楊麗萍, 王 悅, 孟大偉, 吳艷菊, 金太成

(吉林師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 四平 136000)

植物的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化方法已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于植物品種的改良，其中，最常用的2種方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法?；驑尫▽?dǎo)入的外源基因存在拷貝數(shù)較多及遺傳不穩(wěn)定等缺點，大多數(shù)植物的遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法來導(dǎo)入外源基因。

自從1983年人們利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法將外源基因?qū)霟煵?Nicotianabenthamiana)中獲得成功以來，人們多次利用葉盤轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)基因煙草[1-3]，因其轉(zhuǎn)化周期短、易于培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用。近年來，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)改變了植物形態(tài)特征，提高了作物的品質(zhì)性狀、代謝功能及非生物脅迫等[4-5]。Vasil和Webb首次提出利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將外源基因?qū)肽敛葜?，并獲得轉(zhuǎn)基因苜蓿[6-7]。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是世界上分布最廣的一種牧草，具有適應(yīng)性強和干草產(chǎn)量高等優(yōu)點[8]。由于紫花苜蓿的體細胞難培養(yǎng)、再生周期長、轉(zhuǎn)化效率低等特點，研究者對轉(zhuǎn)基因苜蓿的研究受到了限制。目前，植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)已經(jīng)成為重點研究內(nèi)容。干旱脅迫和鹽脅迫等嚴重影響了植物生長，進行苜蓿品種的抗逆性育種研究已經(jīng)迫在眉睫[9]。苜蓿的離體再生途徑主要有體細胞胚發(fā)生途徑和器官發(fā)生途徑。其中，通過器官發(fā)生途徑獲得轉(zhuǎn)基因植株的研究已有成功的報道[10]，而大多數(shù)苜蓿再生體系是通過胚狀體發(fā)生途徑來獲得苜蓿再生植株[11-12]。

本研究以擬南芥(Arabidopsis)和紫花苜蓿作為材料，研究了農(nóng)桿菌濃度、侵染壓力等對轉(zhuǎn)化的影響，旨在建立一種快速、高效的穩(wěn)定表達體系，為植物遺傳轉(zhuǎn)化體的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

擬南芥種子用無菌水清洗干凈，將其放在鋪有濕潤紗布的培養(yǎng)皿上進行發(fā)芽，每個培養(yǎng)皿中培養(yǎng)50粒種子，溫度設(shè)置為25 ℃，光照條件設(shè)置為16 h光照，8 h黑暗，相對濕度設(shè)置為80%。待發(fā)芽種子長到1 cm左右時作為試驗材料。

1.2 真空侵染體系的建立與優(yōu)化

首先對農(nóng)桿菌細胞濃度OD600進行優(yōu)化，將農(nóng)桿菌重懸液的濃度設(shè)為OD600=0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6，真空侵染壓力0.07 MPa，真空侵染時間3 min。

對發(fā)芽種子進行真空侵染，真空侵染壓力的大小也會影響農(nóng)桿菌的侵染效率。將發(fā)芽種子置于含有農(nóng)桿菌重懸液OD600=1.2的培養(yǎng)皿中，真空侵染壓力分別設(shè)為0.05、0.06、0.07和0.08 MPa侵染3 min。將上述進行真空侵染的發(fā)芽種子播種于花盆中，培養(yǎng)15 d后檢測GUS表達效率(表達GUS植株占總株數(shù)的百分比)。

1.3 擬南芥真空侵染植物的GUS染色

通過GUS染色法鑒定外源基因的表達，取1個1.5 mL的離心管，放入轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的根莖葉，加入適量配置好的GUS染液，至完全沒過植物材料，在離心管上做好標(biāo)記后用錫箔紙包裹，常溫放置3 h；把上述材料轉(zhuǎn)入75%酒精中脫色2～3次，每次處理時長為1 h，直至葉片無綠色，顯微鏡下觀察拍照。

1.4 紫花苜蓿GUS基因表達的檢測

利用上述優(yōu)化的條件對紫花苜蓿進行了遺傳轉(zhuǎn)化，并在轉(zhuǎn)錄水平上檢測GUS表達。提取紫花苜?？俁NA，將2 μg RNA溶解于50 μL ddH2O中，4 ℃放置10 min。然后按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作方法進行RT-PCR檢測，試驗中使用GUS基因的探針引物。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥中發(fā)芽種子真空侵染體系的優(yōu)化

2.1.1 農(nóng)桿菌OD600濃度對真空侵染效率的影響

擬南芥發(fā)芽種子真空侵染過程中，外源基因的表達會受到農(nóng)桿菌菌液濃度和真空侵染壓力的影響。以GUS的表達效率(表達GUS的植株占總株數(shù)的比率)來優(yōu)化這些影響外源基因表達的重要條件。

利用植物發(fā)芽種子進行真空侵染，外源蛋白的表達效率主要受菌液濃度的影響。研究發(fā)現(xiàn)，GUS表達效率最高值出現(xiàn)在農(nóng)桿菌重懸液OD600=1.2時，表達效率最高(65%)；農(nóng)桿菌重懸液OD600=0.6時，GUS的表達效率較低(32%)；農(nóng)桿菌重懸液OD600=1.6時，GUS的表達效率較低(42%)，這表明菌液濃度過高或者濃度過低時，都會影響農(nóng)桿菌的侵染效率(圖1A)。

2.1.2 壓強對真空侵染效率的影響

影響GUS表達效率的另一重要因素是真空侵染壓力，GUS的表達效率隨著真空侵染壓力的增大而增大；當(dāng)真空侵染壓強為0.05～0.06 MPa時，GUS的表達效率較低(34%～42%)，當(dāng)真空侵染壓強為0.07 MPa時，GUS在發(fā)芽種子中表達效率最高，為65%(圖1B)。

注：A: 擬南芥植物中農(nóng)桿菌細胞濃度對GUS表達效率的影響；B: 擬南芥植物中真空侵染的壓力對GUS表達效率的影響

圖1 擬南芥植物中發(fā)芽種子真空侵染法的優(yōu)化

Fig.1 Optimization of germinated-seedvacuum infiltration in Arabidopsis plants

2.1.3 擬南芥中GUS基因表達的檢測

發(fā)芽種子真空侵染后第15天，對GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥植株進行GUS組織化學(xué)法染色，以野生型擬南芥(Col-0)作為對照(圖2A)，發(fā)現(xiàn)在GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥染色較深(圖2B)，而野生型擬南芥(Col-0)植株未被染色(圖2C、E)。GUS染色的檢測結(jié)果表明，GUS在擬南芥植物材料中獲得了有效表達，而且在葉片和根部位表達量較高(圖2D、F)。

注：A-野生型擬南芥(Col-0)作為對照；B-轉(zhuǎn)基因擬南芥小苗中GUS染色的觀察；C-野生型擬南芥(Col-0)葉片作為對照；D-轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片中GUS染色觀察；E-野生型擬南芥(Col-0)根作為對照；F-轉(zhuǎn)基因擬南芥根中GUS染色觀察。

圖2 轉(zhuǎn)基因擬南芥中GUS基因表達的檢測

Fig.2 The detection ofGUSgene expression in Arabidopsis plants

2.2 紫花苜蓿中GUS基因表達的檢測

利用發(fā)芽種子真空侵染法遺傳轉(zhuǎn)化紫花苜蓿，隨機選取紫花苜蓿提取總RNA，并在轉(zhuǎn)錄水平上對GUS基因的表達進行RT-PCR檢測。檢測結(jié)果表明：選取的紫花苜蓿中GUS基因均獲得成功表達(100%)(圖3)，表明這種遺傳轉(zhuǎn)化方法可以用于紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化。

注：M-DL2 000 Marker；1～5：植物中基因表達的檢測

圖3 紫花苜蓿植物中GUS表達的RT-PCR檢測

Fig.3 RT-PCR detection ofGUSexpression inM.sativaplants

3 討論與結(jié)論

植物的遺傳轉(zhuǎn)化已經(jīng)是一項比較成熟的生物技術(shù)，但由于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法試驗周期長，需要投入大量的時間和精力去建立和優(yōu)化每一種植物的遺傳轉(zhuǎn)化體系。因此，建立高效、快速的植物穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體系將成為一個研究熱點。真空侵染法常被用于植物表達外源蛋白的研究中，范亞軍等[13]利用真空侵染技術(shù)在豌豆發(fā)芽種子中表達了綠色熒光蛋白GFP，在農(nóng)桿菌細胞濃度OD600=1.5、壓強為0.08 MPa的侵染條件下，外源基因表達的效率最高。本研究在擬南芥中建立了一種高效快速的表達外源基因的方法，并對侵染條件進行了優(yōu)化，當(dāng)農(nóng)桿菌細胞濃度OD600=1.2，真空侵染壓強為0.07 MPa時，GUS基因在擬南芥植物中表達的效率較高。此外，真空侵染時間、植物種子發(fā)芽后的侵染時期也會影響外源基因的表達效率。

紫花苜蓿作為多年生豆科牧草，因其產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富等優(yōu)點，被稱為“牧草之王”。培育耐鹽抗逆苜蓿新品種對于改良吉林省西部鹽堿草地具有重要意義。苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化多采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法，周期較長，實驗過程較為復(fù)雜。徐博等[14]以紫花苜蓿為材料，建立并優(yōu)化了遺傳轉(zhuǎn)化體系。本研究組之前的研究表明，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法能夠有效完成植物的遺傳轉(zhuǎn)化過程，但實驗周期較長，一般需要6～12月的實驗過程[15-18]。因此，本研究目的是在紫花苜蓿中建立一種簡單、快速、高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，以減少遺傳轉(zhuǎn)化的研究周期。該研究以發(fā)芽種子作為真空侵染的材料，以在擬南芥和紫花苜蓿中成功地表達了外源基因，并對影響基因表達的條件進行了優(yōu)化。RT-PCR檢測結(jié)果表明，利用這種優(yōu)化的體系在紫花苜蓿中有效表達了外源基因GUS。這種遺傳轉(zhuǎn)化體系具有簡單、快速、高效的優(yōu)勢，為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法提供了新的研究方法。該方法在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)外源蛋白中具有極大的優(yōu)勢，使得遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)得到了更好的發(fā)展。