王世祥，王 斌，郭國(guó)鋒，許 衛(wèi)，陳永權(quán)，陳晞明

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是心血管疾病患者最常見(jiàn)的死因之一[1]。而尋找能有效減輕AMI后炎癥反應(yīng)且副作用少的藥物是下一步研究方向。促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種由腎臟和肝臟分泌的糖蛋白激素，能促進(jìn)紅細(xì)胞生成，也有抗炎、抗凋亡等對(duì)組織器官的保護(hù)作用[2]。然而，有研究[3]顯示，一次性輸注大量EPO會(huì)過(guò)度刺激體內(nèi)骨髓造血系統(tǒng)，增加心血管系統(tǒng)的高凝狀態(tài)甚至血栓形成。近年有學(xué)者研究[4]合成促紅細(xì)胞生成素衍生肽(helix B surface peptide，HBSP)，一種EPO衍生而來(lái)的螺旋B表面肽，既保留EPO的組織保護(hù)作用，具有抗氧化、抑制炎癥、減少細(xì)胞凋亡的作用，同時(shí)也可以減少其副作用。因此，該文以HBSP治療AMI模型大鼠，探討HBSP對(duì)AMI心肌炎癥的影響和機(jī)制，為梗死后心肌保護(hù)尋找新的治療方案。

1 材料與方法

1.1 材料HBSP購(gòu)自上?？齐纳锟萍加邢薰?；白介素6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司；兔抗細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases1/2, Erk1/2)、兔抗磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase1/2,p-Erk1/2)、鼠抗GAPDH購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；羊抗兔二抗和驢抗鼠二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程公司；組織裂解液購(gòu)自杭州弗德生物科技有限公司；聚氰基丙烯酸正丁酯(butyleyanoacrylate, BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；牛血清白蛋白(albumin from bovine serum，BSA)粉末購(gòu)自廣州斯佳生物公司；免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物公司；POWERLAB多導(dǎo)生理記錄儀、心臟彩超機(jī)購(gòu)自美國(guó)PHILIPS公司。

1.2 動(dòng)物采用8周齡SD雄性SPF級(jí)大鼠，體質(zhì)量180～200 g，將30只大鼠隨機(jī)分成3組：sham組(10只)、AMI組(10只)、HBSP治療組(10只)。所有大鼠由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)：44008500006902)，并飼養(yǎng)于恒溫20～26 ℃、恒濕40%～70%、潔凈度7、低噪、無(wú)菌的南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 方法

1.3.1AMI模型構(gòu)建和給藥 以O(shè)livetti方法結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支的手術(shù)方法以構(gòu)建大鼠AMI模型，觀察多導(dǎo)生理記錄儀上的標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)II，若見(jiàn)ST段弓背樣抬高和(或)T波抬高或降低，大鼠周?chē)∪饨M織出現(xiàn)顏色蒼白或變暗，則提示建模成功。sham組大鼠在左前降支留置松結(jié)。HBSP組在結(jié)扎左前降支術(shù)后立即予HBSP工作液(90 μg/kg)[5]腹腔注射，sham組和AMI組予等量生理鹽水腹腔注射。術(shù)后24 h動(dòng)物實(shí)驗(yàn)大鼠全部存活，處死進(jìn)行后續(xù)處理。實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物倫理管理委員會(huì)要求。

1.3.2大鼠心肌組織IL-6、TNF-α測(cè)定 建模24 h后，取結(jié)扎線以下左心室心肌，將心肌組織研磨，組織裂解液裂解細(xì)胞，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清液，采用IL-6和TNF-α ELISA試劑盒檢測(cè)心肌組織IL-6和TNF-α含量。

1.3.3Western blot法檢測(cè)p-Erk1/2、Erk1/2蛋白的表達(dá) 建模24 h后，取結(jié)扎線以下左心室心肌，將心肌組織研磨，提取心肌組織蛋白，制成蛋白樣品，上樣后置于電泳緩沖液中電泳，分離目的蛋白，電轉(zhuǎn)120 min，5% BSA封閉1 h后，p-Erk1/2(1 ∶1 000)、Erk1/2(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶4 000)一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后，羊抗兔二抗(1 ∶15 000)或驢抗鼠二抗(1 ∶15 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL顯色，曝光掃描，分析光密度。

1.3.4免疫組化檢測(cè)Erk1/2蛋白的表達(dá) 石蠟包埋、切片(4 μm)，經(jīng)二甲苯、不同濃度酒精脫蠟，蒸餾水浸泡，微波抗原修復(fù)，室溫冷卻后，過(guò)氧化氫、3% BSA封閉，滴加Erk1/2兔抗多克隆抗體(1 ∶200)孵育過(guò)夜，滴加二抗免疫組化試劑，DAB顯色，蒸餾水終止顯色，蘇木精染核5 min，蒸餾水沖洗，脫水透明，中性樹(shù)脂封片，鏡下隨機(jī)取6個(gè)視野(×200)，拍照，采用IPP 6.0軟件統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞。

1.3.5超聲心動(dòng)圖檢查 24 h后，所有大鼠行超聲心動(dòng)圖檢查，在處死前，予以10%水合氯醛腹腔注射麻醉、備皮，應(yīng)用超聲心動(dòng)圖機(jī)(ie33型號(hào)；美國(guó)PHILIPS公司)及7.5 MHz高頻線控探頭(美國(guó)PHILIPS公司)行心臟彩超檢測(cè)，檢測(cè)左室后壁收縮期厚度(left ventricular posterior wall systolic thickness，LVPWS)、收縮期室間隔厚度(systolic septal thickness，IVSs)、左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness，LVPWd)、室間隔厚度(interventricular septal thickness，IVSd)、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 HBSP減少AMI大鼠心肌組織中IL-6、TNF-α的表達(dá)與sham組比較，AMI組大鼠心肌組織IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)顯著增加；而HBSP組大鼠心肌組織IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)均較AMI組明顯降低(P=0.000)，表明HBSP可緩解急性心肌梗死的心肌的炎癥。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織炎癥因子的表達(dá)情況

A：IL-6的表達(dá)情況；B：TNF-α的表達(dá)情況；與sham組比較：*P<0.05 ；與AMI組比較：#P<0.05

2.2 HBSP抑制AMI大鼠心肌組織Erk1/2通路

2.2.1Western blot檢測(cè)各組大鼠心肌組織p-Erk1/2和Erk1/2蛋白表達(dá)的變化 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與sham組比較，AMI組心肌組織p-Erk1/2和Erk1/2蛋白表達(dá)，以及p-Erk1/2與Erk1/2比值顯著增加；而HBSP組心肌組織p-Erk1/2和Erk1/2蛋白表達(dá)，以及p-Erk1/2與Erk1/2比值則明顯低于AMI組(P=0.001)。見(jiàn)圖2。

2.2.2TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡結(jié)果 Sham組極少陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞；AMI組可見(jiàn)大量棕黃色細(xì)胞；HBSP組可見(jiàn)部分棕黃色細(xì)胞。見(jiàn)圖3。

圖2 各組大鼠心肌組織p-Erk1/2和Erk1/2的表達(dá)情況

與sham組比較：*P<0.05 ；與AMI組比較：#P<0.05

圖3 各組大鼠心肌組織TUNEL染色情況 ×200

2.2.3免疫組化檢測(cè)各組大鼠心肌組織Erk1/2蛋白表達(dá)情況 免疫組化結(jié)果顯示與sham組比較，AMI組心肌組織中Erk1/2蛋白表達(dá)顯著增加；而HBSP組心肌組織中Erk1/2蛋白表達(dá)明顯低于AMI組(P=0.001)。見(jiàn)圖4。

2.3 HBSP對(duì)AMI大鼠心功能的影響AMI組心功能指標(biāo)顯著低于sham組，而HBSP治療組心功能指標(biāo)明顯高于AMI模型組(P=0.001)。見(jiàn)圖5、表1。手術(shù)建模后24 h，行心臟超聲檢查，sham組與AMI組大鼠比較， AMI組LVPWs、IVSs、 LVPWd、IVSd顯著升高、LVEF降低(P<0.05)。表明AMI組大鼠發(fā)生心肌重構(gòu)，心肌肥厚。建模24 h后，在相同條件下，HBSP組與AMI組 LVPWs、IVSs、 LVPWd、IVSd顯著降低,LVEF顯著升高(P<0.05)。表明HBSP能夠減少心肌損傷，保護(hù)心功能。

圖4 各組大鼠心肌組織Erk1/2的表達(dá)情況

與sham組比較：*P<0.05 ；與AMI組比較：#P<0.05

表1 處死前各組超聲心動(dòng)圖各指標(biāo)比較

與sham組比較：*P<0.05 ；與AMI組比較：#P<0.05

3 討論

HBSP是EPO衍生而來(lái)的表面肽[6]，具有抗炎、抗凋亡、抗氧化等作用。近幾年，越來(lái)越多學(xué)者通過(guò)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明HBSP對(duì)細(xì)胞、組織器官(如心臟、腎臟、神經(jīng)等)有重要的保護(hù)作用[5]，本研究證明了HBSP可以減輕炎癥反應(yīng)和下調(diào)Erk1/2的表達(dá)。通過(guò)抑制Erk1/2信號(hào)通路，減少I(mǎi)L-6和TNF-α的表達(dá)，同時(shí)抑制STAT3和Bcl-2的表達(dá)，從而減輕心肌梗死中心肌組織的炎癥、凋亡和心肌受損。這為尋找保護(hù)心肌提供新的藥物選擇。

圖5 三組大鼠心臟彩超情況

AMI是冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)性缺血低氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞受損、壞死、凋亡、炎癥的過(guò)程，該過(guò)程伴有心肌酶活性的增高、心電圖進(jìn)行性改變及心功能的改變。其中，心臟彩超是評(píng)價(jià)心功能的重要輔助檢查。本文通過(guò)心臟彩超檢查心功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HBSP可減少心肌受損。Erk1/2是絲裂原活化蛋白激酶的一個(gè)亞族。Erk1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡、炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)[7]。既往文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道，p-Erk1/2信號(hào)通路可調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥活動(dòng)。p-Erk1/2從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核作用于核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、轉(zhuǎn)錄激活因子等轉(zhuǎn)錄因子，后者進(jìn)一步調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，其中NF-κB可調(diào)節(jié)各種炎癥因子及炎癥介質(zhì)，NF-κB的激活可引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)多種促炎癥的細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-6；同時(shí)TNF-α亦可激活Erk1/2從而放大炎癥反應(yīng)[10-12]。有研究[13-15]顯示，Erk1/2可通過(guò)NF-κB促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子TNF-α的轉(zhuǎn)錄，后者可激活Erk1/2從而形成惡性循環(huán)，進(jìn)一步加強(qiáng)炎癥放大級(jí)聯(lián)反應(yīng)。對(duì)于心血管方面，活化的Erk1/2 信號(hào)通路在冠心病致心肌炎癥反應(yīng)及心功能損傷過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，并提出抑制ERK1/2 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能成為冠心病致心肌炎癥反應(yīng)防治的潛在新靶點(diǎn)[16]。本研究通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，HBSP降低心肌組織炎癥因子TNF-α和IL-6的含量，減少AMI大鼠心肌組織p-Erk1/2和Erk1/2的表達(dá)。此結(jié)果提示，HBSP可通過(guò)抑制Erk1/2的表達(dá)減少炎癥因子TNF-α和IL-6以及心肌損傷標(biāo)志物的釋放。