趙夢(mèng)培 李?lèi)?ài)紅 崔 穎 車(chē)念聰 張秋云 杜宇瓊 付修文 高連印*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)學(xué)系 中醫(yī)絡(luò)病研究北京重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)中心，北京 100069)

慢性重型肝炎(chronic severe hepatitis，CSH)是在慢性肝炎、肝硬化的基礎(chǔ)上由于多種因素導(dǎo)致肝細(xì)胞廣泛變形、壞死而出現(xiàn)肝衰竭的嚴(yán)重疾病，包括慢加急性、亞急性及慢性肝衰竭[1]。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，合并癥多，預(yù)后極差，病死率為50%～55%[2]。腸源性?xún)?nèi)毒素是CSH發(fā)生和病情加重的重要因素，CSH患者多伴腸道黏膜屏障功能受損使腸道黏膜通透性增加，進(jìn)而誘發(fā)腸源性?xún)?nèi)毒素血癥[3]。自噬是細(xì)胞通過(guò)膜囊泡結(jié)構(gòu)降解胞質(zhì)內(nèi)大分子物質(zhì)和受損細(xì)胞器維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的生物學(xué)過(guò)程。自噬是真核細(xì)胞通過(guò)溶酶體降解胞內(nèi)受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)維持自身內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定的病理生理過(guò)程。研究[4]顯示，自噬參與保護(hù)腸黏膜機(jī)械屏障，修復(fù)受損的腸上皮細(xì)胞，降低腸道通透性。清毒湯是首都國(guó)醫(yī)名師王融冰等[5]治療肝病腸源性?xún)?nèi)毒素癥的經(jīng)驗(yàn)方，前期研究[6-7]顯示清毒湯臨床治療CSH安全有效，對(duì)模型大鼠有保肝，降低腸道通透性的作用。本研究擬建立硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA)致實(shí)驗(yàn)性大鼠重癥肝損傷模型，通過(guò)觀察清毒湯對(duì)模型大鼠內(nèi)毒素、白細(xì)胞介素-17(interleukin-17，IL-17)、白細(xì)胞介素-23(interleukin-23，IL-23)腸上皮細(xì)胞自噬及相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1的影響，進(jìn)一步研究清毒湯通過(guò)誘導(dǎo)腸道上皮細(xì)胞自噬保護(hù)腸道黏膜屏障減輕重癥肝損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠24只，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào): SCXK(京)2016-0006，飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，室溫(22.0±2.0) ℃，相對(duì)濕度40%～70%，光照明暗交替12 h/12 h。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用及實(shí)驗(yàn)方案均已經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

清毒湯由大黃10 g、枳實(shí)10 g、厚樸10 g、茜草9 g、生地黃12 g組成，飲片均購(gòu)自北京同仁堂，由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室煎制，根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)[6-7]得出有效劑量，濃縮成生藥含量1.6 g/mL 的水煎劑，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ａ虼阴０?貨號(hào)：V900086，德國(guó)Sigma-Aldrich公司)；乳果糖(貨號(hào)：346940，荷蘭蘇威制藥有限公司)；內(nèi)毒素(南京建成生物工程研究所)；IL-17、IL-23試劑盒(美國(guó)eBioscience，公司)；LC3抗體(貨號(hào)：12741，美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；Beclin-1抗體(貨號(hào)：3495s，美國(guó)Cell Signaling Technology公司)。高速冷凍離心機(jī)(XIANGYI)，Image Pro 6.0(美國(guó)Media Cybernetics公司)，日立7600生化儀，Multiskan MK3酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，JEM-2100透射電子顯微鏡(日本電子/JEOL)。

1.3 造模及給藥

本實(shí)驗(yàn)采用TAA誘導(dǎo)大鼠重度肝損傷模型[8]，24只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，采用數(shù)字表法隨機(jī)選取6只分為正常組，給予0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液灌胃；其余18只為造模組，每日予以12 mg/kg的TAA進(jìn)行灌胃，持續(xù)12周。第8周末將造模組采用數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組、乳果糖組、中藥組，每組6只。乳果糖組給予1.6 g/kg的乳果糖；中藥組給予為5.95 g/kg的清毒湯濃縮液；模型組給予等量的0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液，持續(xù)4周。造模及治療期間，各組大鼠自由攝食飲水，在造模第12周末夜間禁食。

1.4 標(biāo)本制備

所有大鼠在第12周末禁食10～12 h后，按0.035 mL/kg體質(zhì)量腹腔注射的水合氯醛進(jìn)行麻醉。打開(kāi)腹腔，腹主動(dòng)脈取血，緩慢注射于無(wú)菌真空采血管內(nèi)，3 000 r/min，4 ℃，離心15 min后取其上清液分裝，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?dòng)物處死后立即取少許結(jié)腸組織于戊二醛中固定。取相同部位的部分肝臟及結(jié)腸組織置于4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛中，置-4 ℃冰箱保存，其余結(jié)腸組織分裝于凍存管內(nèi)，液氮中快速凍存，隨后移至-80 ℃冰箱存放。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

石蠟包埋腸組織，制備切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin， HE)染色，光鏡下觀察組織病理變化。將固定液中的結(jié)腸組織進(jìn)行漂洗、鋨酸固定、脫水、包埋、切片，透射電鏡下觀察腸上皮細(xì)胞自噬體變化。內(nèi)毒素及IL-17、IL-23采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明執(zhí)行。Western blotting法檢測(cè)腸組織中自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量：取適量腸組織經(jīng)裂解處理，離心后取上清液，經(jīng)封閉、一抗孵育、二抗孵育后，膠片定影，用Image Pro Plus進(jìn)行灰度統(tǒng)計(jì)，目的蛋白表達(dá)量以目的蛋白/β-actin的灰度比值表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝、腸組織病理改變

為了觀察清毒湯對(duì)重度肝損傷模型大鼠的組織病理學(xué)影響，對(duì)肝和結(jié)腸組織進(jìn)行了HE染色。光鏡下可見(jiàn)正常組大鼠組織結(jié)構(gòu)清晰，排列規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核分明，沒(méi)有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝臟細(xì)胞以中央靜脈為中心， 呈放射狀排列，腸道黏膜上皮無(wú)脫落及壞死；模型組大鼠存在大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，炎性反應(yīng)面積增加，肝臟結(jié)構(gòu)破壞，有假小葉形成，肝細(xì)胞排列紊亂、變性及壞死，腸道黏膜上皮的斷裂，腸黏膜上皮細(xì)胞排列相對(duì)較紊亂；乳果糖組和中藥組大鼠組織的炎性浸潤(rùn)較模型組均有所改善，且中藥組改善作用最顯著，詳見(jiàn)圖1。

2.2 各組大鼠腸黏膜自噬泡電鏡檢測(cè)

電鏡下可見(jiàn)正常組大鼠腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，細(xì)胞連接緊密，可見(jiàn)少量的自噬體；模型組大鼠腸上皮細(xì)胞連接疏松，甚至消失，線(xiàn)粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，自噬體極少；乳果糖組腸上皮細(xì)胞連接依然疏松，但自噬體較模型組增多，出現(xiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體；中藥組腸上皮細(xì)胞連接較為緊密，自噬體增多最為明顯，詳見(jiàn)圖2。

圖1 各組大鼠肝(200×)和結(jié)腸(100×)組織切片HE染色Fig.1 Result of HE staining of liver (200×)and colon (100×) tissue in each group of rats

圖2 透射電鏡觀察各組大鼠腸上皮細(xì)胞的自噬體結(jié)構(gòu)Fig.2 Transmission electron microscopy observation of autophagosome structure of intestinal epithelial cells in each group of rats (3 000×)

2.3 各組大鼠內(nèi)毒素及 IL-17、IL-23的表達(dá)水平比較

與正常組比較，模型組大鼠內(nèi)毒素及IL-17、IL-23質(zhì)量濃度升高(P<0.01)；與模型組比較，乳果糖組及中藥組大鼠內(nèi)毒素及IL-17、IL-23質(zhì)量濃度均明顯下降(P<0.01)，其中，中藥組較乳果糖組的IL-17表達(dá)有所減少，IL-23表達(dá)下降更為顯著(P<0.01)，詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠內(nèi)毒素、IL-17、IL-23表達(dá)情況Tab.1 Expression of endotoxin， IL-17 and IL-23 in each group of rats

2.4 各組大鼠腸組織中LC3、Beclin-1蛋白表達(dá)水平比較

各組任取6只大鼠檢測(cè)腸組織中LC3、Beclin-1蛋白表達(dá)量見(jiàn)圖3，表2。與正常組相比較，模型組大鼠的LC3Ⅱ/LC3I及Beclin-1蛋白顯著下降(P<0.05或P<0.01)。經(jīng)干預(yù)治療后，LC3Ⅱ/LC3I均顯著升高(P<0.01)，乳果糖組Beclin-1含量有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；中藥組的Beclin-1含量則顯著升高(P<0.01)。

圖3 各組大鼠腸組織中LC3、Beclin-1蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of LC3 and Beclin-1 in intestinal tissues of rats in each group

A: normal control group;B: model group;C: lactulose group;D: Qingdu Decoction group.

表2 各組大鼠腸組織LC3、Beclin-1蛋白表達(dá)比較Tab.2 Comparison of protein expression of LC3， Beclin-1 in intestinal tissues of rats in each group

##P<0.01vsnormal control group;**P<0.01vsmodel group;△△P<0.01vslactulose group.QDD: Qingdu Decoction group.

3 討論

腸源性?xún)?nèi)毒素是CSH加重的重要因素，大量研究[9-10]證實(shí)CSH伴有腸源性?xún)?nèi)毒素血癥。CSH患者肝臟結(jié)構(gòu)遭到破壞，血液循環(huán)失調(diào)，門(mén)靜脈回流受阻，腸道黏膜充血水腫，通透性增加，致使內(nèi)毒素的吸收增加。過(guò)量的內(nèi)毒素進(jìn)入血液，可誘導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞炎性因子如IL-17、IL-23等的大量分泌，從而造成肝臟的“二次打擊”，加劇肝臟損傷。IL-17是炎性反應(yīng)的早期啟動(dòng)因子，由Th17細(xì)胞分泌，可以通過(guò)促進(jìn)釋放前炎性細(xì)胞因子來(lái)放大炎性反應(yīng)，IL-23能促進(jìn)Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-17，與重癥肝損傷密切相關(guān)[11-12]。

如何通過(guò)修復(fù)腸黏膜屏障來(lái)改善CSH肝損傷也成為疾病治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。腸黏膜屏障的損傷因素主要是缺血、缺氧，炎性因子，病原入侵等，而腸上皮細(xì)胞作為腸黏膜屏障的重要組成部分，在抵抗微生物、毒素的入侵方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。關(guān)于自噬與腸黏膜屏障功能障礙的研究[13-14]已有報(bào)道，在腸黏膜屏障功能發(fā)生障礙過(guò)程中，自噬對(duì)于維持腸上皮細(xì)胞的存活起關(guān)鍵性作用。自噬相關(guān)蛋白LC3及Beclin-1在自噬過(guò)程中起著非常重要的作用。LC3定位與自噬泡內(nèi)膜，為自噬是否發(fā)生的重要標(biāo)志物。LC3-I參與自噬起始環(huán)節(jié)，自噬發(fā)生時(shí)，經(jīng)泛素樣加工修飾與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合，經(jīng)修飾形成LC3-Ⅱ。Beclin-1 是參與自噬的重要基因，與酵母自噬基因Atg6 同源，其編碼的Beclin-1蛋白可參與自噬前提復(fù)合物和自噬小體的形成。目前，電鏡觀察自噬體是較為可靠的自噬檢測(cè)手段。LC3含量與自噬泡數(shù)成正比例關(guān)系，是自噬標(biāo)志物，LC3-Ⅱ/LC3-I可作為檢測(cè)自噬水平的生物學(xué)指標(biāo)[15]。作為自噬的標(biāo)志性分子，Beclin-1作為自噬活性的輔助指標(biāo)，已廣泛應(yīng)用于自噬活性的檢測(cè)[16]。

清毒湯是在“通腸治肝”法的指導(dǎo)下創(chuàng)制治療CSH內(nèi)毒素血癥的新方。該方化裁自增液承氣湯，由大黃、枳實(shí)、厚樸、生地、茜草組成，具有滋陰通下、涼血解毒之效，通過(guò)清除腸道毒濁邪氣，以排出肝臟中濁氣，從而治療肝病。本實(shí)驗(yàn)建立TAA致重癥肝損傷模型，對(duì)清毒湯的機(jī)制進(jìn)一步探討，結(jié)果顯示，清毒湯可明顯減輕肝腸組織炎性浸潤(rùn)，降低實(shí)驗(yàn)大鼠內(nèi)毒素及IL-17、IL-23表達(dá)，提高自噬體數(shù)量及LC3、Beclin-1蛋白含量。

綜上，TAA致重癥肝損傷大鼠內(nèi)毒素升高，IL-17、IL-23釋放增多，自噬體少見(jiàn)，并且LC3及Beclin-1蛋白含量降低，表明肝臟嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)炎性反應(yīng)因子及內(nèi)毒素增多且腸上皮細(xì)胞自噬水平較低。清毒湯干預(yù)后可降低實(shí)驗(yàn)大鼠血清內(nèi)毒素及IL-17、IL-23含量，并提高自噬水平，這說(shuō)明清毒湯可能通過(guò)激活重癥肝損傷大鼠的腸上皮細(xì)胞自噬，減少炎性反應(yīng)因子的釋放，來(lái)降低內(nèi)毒素的產(chǎn)生，從而減輕肝臟損傷。