用石油醚脫脂4 h，再用70%乙醇加熱回流2 h，抽濾，所得殘?jiān)?0%乙醇進(jìn)行超聲提取30 min，抽濾，合并2次濾液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，70%乙醇清洗定容到50 mL，即為待測液。

1.2.3 大鼠腎陽虛模型的制備與行為觀察和給藥劑量

在實(shí)際的建筑工程施工過程中，一些建筑企業(yè)為了自己的經(jīng)濟(jì)利益，縮減管理人員編制，導(dǎo)致在工程管理控制過程中，往往是一人身兼數(shù)職，管理效果大打折扣，無法有效地控制施工維持在相對安全的條件下，無法監(jiān)控每一個施工環(huán)節(jié)保證自身質(zhì)量。而且一旦某一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，也比較難以追查最終責(zé)任負(fù)責(zé)人。導(dǎo)致公司施工管理以及質(zhì)量控制工作目標(biāo)不能實(shí)現(xiàn)。

動物試驗(yàn)分寒蔥水提物、醇提物2批次進(jìn)行，每批試驗(yàn)用40只大鼠隨機(jī)分為5組，每組8只，分為正常組、模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，除正常組外，其他4組每日上午9點(diǎn)雙側(cè)后肢肌注射0.025 g/(kg·d)氫化可的松[11]，正常組每日注射等體積的生理鹽水，從給藥開始，每3 d觀察并記錄所有大鼠的體重、毛質(zhì)變化、排便情況、脫毛狀況、體溫變化、耳朵顏色變化及活動狀態(tài)等[12]，連續(xù)注射2周。注射1周后，各組開始給予相應(yīng)處理，每天注射結(jié)束1 h之后再進(jìn)行灌胃，寒蔥提取物低、中、高劑量組的灌胃劑量分別為0.4、0.8和1.0 g/(kg·d)，連續(xù)灌胃4周。

1.2.4 大鼠生殖器官系數(shù)的測定

試驗(yàn)最后1 d對各組大鼠稱重后進(jìn)行乙醚麻醉，固定于木板開腹，心臟快速采血，之后取出大鼠的雙側(cè)腎臟、睪丸、附睪、前列腺和精囊，采用精密天平稱取各組織濕重并記錄[13-14]。生殖器官系數(shù)以器官重量除以大鼠體重的百分比表示。

1.2.5 大鼠血清中SOD、MDA和睪酮的測定

大鼠血清中SOD活性、MDA和睪酮含量的測定均嚴(yán)格按照各自試劑盒說明書操作。

1.2.6 睪丸切片染色觀察

采用HE染色法，取睪丸組織經(jīng)10%甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，染色切片在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察和圖像分析[11]。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件處理，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用Duncan多重比較法和T檢驗(yàn)法對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析，P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 寒蔥提取物中總酚和總黃酮含量

酚類、黃酮類化合物是蔥屬植物中主要的生物活性物質(zhì)之一，包括酚酸、槲皮素及一些衍生化合物[15]。由表1可知，寒蔥水提物中總酚含量為2.71%，總黃酮含量為9.71 mg/g，均顯著高于醇提物中的總酚(1.89%)和總黃酮(6.98 mg/g)含量，說明寒蔥水提物和醇提物的化學(xué)組分上可能存在差異。蔥屬植物韭菜的抗氧化活性與其總黃酮和總酚含量存在明顯的相關(guān)性[5]，可以推測，寒蔥水提物和醇提物的抗氧化活性可能存在差異。

表1 寒蔥提取物中總酚和總黃酮含量Table 1 Contents of total phenols and flavonoids in the extracts of Allium Victorialis

注：同一行中不同小字母代表組間差異顯著(P<0.05)。

2.2 腎陽虛建模行為觀察

注射氫化可的松第9天開始，與正常組相比均出現(xiàn)不同程度的食物量下降,飲水量、尿量增多，活動減少、圍縮在一起的現(xiàn)象。而隨著注射天數(shù)增多，逐漸出現(xiàn)體重增長緩慢、體溫下降、反應(yīng)遲鈍、弓背畏寒、體毛稀疏失去光澤等陽虛癥狀。試實(shí)驗(yàn)組隨著寒蔥提取物給予時間的增加，各種狀況日趨好轉(zhuǎn)，尿量趨于正常，體毛也逐漸生長，恢復(fù)光澤，活動亦增多。

2.3 寒蔥提取物對大鼠生殖器官系數(shù)的影響

動物生殖器官系數(shù)是檢測生物體內(nèi)器官是否損傷或修復(fù)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。由表2，3可知，模型組的腎臟、附睪、睪丸和精囊+前列腺系數(shù)均比正常組低，且差異顯著，說明氫化可的松的注射導(dǎo)致了雄性大鼠生殖器官的損傷，但是經(jīng)不同劑量的寒蔥提取物灌服處理后，其腎臟、附睪、睪丸和精囊+前列腺的生殖器官系數(shù)均顯著高于模型組，且高劑量組均基本恢復(fù)到正常水平，說明寒蔥水提物和醇提物對氫化可的松誘導(dǎo)的器官損傷具有顯著的修復(fù)作用。

表2 寒蔥水提物對腎陽虛雄性大鼠生殖器官系數(shù)影響(N=8)Table 2 Effect of water extract of Allium Victorialis on the viscera coefficient in male rats (%)

注：同一列中不同小字母代表組間差異顯著(P<0.05)，下同。

2.4 寒蔥提取物對大鼠血清中MDA含量的影響

細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物MDA是反映機(jī)體受自由基攻擊嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)之一。寒蔥提取物對大鼠血清中MDA的影響如表4所示。模型組大鼠血清中MDA的含量顯著高于正常組，寒蔥提取物處理組MDA的含量比模型組低且差異顯著；而不同劑量處理組間比較，寒蔥水提物低劑量處理組顯著高于中劑量和高劑量處理組，醇提物低劑量組則與高劑量組差異顯著，寒蔥水提物和醇提物高劑量組的MDA含量分別為4.234和3.722 nmol/mL，與正常組水平比較均無顯著差異。從而可知寒蔥提取物可以降低大鼠血清中的MDA含量，對腎陽虛癥狀的氧化損傷具有較好的修復(fù)作用。

表4 寒蔥提取物對腎陽虛雄性大鼠血清中MDA含量的影響(N=8)Table 4 Effect of extract of Allium Victorialis on the MDA content in serum of male rats (nmol/L)

2.5 寒蔥提取物對大鼠血清中SOD活性的影響

SOD是一種源于生命體的活性物質(zhì)，能有效消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的自由基，進(jìn)而緩解或避免氧化損傷。寒蔥提取物對腎陽虛雄性大鼠血清中SOD活性的影響如表5所示。模型組大鼠血清中SOD活性顯著低于正常組，而寒蔥提取物處理組的SOD活性均比模型組高且差異顯著。寒蔥水提取物和SOD活性間存在劑量效應(yīng)，隨處理劑量的增加SOD活性也提高，各劑量間存在顯著差異；而醇提物低劑量和中劑量處理組間無顯著差異，但是均顯著低于高劑量組。由此可知，寒蔥提取物可提高腎陽虛大鼠血清中SOD活性，使大鼠的抗氧化系統(tǒng)逐步恢復(fù)到正常。

表5 寒蔥提取物對腎陽虛雄性大鼠血清中SOD活性的影響(N=8)Table 5 Effect of extract of Allium Victorialis on the SOD content in serum of male rats (U/mL)

2.6 寒蔥提取物對大鼠睪丸組織的影響

在100倍光學(xué)顯微鏡下觀察了經(jīng)HE染色的各組睪丸組織，正常組的組織排列整齊，生精小管排列整齊，精原細(xì)胞及不同發(fā)育階段的精母細(xì)胞，精子細(xì)胞和精子等清晰可見，各細(xì)胞結(jié)構(gòu)層次分明，生精上皮細(xì)胞豐富飽滿，間質(zhì)細(xì)胞豐富(圖1，A)。與正常組相比，模型組組織形狀不規(guī)整，生精小管排列紊亂，管腔內(nèi)有部分細(xì)胞脫落，生精上皮細(xì)胞變薄，精子數(shù)量變少(圖1，B)。與模型組相比，寒蔥提取物處理組的睪丸生精上皮細(xì)胞變的豐富，組織排列整齊，生精小管排列整齊，腔內(nèi)精子數(shù)量變多，間質(zhì)細(xì)胞增多，細(xì)胞脫落現(xiàn)象減少，其中水提物(圖1，C)和醇提物(圖1，F(xiàn))高劑量組則與正常大鼠睪丸微細(xì)結(jié)構(gòu)差異不大，基本恢復(fù)到正常水平。由此可見，氫化可的松注射誘導(dǎo)的腎陽虛大鼠經(jīng)服用寒蔥提取物后，對睪丸組織損傷的改善效果顯著。

注: A-正常組；B-模型組；C-水提高劑量組；D-水提中劑量組；E-水提低劑量組；F-醇提高劑量組；G-醇提中劑量組；H-醇提低劑量組。

圖1 寒蔥提取物對雄性大鼠睪丸組織的影響(睪丸組織 HE染色 100×)
Fig.1 Effect of extract ofAlliumVictorialison the testicular tissue of male rats

2.7 寒蔥提取物對大鼠血清中睪酮含量的影響

生物體內(nèi)的大部分睪酮是由睪丸組織中的賴迪細(xì)胞產(chǎn)生的，它是控制男性生殖器官和男性副性征發(fā)育的一種重要激素。由表6可知，模型組與正常組相比睪酮含量顯著降低，說明氫化可的松的注射可能導(dǎo)致睪丸組織中賴迪細(xì)胞的損傷，使睪酮含量顯著降低。但灌服寒蔥提取物后，大鼠血清中睪酮含量顯著上升，且中劑量組已恢復(fù)到正常組水平，高劑量組則高于正常組水平，說明寒蔥水提物和醇提物均可提高腎陽虛大鼠血清中睪酮含量。

表6 寒蔥提取物對腎陽虛雄性大鼠血清中睪酮含量的影響(N=8)

3 討論

本試驗(yàn)以野生寒蔥為試驗(yàn)材料，以SD雄性大鼠為試驗(yàn)動物，通過設(shè)置正常組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組來研究寒蔥提取物對腎陽虛大鼠血清中的SOD、MDA及睪丸組織的影響。注射氫化可的松14 d后，發(fā)現(xiàn)模型大鼠出現(xiàn)食欲減退、消瘦、被毛凌亂無光澤、弓背、反應(yīng)遲鈍、運(yùn)動遲緩、大便清稀、尿量增多等一系列腎陽虛癥狀，初步認(rèn)為雄性大鼠造模成功。給予寒蔥提取物28 d后，上述癥狀與模型組相比明顯改善且隨寒蔥灌胃劑量的增加，改善效果顯著。

目前“自由基學(xué)說”是細(xì)胞損傷的重要機(jī)制之一，認(rèn)為當(dāng)細(xì)胞處于一種氧化失衡的狀態(tài)，便會發(fā)生氧化損傷，甚至凋亡等。睪酮缺乏是男性腎陽虛發(fā)生的重要原因[16]，睪酮在睪丸的賴迪細(xì)胞中合成，受黃體生成素的調(diào)控[17]。當(dāng)機(jī)體處于氧化損傷狀態(tài)時，賴迪細(xì)胞中ROS的積累會使線粒體功能紊亂[18]。同時有研究發(fā)現(xiàn)，ROS可能通過抑制Nur77 的轉(zhuǎn)錄減少睪酮合成酶基因的表達(dá)，導(dǎo)致睪酮合成下降[19]。該試驗(yàn)通過檢測發(fā)現(xiàn)，腎陽虛雄性大鼠血清的SOD活性下降，MDA 含量上升，睪酮含量下降，表明雄性大鼠體內(nèi)已發(fā)生氧化損傷[20-21]，而在灌胃寒蔥提取物后，則顯著減少了MDA的堆積并使SOD活性增加，睪酮含量上升，可認(rèn)為寒蔥提取物提高了腎陽虛雄性大鼠機(jī)體內(nèi)的抗氧化能力，進(jìn)而緩解了大鼠的腎陽虛癥狀；同時通過觀察發(fā)現(xiàn)，寒蔥提取物處理組與模型組相比，大鼠生殖器官系數(shù)顯著上升，睪丸生精上皮細(xì)胞變得豐富，生精小管排列整齊，腔內(nèi)精子數(shù)量變多，間質(zhì)細(xì)胞增多，說明寒蔥提取物可促進(jìn)腎臟、睪丸、附睪、精囊、前列腺等生殖器官的生長并對睪丸組織的損傷具有很好的修復(fù)作用。綜上可知，寒蔥提取物可能通過維持機(jī)體氧化還原系統(tǒng)的平衡來對生殖器官組織細(xì)胞的修復(fù)起到積極作用，且高劑量組的效果最顯著，已接近于正常組水平。寒蔥水提物的總酚、總黃酮含量顯著高于醇提物，但由于動物試驗(yàn)分2批次進(jìn)行，無法對2組的MDA、SOD和睪酮數(shù)據(jù)及腎臟系數(shù)、睪丸組織變化進(jìn)行比較分析，關(guān)于寒蔥水提物和醇提物對腎陽虛大鼠機(jī)體的抗氧化作用以及睪丸組織的影響是否存在差異，如果有差異，是否與寒蔥提取物的酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)有直接關(guān)系還需進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

寒蔥提取物使腎陽虛雄性大鼠血清中的氧化損傷因子MDA含量減少，抗損傷因子SOD活性增加，睪酮含量上升，氧化應(yīng)激系統(tǒng)恢復(fù)正常，腎陽虛癥狀消失；寒蔥提取物對腎陽虛大鼠腎臟、睪丸組織的損傷有很好的修復(fù)作用；寒蔥提取物對腎陽虛雄性大鼠體內(nèi)的SOD、MDA及睪丸組織的影響存在劑量效應(yīng)。