高宇，陳堯堯，劉憶杰，陳曉萌，高同國(guó)，張冬冬

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001）

棉花黃萎?。–otton Verticillium Wilt）是由大麗輪枝菌（Verticillium dahliaeKleb.）引起的維管束系統(tǒng)病害，對(duì)棉花生產(chǎn)造成巨大損失[1-2]。其主要防治方法有培育抗性品種、農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治等，但選育高抗棉花黃萎病的優(yōu)質(zhì)品種目前存在一定困難，農(nóng)業(yè)措施中常用的輪作難以應(yīng)用于大面積的棉花生產(chǎn)中，化學(xué)防治污染環(huán)境并且在殺死病原菌的同時(shí)殺死大量的有益微生物[3-5]。生物防治由于對(duì)人畜安全無(wú)毒、無(wú)污染、無(wú)殘留，具有不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性，生產(chǎn)工藝較簡(jiǎn)單，且有些生防微生物能促進(jìn)作物生長(zhǎng)，因而受到研究者的青睞[6-7]。

芽孢桿菌（Bacillusspp.）可在植株根、莖、葉等部位有效定植[8]，產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物，對(duì)植物真菌、細(xì)菌、線(xiàn)蟲(chóng)病害均表現(xiàn)顯著拮抗作用。產(chǎn)生抗逆耐熱的芽孢是芽孢桿菌的突出特征，這有利于生防菌的篩選、發(fā)酵生產(chǎn)、劑型加工及儲(chǔ)存運(yùn)輸[9]。

芽孢桿菌能夠產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，目前研究較多的有脂肽抗生素[10-11]、抗菌蛋白[12-13]、揮發(fā)性有機(jī)物[14]及聚酮類(lèi)化合物[15]等。脂肽抗生素是芽孢桿菌產(chǎn)生的1 類(lèi)非常重要的抑菌物質(zhì)，對(duì)熱不敏感，能夠耐受酸性環(huán)境及蛋白酶處理，性質(zhì)穩(wěn)定，為利用其防治植物真菌病害奠定了基礎(chǔ)[16]。按照結(jié)構(gòu)的不同，脂肽抗生素主要分為表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素 （iturin）和芬革素（fengycin）[11]。表面活性素具有一定程度的抗細(xì)菌活性，同時(shí)能有效降低植物根部表面張力，有利于生防菌的游動(dòng)性和生物膜的形成[17]。伊枯草菌素具有強(qiáng)烈的抗真菌活性，包含iturin A、B、C、D、E，桿菌霉素（bacillomycin）D、F、L、LC 和抗霉枯草菌素（mycosubtilin）[18]。芬革素具有廣譜抗真菌活性，特別是對(duì)絲狀真菌[19-20]。

張冬冬等從棉田中分離出1 株對(duì)大麗輪枝菌有顯著拮抗活性的Bacillus malacitensisZ-5 菌株[21]，采用抗利福平和抗病原真菌法對(duì)該菌株進(jìn)行標(biāo)記，檢測(cè)表明Z-5 菌株能夠在棉花根際土壤及植株體內(nèi)有效定植，這為拮抗菌在土壤中發(fā)揮有效的生防效果奠定了基礎(chǔ)[22]。本研究以Z-5 菌株為材料，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化其產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的培養(yǎng)基組成，并對(duì)抑菌物質(zhì)成分及其合成相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)，為利用該菌株進(jìn)行棉花黃萎病的防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）和Bacillus malacitensisZ-5 菌株由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)制藥工程實(shí)驗(yàn)室保存。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同 ）、蛋白胨2.0% 、Na2HPO4·12H2O 0.8% 、NaH2PO4·2H2O 0.2%、MgSO4·7H2O 0.05%、CaCl20.02%，pH 7.2～7.4。

1.2 培養(yǎng)基成分單因素優(yōu)化

選取9 種碳源為葡萄糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、玉米粉、果糖、麥芽糖、麩皮、糊精，6 種氮源為牛肉膏、硫酸銨、黃豆餅粉、胰蛋白胨、尿素、酵母粉 ，6種無(wú)機(jī)鹽為K2SO4、FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、NaCl、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O，在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，單因素變化碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)（添加量保持原配比），配制相對(duì)應(yīng)的發(fā)酵培養(yǎng)基。將保存的Z-5 菌株接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂（Nutrient agar，NA）斜面培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)過(guò)夜，挑取菌苔接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯（Nutrient broth，NB）培養(yǎng)基中37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，培養(yǎng)液以10%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接入配制的培養(yǎng)基中（250 mL的三角瓶裝液量為50 mL），37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵液于 10 000 r·min－1離心 10 min，回收上清液，用親水微孔過(guò)濾器（孔徑0.22 μm，天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)）過(guò)濾，濾液進(jìn)行抑菌物質(zhì)活性檢測(cè)。

1.3 抑菌物質(zhì)活性檢測(cè)

將保存的大麗輪枝菌接入馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDA）斜面培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，用無(wú)菌水將大麗輪枝菌孢子懸浮并調(diào)整其含量為1×106mL－1，將PDA 培養(yǎng)基融化并冷卻至約45 ℃，吸取10 mL 病原菌孢子懸浮液和100 mL PDA 培養(yǎng)基（硫酸鏈霉素質(zhì)量濃度為 40 mg·L－1） 混合后制作 PDA 培養(yǎng)基平板。凝固后，在距離PDA 培養(yǎng)基平板中心2.2 cm的位置均勻打4個(gè)直徑為0.7 cm 的孔，在每個(gè)孔中加入30 μL 按1.2 方法制備的發(fā)酵上清液，以相應(yīng)的培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。于25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d 后，測(cè)量抑菌圈直徑[20]。以抑菌圈直徑為指標(biāo)，選擇最優(yōu)碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽，從而達(dá)到培養(yǎng)基的優(yōu)化。

1.4 響應(yīng)面分析試驗(yàn)及培養(yǎng)基的優(yōu)化方法

根據(jù)1.2 的篩選結(jié)果，確定最佳碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽，運(yùn)用最速上升法（Steepest ascent design，SAD），確定各因素的最優(yōu)變化區(qū)域[23]，利用Box-Behnken 方法設(shè)計(jì)三因素（玉米粉、酵母粉、K2SO4）三水平（玉米粉含量：2%、3%、4%；酵母粉含量 ：1% 、2%、3%；K2SO4含量：0.02% 、0.03% 、0.04%）試驗(yàn)，以抑菌圈直徑為檢測(cè)指標(biāo)，運(yùn)用Design Expert 軟件擬合上述試驗(yàn)數(shù)據(jù)得到響應(yīng)面二階模型，繪制響應(yīng)面分析圖，分析確定最優(yōu)培養(yǎng)基配方，利用最優(yōu)培養(yǎng)基配方通過(guò)抑菌物質(zhì)活性檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證。

1.5 Z-5菌株合成抑菌物質(zhì)鑒定

將Z-5 菌株接種到NB 培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，將培養(yǎng)液以10%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種到優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)48 h，8 000 r·min－1離心 10 min 并回收上清液，將上清液用 6 mol·L－1的鹽酸溶液調(diào)整 pH 到 2，放置于4 ℃冰箱中過(guò)夜，8 000 r·min－1離心 10 min 并回收沉淀。將沉淀用pH 2 的去離子水沖洗2 遍，并用甲醇萃取2 遍，將2 次的萃取液合并后用疏水微孔過(guò)濾器（孔徑0.22 μm，天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)）過(guò)濾，用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（Liquid Chro matography-Mass Spectroscopy，LC-MS） 進(jìn)行分析[24-25]。采用安捷倫1200 系列高效液相色譜儀（Santa Clara，USA）和安捷倫 MS-C18 反相柱（長(zhǎng)50 mm，內(nèi)徑2.1 mm，介質(zhì)粒徑1.8 μm）對(duì)抑菌物質(zhì)進(jìn)行分離。流動(dòng)相為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液和乙腈以60∶40 比例混合，流速為0.8 mL·min－1，柱溫為 25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為 210 nm。高效液相分離的化合物相對(duì)分子質(zhì)量利用安捷倫6410三重四極桿質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定，電離方式采用電噴霧離子源，質(zhì)量檢測(cè)器為四級(jí)質(zhì)量分析器，噴霧電壓為4.5 kV，毛細(xì)管溫度為300 ℃，檢測(cè)方式為正離子模式[26]。

1.6 Z-5菌株合成抑菌物質(zhì)相關(guān)基因檢測(cè)

利用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取Z-5 菌株基因組DNA 為模板。擴(kuò)增ituC基因采用引物ITUCF1：TTCACTTTTGATCTGGCGAT和ITUCR3：CGTCCGGTACATTTTCAC；擴(kuò)增ituD基因采用引物ituD2F：GATGCGATCTCCTTGGATGT和ituD2R：ATCGTCATGTGCTGCTTGAG；擴(kuò)增srfAB基因采用引 物 110F：GTTCTCGCAGTCCAGCAGAAG 和110R：GCCGAGCGTATCCGTACCGAG[27-28]。根據(jù)設(shè)計(jì)引物的退火溫度和擴(kuò)增片段大小設(shè)計(jì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （Polymerase chain reaction，PCR）程序。反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5 μL、2.5 mmol·L－1dNTP 4 μL、10 μmol·L－1上下游引物各 2 μL、5 U·μL－1DNA 聚合酶 0.25 μL、DNA 1 μL，加 ddH2O 至 50 μL。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，用 1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR 產(chǎn)物由北京華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)序?；蛐蛄性诿绹?guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心 （National center for biotechnology information，USA，NCBI）網(wǎng)站利用BLAST進(jìn)行同源性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)Z-5菌株產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響

如圖1 所示，9 種碳源中，以甘露醇作為碳源時(shí)抑菌圈直徑最大，達(dá)到1.2 cm，玉米粉、麥芽糖次之，三者之間差異不顯著。考慮生產(chǎn)成本因素，將玉米粉選作最佳碳源。

2.2 氮源對(duì)Z-5菌株產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響

如圖2 所示，6 種氮源中，酵母粉的抑菌圈直徑為1.4 cm，大于其他氮源，抑菌效果最明顯。因此，選擇酵母粉作為最佳氮源。

圖1 9 種碳源對(duì)Bacillus malacitensis Z-5 菌株產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響Fig.1 Effects of nine carbon sources on the fermentation of Bacillus malacitensis Z-5 strain

圖2 6 種氮源對(duì)Bacillus malacitensis Z-5 菌株產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響Fig.2 Effect of six nitrogen sources on the fermentation of Bacillus malacitensis Z-5 strain

2.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)Z-5菌株產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響

以K2SO4作為無(wú)機(jī)鹽時(shí)，抑菌圈直徑為1.2 cm（圖3），抑菌效果較好。所以，選擇 K2SO4作為發(fā)酵培養(yǎng)基配方的無(wú)機(jī)鹽。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

Box-Behnken 試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。對(duì)優(yōu)化試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，獲得抑菌圈直徑與培養(yǎng)基中玉米粉、酵母粉、K2SO4含量的二次多項(xiàng)式回歸方程為r1＝－0.726 62 ＋0.512 25A＋0.597 63B＋59.487 5C－（5.000E－0.03）AB ＋2.000AC －7.425BC －0.106 63A2－0.117 38B2－823.750C2。其中，抑菌圈直徑預(yù)測(cè)值為r1，A、B、C 分別表示培養(yǎng)基中玉米粉、酵母粉、K2SO4的含量。該二次多項(xiàng)式模型及其各項(xiàng)系數(shù)的方差分析結(jié)果顯示，模型回歸P值為0.000 1、失擬項(xiàng)P值為 0.090 5，決定系數(shù)R2值為 0.971 8，說(shuō)明該回歸方程顯著可靠且擬合程度較好，預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間具有高度的相關(guān)性。因此，構(gòu)建的該二次多項(xiàng)式模型可以用于Z-5 菌株抑菌圈直徑的理論預(yù)測(cè)。

圖3 6 種無(wú)機(jī)鹽對(duì)Bacillus malacitensis Z-5 菌株產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響Fig.3 Effects of six kinds of inorganic salts on the fermentation of Bacillus malacitensis Z-5 strain

表1 Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Box-Behnken values by the response surface design

另外，根據(jù)繪制的響應(yīng)面分析圖（圖4），分析3個(gè)變量因素中兩兩變量中的交互影響作用，進(jìn)一步確定該試驗(yàn)設(shè)計(jì)的優(yōu)化結(jié)果。當(dāng)K2SO4的含量固定，玉米粉處于相對(duì)較低水平時(shí)，抑菌圈直徑較大，Z-5 菌株的抑菌效果較好（圖4A）；當(dāng)酵母粉處于較低水平時(shí)，抑菌圈直徑較大（圖4B）；K2SO4對(duì)抑菌效果影響不大（圖4C）。綜合以上結(jié)果，玉米粉、酵母粉含量均較低時(shí)抑菌圈直徑較大，K2SO4的含量對(duì)抑菌效果影響不大。

通過(guò)Design Expert 軟件最終得到優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為玉米粉2.68%、酵母粉1.45%、K2SO40.03%、Na2HPO4·12H2O 0.8%、NaH2PO4·2H2O 0.2%（pH 7.2～7.4）。根據(jù)二次多項(xiàng)式回歸方程預(yù)測(cè)抑菌圈直徑為1.36 cm，優(yōu)化后的培養(yǎng)基發(fā)酵上清液抑菌活性檢測(cè)得到的抑菌圈直徑為1.34 cm，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明該模型有效、可靠。

圖4 營(yíng)養(yǎng)成分含量對(duì)抑菌圈直徑交互影響的三維曲面Fig.4 Three-dimension curved surface diagram of interaction effect of nutrition content on the diameter of antifungal zone

2.5 Z-5菌株抑菌物質(zhì)鑒定

采用LC-MS 鑒定了B.malacitensisZ-5 發(fā)酵上清液中抑菌物質(zhì)成分 （圖5）。保留時(shí)間為0.264 min 的組分中，未檢測(cè)到抑菌物質(zhì)存在（圖6A）； 質(zhì)荷比為1 046.57 的物質(zhì)峰對(duì)應(yīng)的離子類(lèi)型為[M＋K]＋，與C14 surfactin B 離子加成峰一致；1 107.66 對(duì)應(yīng)[M＋Na]＋，為 C17 iturin A（圖6B）。1 043.78 峰對(duì)應(yīng)[M＋H]＋，為 C14 iturin A（圖6C）。1 057.84 峰對(duì)應(yīng)[M＋H]＋，為 C15 iturin A（圖6D）。1 058.37 峰對(duì)應(yīng)[M＋H]＋，為 C15 iturin B；1 066.65 峰對(duì)應(yīng)[M＋Na]＋，為 C14 iturin B；1 123.29 峰對(duì)應(yīng)[M＋K]＋，為 C17 iturin A（圖6E）。1 071.93 峰對(duì)應(yīng)[M＋H]＋，為 C16 iturin A（圖6F）。1 085.86 峰對(duì)應(yīng)[M＋H]＋，為 C17 iturin A；1 108.68 峰對(duì)應(yīng)[M＋Na]＋，為 C17 iturin B（圖6G）。1 095.19 峰對(duì)應(yīng)[M＋K]＋，為 C15 iturin A；1 123.59 峰對(duì)應(yīng) [M＋K]＋，為 C17 iturin A （圖6H）。綜上所述，Z-5 菌株合成 C14 surfactin B，C14～C17 iturin A，C14、C15、C17 iturin B 等脂肽抗生素（圖6）。

圖5 Bacillus malacitensis Z-5 菌株發(fā)酵液粗提取物液質(zhì)聯(lián)用陽(yáng)離子流譜圖Fig.5 The positive ion flow spectra of LC-MS for the crude extract from Bacillus malacitensis Z-5 fermentation supernatant

圖6 Bacillus malacitensis Z-5 合成抑菌物質(zhì)質(zhì)譜圖Fig.6 Mass spectrum of antifungal substances from Bacillus malacitensis Z-5

2.6 Z-5菌株抑菌物質(zhì)合成相關(guān)基因檢測(cè)

Z-5 菌株基因組脂肽抗生素合成相關(guān)基因srfAB、ituC和ituD的檢測(cè)結(jié)果如圖 7 所示。在NCBI 上的 BLAST 同源性分析表明，srfAB與解淀粉芽孢桿菌UCMB5036 菌株編碼表面活性素合成酶亞基2 的srfAB同源性為99%，ituC與解淀粉芽孢桿菌UCMB5036 菌株編碼伊枯草菌素合成酶 C 的ituC同源性為99%，ituD與解淀粉芽孢桿菌YNM3 菌株編碼丙二酸單酰輔酶A ?；D(zhuǎn)移酶的ituD同源性為99%。其中基因ituC和ituD與伊枯草菌素合成相關(guān)，基因srfAB與表面活性素合成相關(guān)。

圖7 Bacillus malacitensis Z-5 菌株合成抑菌物質(zhì)相關(guān)基因的PCR 擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Testing results of PCR detection of antifungal substances related genes of Bacillus malacitensis Z-5 strain

3 討論

生防芽孢桿菌在國(guó)外應(yīng)用廣泛，由Gustafson公司研發(fā)的枯草芽孢桿菌GB03 對(duì)棉花、大豆等土傳真菌病害防治效果顯著，至今在美國(guó)市場(chǎng)銷(xiāo)售良好[29]。芽孢桿菌在國(guó)內(nèi)的應(yīng)用前景也被看好，喬俊卿等利用枯草芽孢桿菌Bs916 防治番茄青枯病[30]，林東等發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌SO113 對(duì)水稻白葉枯病菌具有強(qiáng)烈的抑制作用[31]。

在實(shí)際研究中，響應(yīng)面分析法可節(jié)省研發(fā)時(shí)間，提高產(chǎn)品質(zhì)量，是應(yīng)用較多的方法。培養(yǎng)基成分對(duì)抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生影響較大，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定最優(yōu)的碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽分別為玉米粉、酵母粉和K2SO4。本研究同時(shí)考慮碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽3個(gè)因素，利用最速上升法確定最優(yōu)變量區(qū)域，其中玉米粉為2%～4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同），酵母粉為1%～3%，K2SO4為0.02%～0.04%。結(jié)合Box-Behnken 設(shè)計(jì)試驗(yàn)分析出最佳水平配比，在整個(gè)區(qū)域范圍內(nèi)分析得出精確度較高的響應(yīng)值為抑菌圈直徑的回歸方程[32]，其中玉米粉和酵母粉處于設(shè)定區(qū)間的較低水平時(shí)，能夠獲得最優(yōu)的抑菌活性，減少了試驗(yàn)次數(shù)和試驗(yàn)周期。同時(shí)，B.malacitensisZ-5 在得到的最優(yōu)培養(yǎng)基中發(fā)酵，其合成的抑菌物質(zhì)對(duì)大麗輪枝菌拮抗效果顯著。

產(chǎn)生抑菌物質(zhì)是生防菌發(fā)揮效用的基礎(chǔ)，但抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生受多種因素影響，這往往導(dǎo)致生防菌在實(shí)驗(yàn)室條件下的拮抗效果和田間防治效果之間存在較大差異。直接利用芽孢桿菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)進(jìn)行植物病原菌的防治，所受限制因素較少，并且安全環(huán)保，是1 種環(huán)境友好型微生物農(nóng)藥資源[33]。

通過(guò)LC-MS 技術(shù)和PCR 檢測(cè)，初步確定Z-5 菌株合成并分泌伊枯草菌素A、伊枯草菌素B 和表面活性素B 等脂肽抗生素。伊枯草菌素具有強(qiáng)烈的廣譜抗真菌活性，對(duì)細(xì)菌的拮抗作用較小，無(wú)抗病毒活性。表面活性素雖然沒(méi)有顯著的抗真菌活性，但與其他脂肽抗生素如iturin A 等共同作用時(shí)能夠顯著增強(qiáng)其抑菌活性[34]，枯草芽孢桿菌YB-05 對(duì)小麥全蝕病的防治效果優(yōu)于化學(xué)試劑，其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)主要為iturin A 和surfactin[35]。番茄內(nèi)生枯草芽孢桿菌B47 能顯著抑制玉蜀黍平臍蠕孢（Bipolaris maydis）的生長(zhǎng)，其抗菌活性物質(zhì)為iturin A2，體外試驗(yàn)、盆栽試驗(yàn)和田間試驗(yàn)表明，部分提純的iturin A2 能顯著抑制玉米葉枯病的發(fā)生[36]。由此預(yù)見(jiàn)，利用Z-5 菌株合成的抑菌物質(zhì)進(jìn)行棉花黃萎病等植物病害的防治有廣闊的應(yīng)用前景。

本研究?jī)H從培養(yǎng)基成分角度出發(fā)對(duì)Z-5 菌株產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的條件進(jìn)行了優(yōu)化，然而芽孢桿菌的最優(yōu)生長(zhǎng)條件和抑菌物質(zhì)生成能力的影響因素還包括pH、培養(yǎng)溫度、裝液量以及接菌量等，這些因素對(duì)抑菌物質(zhì)產(chǎn)生的影響還有待進(jìn)一步檢測(cè)。

4 結(jié)論

優(yōu)化得出了Bacillus malacitensisZ-5 菌株合成抑菌物質(zhì)的培養(yǎng)基組成，抑菌物質(zhì)為脂肽抗生素表面活性素B、伊枯草菌素A 和伊枯草菌素B。Z-5 菌株基因組中含有脂肽合成基因srfAB、ituC和ituD。本研究為利用脂肽抗生素抑制大麗輪枝菌提供了基礎(chǔ)。