高宇，陳堯堯，劉憶杰，陳曉萌，高同國，張冬冬

（河北農業(yè)大學生命科學學院，河北 保定 071001）

棉花黃萎?。–otton Verticillium Wilt）是由大麗輪枝菌（Verticillium dahliaeKleb.）引起的維管束系統(tǒng)病害，對棉花生產造成巨大損失[1-2]。其主要防治方法有培育抗性品種、農業(yè)防治和化學防治等，但選育高抗棉花黃萎病的優(yōu)質品種目前存在一定困難，農業(yè)措施中常用的輪作難以應用于大面積的棉花生產中，化學防治污染環(huán)境并且在殺死病原菌的同時殺死大量的有益微生物[3-5]。生物防治由于對人畜安全無毒、無污染、無殘留，具有不易使病原菌產生耐藥性，生產工藝較簡單，且有些生防微生物能促進作物生長，因而受到研究者的青睞[6-7]。

芽孢桿菌（Bacillusspp.）可在植株根、莖、葉等部位有效定植[8]，產生多種次生代謝產物，對植物真菌、細菌、線蟲病害均表現(xiàn)顯著拮抗作用。產生抗逆耐熱的芽孢是芽孢桿菌的突出特征，這有利于生防菌的篩選、發(fā)酵生產、劑型加工及儲存運輸[9]。

芽孢桿菌能夠產生多種抑菌物質，目前研究較多的有脂肽抗生素[10-11]、抗菌蛋白[12-13]、揮發(fā)性有機物[14]及聚酮類化合物[15]等。脂肽抗生素是芽孢桿菌產生的1 類非常重要的抑菌物質，對熱不敏感，能夠耐受酸性環(huán)境及蛋白酶處理，性質穩(wěn)定，為利用其防治植物真菌病害奠定了基礎[16]。按照結構的不同，脂肽抗生素主要分為表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素 （iturin）和芬革素（fengycin）[11]。表面活性素具有一定程度的抗細菌活性，同時能有效降低植物根部表面張力，有利于生防菌的游動性和生物膜的形成[17]。伊枯草菌素具有強烈的抗真菌活性，包含iturin A、B、C、D、E，桿菌霉素（bacillomycin）D、F、L、LC 和抗霉枯草菌素（mycosubtilin）[18]。芬革素具有廣譜抗真菌活性，特別是對絲狀真菌[19-20]。

張冬冬等從棉田中分離出1 株對大麗輪枝菌有顯著拮抗活性的Bacillus malacitensisZ-5 菌株[21]，采用抗利福平和抗病原真菌法對該菌株進行標記，檢測表明Z-5 菌株能夠在棉花根際土壤及植株體內有效定植，這為拮抗菌在土壤中發(fā)揮有效的生防效果奠定了基礎[22]。本研究以Z-5 菌株為材料，通過響應面法優(yōu)化其產生抑菌物質的培養(yǎng)基組成，并對抑菌物質成分及其合成相關基因進行檢測，為利用該菌株進行棉花黃萎病的防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）和Bacillus malacitensisZ-5 菌株由河北農業(yè)大學制藥工程實驗室保存。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%（質量分數(shù)，下同 ）、蛋白胨2.0% 、Na2HPO4·12H2O 0.8% 、NaH2PO4·2H2O 0.2%、MgSO4·7H2O 0.05%、CaCl20.02%，pH 7.2～7.4。

1.2 培養(yǎng)基成分單因素優(yōu)化

選取9 種碳源為葡萄糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、玉米粉、果糖、麥芽糖、麩皮、糊精，6 種氮源為牛肉膏、硫酸銨、黃豆餅粉、胰蛋白胨、尿素、酵母粉 ，6種無機鹽為K2SO4、FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、NaCl、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O，在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中，單因素變化碳源、氮源、無機鹽種類（添加量保持原配比），配制相對應的發(fā)酵培養(yǎng)基。將保存的Z-5 菌株接種于營養(yǎng)瓊脂（Nutrient agar，NA）斜面培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)過夜，挑取菌苔接種到營養(yǎng)肉湯（Nutrient broth，NB）培養(yǎng)基中37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)液以10%（體積分數(shù)）的接種量接入配制的培養(yǎng)基中（250 mL的三角瓶裝液量為50 mL），37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵液于 10 000 r·min－1離心 10 min，回收上清液，用親水微孔過濾器（孔徑0.22 μm，天津津騰實驗設備有限公司生產）過濾，濾液進行抑菌物質活性檢測。

1.3 抑菌物質活性檢測

將保存的大麗輪枝菌接入馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDA）斜面培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，用無菌水將大麗輪枝菌孢子懸浮并調整其含量為1×106mL－1，將PDA 培養(yǎng)基融化并冷卻至約45 ℃，吸取10 mL 病原菌孢子懸浮液和100 mL PDA 培養(yǎng)基（硫酸鏈霉素質量濃度為 40 mg·L－1） 混合后制作 PDA 培養(yǎng)基平板。凝固后，在距離PDA 培養(yǎng)基平板中心2.2 cm的位置均勻打4個直徑為0.7 cm 的孔，在每個孔中加入30 μL 按1.2 方法制備的發(fā)酵上清液，以相應的培養(yǎng)基作為陰性對照。每個樣品3個重復。于25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d 后，測量抑菌圈直徑[20]。以抑菌圈直徑為指標，選擇最優(yōu)碳源、氮源、無機鹽，從而達到培養(yǎng)基的優(yōu)化。

1.4 響應面分析試驗及培養(yǎng)基的優(yōu)化方法

根據(jù)1.2 的篩選結果，確定最佳碳源、氮源、無機鹽，運用最速上升法（Steepest ascent design，SAD），確定各因素的最優(yōu)變化區(qū)域[23]，利用Box-Behnken 方法設計三因素（玉米粉、酵母粉、K2SO4）三水平（玉米粉含量：2%、3%、4%；酵母粉含量 ：1% 、2%、3%；K2SO4含量：0.02% 、0.03% 、0.04%）試驗，以抑菌圈直徑為檢測指標，運用Design Expert 軟件擬合上述試驗數(shù)據(jù)得到響應面二階模型，繪制響應面分析圖，分析確定最優(yōu)培養(yǎng)基配方，利用最優(yōu)培養(yǎng)基配方通過抑菌物質活性檢測進行驗證。

1.5 Z-5菌株合成抑菌物質鑒定

將Z-5 菌株接種到NB 培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，將培養(yǎng)液以10%（體積分數(shù)）接種量接種到優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)48 h，8 000 r·min－1離心 10 min 并回收上清液，將上清液用 6 mol·L－1的鹽酸溶液調整 pH 到 2，放置于4 ℃冰箱中過夜，8 000 r·min－1離心 10 min 并回收沉淀。將沉淀用pH 2 的去離子水沖洗2 遍，并用甲醇萃取2 遍，將2 次的萃取液合并后用疏水微孔過濾器（孔徑0.22 μm，天津津騰實驗設備有限公司生產）過濾，用液質聯(lián)用技術（Liquid Chro matography-Mass Spectroscopy，LC-MS） 進行分析[24-25]。采用安捷倫1200 系列高效液相色譜儀（Santa Clara，USA）和安捷倫 MS-C18 反相柱（長50 mm，內徑2.1 mm，介質粒徑1.8 μm）對抑菌物質進行分離。流動相為0.1%（體積分數(shù)）甲酸水溶液和乙腈以60∶40 比例混合，流速為0.8 mL·min－1，柱溫為 25 ℃，檢測波長為 210 nm。高效液相分離的化合物相對分子質量利用安捷倫6410三重四極桿質譜儀進行測定，電離方式采用電噴霧離子源，質量檢測器為四級質量分析器，噴霧電壓為4.5 kV，毛細管溫度為300 ℃，檢測方式為正離子模式[26]。

1.6 Z-5菌株合成抑菌物質相關基因檢測

利用細菌基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取Z-5 菌株基因組DNA 為模板。擴增ituC基因采用引物ITUCF1：TTCACTTTTGATCTGGCGAT和ITUCR3：CGTCCGGTACATTTTCAC；擴增ituD基因采用引物ituD2F：GATGCGATCTCCTTGGATGT和ituD2R：ATCGTCATGTGCTGCTTGAG；擴增srfAB基因采用引 物 110F：GTTCTCGCAGTCCAGCAGAAG 和110R：GCCGAGCGTATCCGTACCGAG[27-28]。根據(jù)設計引物的退火溫度和擴增片段大小設計聚合酶鏈式反應 （Polymerase chain reaction，PCR）程序。反應體系：10×PCR Buffer 5 μL、2.5 mmol·L－1dNTP 4 μL、10 μmol·L－1上下游引物各 2 μL、5 U·μL－1DNA 聚合酶 0.25 μL、DNA 1 μL，加 ddH2O 至 50 μL。PCR 反應結束后，用 1%（質量分數(shù)）瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR 產物由北京華大基因有限公司進行測序?；蛐蛄性诿绹鴩⑸锛夹g信息中心 （National center for biotechnology information，USA，NCBI）網(wǎng)站利用BLAST進行同源性比較。

2 結果與分析

2.1 碳源對Z-5菌株產生抑菌物質的影響

如圖1 所示，9 種碳源中，以甘露醇作為碳源時抑菌圈直徑最大，達到1.2 cm，玉米粉、麥芽糖次之，三者之間差異不顯著?？紤]生產成本因素，將玉米粉選作最佳碳源。

2.2 氮源對Z-5菌株產生抑菌物質的影響

如圖2 所示，6 種氮源中，酵母粉的抑菌圈直徑為1.4 cm，大于其他氮源，抑菌效果最明顯。因此，選擇酵母粉作為最佳氮源。

圖1 9 種碳源對Bacillus malacitensis Z-5 菌株產生抑菌物質的影響Fig.1 Effects of nine carbon sources on the fermentation of Bacillus malacitensis Z-5 strain

圖2 6 種氮源對Bacillus malacitensis Z-5 菌株產生抑菌物質的影響Fig.2 Effect of six nitrogen sources on the fermentation of Bacillus malacitensis Z-5 strain

2.3 無機鹽對Z-5菌株產生抑菌物質的影響

以K2SO4作為無機鹽時，抑菌圈直徑為1.2 cm（圖3），抑菌效果較好。所以，選擇 K2SO4作為發(fā)酵培養(yǎng)基配方的無機鹽。

2.4 響應面試驗結果分析

Box-Behnken 試驗得到的數(shù)據(jù)見表1。對優(yōu)化試驗數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合，獲得抑菌圈直徑與培養(yǎng)基中玉米粉、酵母粉、K2SO4含量的二次多項式回歸方程為r1＝－0.726 62 ＋0.512 25A＋0.597 63B＋59.487 5C－（5.000E－0.03）AB ＋2.000AC －7.425BC －0.106 63A2－0.117 38B2－823.750C2。其中，抑菌圈直徑預測值為r1，A、B、C 分別表示培養(yǎng)基中玉米粉、酵母粉、K2SO4的含量。該二次多項式模型及其各項系數(shù)的方差分析結果顯示，模型回歸P值為0.000 1、失擬項P值為 0.090 5，決定系數(shù)R2值為 0.971 8，說明該回歸方程顯著可靠且擬合程度較好，預測值和實測值之間具有高度的相關性。因此，構建的該二次多項式模型可以用于Z-5 菌株抑菌圈直徑的理論預測。

圖3 6 種無機鹽對Bacillus malacitensis Z-5 菌株產生抑菌物質的影響Fig.3 Effects of six kinds of inorganic salts on the fermentation of Bacillus malacitensis Z-5 strain

表1 Box-Behnken 響應面優(yōu)化試驗結果Table 1 Box-Behnken values by the response surface design

另外，根據(jù)繪制的響應面分析圖（圖4），分析3個變量因素中兩兩變量中的交互影響作用，進一步確定該試驗設計的優(yōu)化結果。當K2SO4的含量固定，玉米粉處于相對較低水平時，抑菌圈直徑較大，Z-5 菌株的抑菌效果較好（圖4A）；當酵母粉處于較低水平時，抑菌圈直徑較大（圖4B）；K2SO4對抑菌效果影響不大（圖4C）。綜合以上結果，玉米粉、酵母粉含量均較低時抑菌圈直徑較大，K2SO4的含量對抑菌效果影響不大。

通過Design Expert 軟件最終得到優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為玉米粉2.68%、酵母粉1.45%、K2SO40.03%、Na2HPO4·12H2O 0.8%、NaH2PO4·2H2O 0.2%（pH 7.2～7.4）。根據(jù)二次多項式回歸方程預測抑菌圈直徑為1.36 cm，優(yōu)化后的培養(yǎng)基發(fā)酵上清液抑菌活性檢測得到的抑菌圈直徑為1.34 cm，與預測值接近，說明該模型有效、可靠。

圖4 營養(yǎng)成分含量對抑菌圈直徑交互影響的三維曲面Fig.4 Three-dimension curved surface diagram of interaction effect of nutrition content on the diameter of antifungal zone

2.5 Z-5菌株抑菌物質鑒定

采用LC-MS 鑒定了B.malacitensisZ-5 發(fā)酵上清液中抑菌物質成分 （圖5）。保留時間為0.264 min 的組分中，未檢測到抑菌物質存在（圖6A）； 質荷比為1 046.57 的物質峰對應的離子類型為[M＋K]＋，與C14 surfactin B 離子加成峰一致；1 107.66 對應[M＋Na]＋，為 C17 iturin A（圖6B）。1 043.78 峰對應[M＋H]＋，為 C14 iturin A（圖6C）。1 057.84 峰對應[M＋H]＋，為 C15 iturin A（圖6D）。1 058.37 峰對應[M＋H]＋，為 C15 iturin B；1 066.65 峰對應[M＋Na]＋，為 C14 iturin B；1 123.29 峰對應[M＋K]＋，為 C17 iturin A（圖6E）。1 071.93 峰對應[M＋H]＋，為 C16 iturin A（圖6F）。1 085.86 峰對應[M＋H]＋，為 C17 iturin A；1 108.68 峰對應[M＋Na]＋，為 C17 iturin B（圖6G）。1 095.19 峰對應[M＋K]＋，為 C15 iturin A；1 123.59 峰對應 [M＋K]＋，為 C17 iturin A （圖6H）。綜上所述，Z-5 菌株合成 C14 surfactin B，C14～C17 iturin A，C14、C15、C17 iturin B 等脂肽抗生素（圖6）。

圖5 Bacillus malacitensis Z-5 菌株發(fā)酵液粗提取物液質聯(lián)用陽離子流譜圖Fig.5 The positive ion flow spectra of LC-MS for the crude extract from Bacillus malacitensis Z-5 fermentation supernatant

圖6 Bacillus malacitensis Z-5 合成抑菌物質質譜圖Fig.6 Mass spectrum of antifungal substances from Bacillus malacitensis Z-5

2.6 Z-5菌株抑菌物質合成相關基因檢測

Z-5 菌株基因組脂肽抗生素合成相關基因srfAB、ituC和ituD的檢測結果如圖 7 所示。在NCBI 上的 BLAST 同源性分析表明，srfAB與解淀粉芽孢桿菌UCMB5036 菌株編碼表面活性素合成酶亞基2 的srfAB同源性為99%，ituC與解淀粉芽孢桿菌UCMB5036 菌株編碼伊枯草菌素合成酶 C 的ituC同源性為99%，ituD與解淀粉芽孢桿菌YNM3 菌株編碼丙二酸單酰輔酶A ?；D移酶的ituD同源性為99%。其中基因ituC和ituD與伊枯草菌素合成相關，基因srfAB與表面活性素合成相關。

圖7 Bacillus malacitensis Z-5 菌株合成抑菌物質相關基因的PCR 擴增檢測結果Fig.7 Testing results of PCR detection of antifungal substances related genes of Bacillus malacitensis Z-5 strain

3 討論

生防芽孢桿菌在國外應用廣泛，由Gustafson公司研發(fā)的枯草芽孢桿菌GB03 對棉花、大豆等土傳真菌病害防治效果顯著，至今在美國市場銷售良好[29]。芽孢桿菌在國內的應用前景也被看好，喬俊卿等利用枯草芽孢桿菌Bs916 防治番茄青枯病[30]，林東等發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌SO113 對水稻白葉枯病菌具有強烈的抑制作用[31]。

在實際研究中，響應面分析法可節(jié)省研發(fā)時間，提高產品質量，是應用較多的方法。培養(yǎng)基成分對抑菌物質的產生影響較大，通過單因素試驗確定最優(yōu)的碳源、氮源和無機鹽分別為玉米粉、酵母粉和K2SO4。本研究同時考慮碳源、氮源、無機鹽3個因素，利用最速上升法確定最優(yōu)變量區(qū)域，其中玉米粉為2%～4%（質量分數(shù)，下同），酵母粉為1%～3%，K2SO4為0.02%～0.04%。結合Box-Behnken 設計試驗分析出最佳水平配比，在整個區(qū)域范圍內分析得出精確度較高的響應值為抑菌圈直徑的回歸方程[32]，其中玉米粉和酵母粉處于設定區(qū)間的較低水平時，能夠獲得最優(yōu)的抑菌活性，減少了試驗次數(shù)和試驗周期。同時，B.malacitensisZ-5 在得到的最優(yōu)培養(yǎng)基中發(fā)酵，其合成的抑菌物質對大麗輪枝菌拮抗效果顯著。

產生抑菌物質是生防菌發(fā)揮效用的基礎，但抑菌物質的產生受多種因素影響，這往往導致生防菌在實驗室條件下的拮抗效果和田間防治效果之間存在較大差異。直接利用芽孢桿菌產生的抑菌物質進行植物病原菌的防治，所受限制因素較少，并且安全環(huán)保，是1 種環(huán)境友好型微生物農藥資源[33]。

通過LC-MS 技術和PCR 檢測，初步確定Z-5 菌株合成并分泌伊枯草菌素A、伊枯草菌素B 和表面活性素B 等脂肽抗生素。伊枯草菌素具有強烈的廣譜抗真菌活性，對細菌的拮抗作用較小，無抗病毒活性。表面活性素雖然沒有顯著的抗真菌活性，但與其他脂肽抗生素如iturin A 等共同作用時能夠顯著增強其抑菌活性[34]，枯草芽孢桿菌YB-05 對小麥全蝕病的防治效果優(yōu)于化學試劑，其產生的抑菌物質主要為iturin A 和surfactin[35]。番茄內生枯草芽孢桿菌B47 能顯著抑制玉蜀黍平臍蠕孢（Bipolaris maydis）的生長，其抗菌活性物質為iturin A2，體外試驗、盆栽試驗和田間試驗表明，部分提純的iturin A2 能顯著抑制玉米葉枯病的發(fā)生[36]。由此預見，利用Z-5 菌株合成的抑菌物質進行棉花黃萎病等植物病害的防治有廣闊的應用前景。

本研究僅從培養(yǎng)基成分角度出發(fā)對Z-5 菌株產生抑菌物質的條件進行了優(yōu)化，然而芽孢桿菌的最優(yōu)生長條件和抑菌物質生成能力的影響因素還包括pH、培養(yǎng)溫度、裝液量以及接菌量等，這些因素對抑菌物質產生的影響還有待進一步檢測。

4 結論

優(yōu)化得出了Bacillus malacitensisZ-5 菌株合成抑菌物質的培養(yǎng)基組成，抑菌物質為脂肽抗生素表面活性素B、伊枯草菌素A 和伊枯草菌素B。Z-5 菌株基因組中含有脂肽合成基因srfAB、ituC和ituD。本研究為利用脂肽抗生素抑制大麗輪枝菌提供了基礎。