唐敏 呂紅彬 何躍 歐陽科 周琦 田敏 向小紅 曹陽

糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病特異性的眼部微血管并發(fā)癥之一[1]。病理性新生血管形成是DR從非增生型發(fā)展為增生型的關鍵性事件，當前抑制病理性血管形成的研究主要集中于抗血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，而最新的研究是以阻斷內皮細胞糖酵解為中心來抑制新生血管生成。磷酸果糖激酶-2/果糖-2，6-二磷酸酶3(phospofructokinase-2/fructose-2，6-bisphosphatase 3，PFKFB3)是內皮細胞糖酵解過程中的一個限速性調節(jié)酶，抑制PFKFB3的表達可使內皮細胞糖酵解速率降低，抑制內皮細胞增殖和遷移，從而減少血管萌芽[2]。本研究通過定量檢測增生型DR(proliferative DR,PDR)與非DR患者血清和玻璃體中的PFKFB3及VEGF表達水平，并對比玻璃體內注射抗VEGF藥物后相關指標的變化情況，旨在探討PFKFB3在PDR發(fā)生發(fā)展中的可能作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料與分組 選取2015年12月5日至2017年1月19日于我科行經(jīng)睫狀體平坦部25G+微創(chuàng)玻璃體切割術的患者62例62眼。試驗組納入標準：確診為PDR，具備手術指征者。對照組納入標準：確診為全層黃斑裂孔(full thickness macular hole，F(xiàn)TMH)及黃斑前膜(preretinal membrane of the macula，PRMM)，并具備手術指征者。以上患者均排除患有自身免疫性疾病、肝臟損害、肺部疾病、精神性疾病及惡性腫瘤等疾病者，嚴格按照以上納入和排除標準，最終納入試驗組患者42例(42眼)，其中男24例24眼，女18例18眼，年齡46～71(55.43±9.29)歲，并據(jù)患者玻璃體切割術前是否行玻璃體內注射雷珠單抗而進一步分為非注藥組和注藥組。其中，非注藥組16例16眼，男9例9眼，女7例7眼，年齡43～71(54.88±9.46)歲；注藥組26例26眼，男15例15眼，女11例11眼，年齡46～69(55.77±9.35)歲；對照組患者20例(20眼)，其中FTMH 14例14眼，PRMM 6例6眼，年齡44～70(53.95±10.21)歲。以上各組年齡構成比差異無統(tǒng)計學意義(P=0.973)，性別構成比差異無統(tǒng)計學意義(P=0.818)。獲取標本前獲得患者及家屬知情同意，并簽署知情同意書。所有血清和玻璃體采集均已通過我院倫理審查委員會審查。

1.2 主要儀器及試劑 VX-10Ii眼底照相分析儀(日本，KOWA)、Aviso超聲(法國，光太)、光學相干斷層成像掃描儀(德國，Zeiss)、25G+微創(chuàng)玻璃體切割機(美國，Bausch Lomb)、手術顯微鏡(德國，Zeiss)、-80 ℃超低溫冰箱(美國，Thermo)、高速離心機(德國，Eppendorf)、微量移液槍(德國，Eppendorf)、水平搖床(美國，Thermo)、酶標儀(美國，Thermo)、PFKFB3和VEGF試劑盒(北京，安迪華泰生物)。

1.3 方法

1.3.1 血清標本采集及保存 各組患者于手術當天清晨抽取空腹肘靜脈全血約4 mL，4 ℃靜置1 h，以4000 r·min-1離心10 min，取上清，分裝后放于-80 ℃ 超低溫冰箱中凍存，待測。

1.3.2 玻璃體標本采集及保存 手術開始后建立微創(chuàng)玻璃體切割三通道，切割并收集未經(jīng)稀釋的中央玻璃體，取樣后立即注入1.5 mL消毒微量離心管中，在4 ℃條件下，以14 000 r·min-1離心6 min，取上清，分裝后放于-80 ℃超低溫冰箱中凍存，待測。酶聯(lián)免疫吸附試驗測定各組樣本玻璃體及血清中PFKFB3和VEGF表達水平。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標準差表示，兩組間采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間有意義的進一步運用LSD法對各組間指標進行兩兩比較；計數(shù)資料采用例數(shù)描述，組間比較采用卡方檢驗。采用Pearson相關性分析對各指標間的相關性進行分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各組玻璃體、血清中PFKFB3及VEGF表達 試驗組患者玻璃體中PFKFB3的水平為(463.17±381.28)ng·L-1，明顯高于對照組[(158.43±86.88)ng·L-1](t=4.919，P<0.001)；試驗組血清中PFKFB3的水平為(153.45±83.78)ng·L-1，明顯高于對照組[(92.72±32.42)ng·L-1](t=4.098，P<0.001)。非注藥組患者玻璃體中PFKFB3的水平為(797.29±387.44)ng·L-1，明顯高于注藥組[(257.56±181.49)ng·L-1](t=5.230，P<0.001)，而非注藥組血清中PFKFB3的水平[(164.72±102.57)ng·L-1]與注藥組[(146.52±71.18)ng·L-1]差異無統(tǒng)計學意義(t=0.679，P=0.501)。

試驗組患者玻璃體中VEGF的水平為(1713.50±1386.90)ng·L-1，明顯高于對照組[(205.52±92.93)ng·L-1](t=7.014，P<0.001)；試驗組血清中VEGF的水平為(224.98±168.08)ng·L-1，明顯高于對照組[(86.80±36.51)ng·L-1](t=5.082，P<0.001)。非注藥組患者玻璃體中VEGF的水平為(3399.72±510.06)ng·L-1，明顯高于注藥組[(675.82±242.57)ng·L-1](t=20.014，P<0.001)，非注藥組血清中VEGF的水平為[(373.40±174.23)ng·L-1]，亦明顯高于注藥組[(133.65±73.10)ng·L-1](t=5.228，P<0.001)。

2.2 各組PFKFB3及VEGF在玻璃體和血清中表達相關性 非注藥組、注藥組和對照組患者玻璃體與血清中的PFKFB3水平無相關性(非注藥組：r=0.194，P=0.471；注藥組：r=0.071，P=0.731；對照組：r=0.254，P=0.279)。

非注藥組、注藥組和對照組患者玻璃體與血清中的VEGF水平均存在正相關關系(非注藥組：r=0.952，P<0.001；注藥組：r=0.423，P=0.031；對照組：r=0.776，P<0.001)，見圖1。

非注藥組、注藥組和對照組患者玻璃體中PFKFB3與VEGF水平均存在正相關關系(非注藥組：r=0.865，P<0.001；注藥組：r=0.587，P=0.002；對照組：r=0.807，P<0.001)，而在血清中僅注藥組的PFKFB3與VEGF水平存在正相關關系(r=0.444，P=0.023)，非注藥組和對照組均無明顯相關性(非注藥組：r=-0.130，P=0.631；對照組:r=0.045，P=0.849)，見圖2。

圖1 非注藥組、注藥組和對照組間玻璃體與血清中VEGF濃度散點圖。A：非注藥組；B：注藥組；C：對照組

圖2 非注藥組、注藥組和對照組PFKFB3與VEGF濃度散點圖。A：非注藥組(玻璃體中)；B：注藥組(玻璃體中)；C：對照組(玻璃體中)；D：注藥組(血清中)

3 討論

PFKFB3是PFKFB家族的一員，被稱為人體新陳代謝的“調節(jié)器”[3]。在低氧環(huán)境、炎癥因子或生長因子的刺激下，PFKFB3表達增多，可明顯提升糖酵解速率[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，內皮細胞出芽和分裂所需的80%以上能量供應是來自于糖酵解而非氧化代謝[5-6]，并且在內皮細胞遷移和增殖時，其糖分解速率將會提高2倍[5]。因此，內皮細胞的糖酵解途徑可能成為調節(jié)新生血管形成的一個潛在作用靶點，而PFKFB3作為內皮細胞糖代謝中的重要調節(jié)酶，其在新生血管的形成過程中發(fā)揮著至關重要的作用。

本研究結果顯示，試驗組患者玻璃體和血清中PFKFB3的表達均明顯高于對照組，提示PFKFB3可能參與了PDR的發(fā)生發(fā)展。DR中視網(wǎng)膜缺血缺氧是促進新生血管形成的最強刺激因素，Xu等[7]將臍靜脈內皮細胞置于低氧環(huán)境下(氧體積分數(shù)為0.5%)，其PFKFB3 mRNA及蛋白表達水平明顯上調，表明缺血缺氧條件下，視網(wǎng)膜血管內皮細胞的PFKFB3表達明顯增高。本研究中，試驗組和對照組玻璃體與血清中PFKFB3含量無相關性，這表明PDR患者玻璃體內相對高濃度的PFKFB3可能來源于局部眼內組織，如視網(wǎng)膜血管內皮細胞等的高表達。PFKFB3作為糖酵解過程中的關鍵酶，主要在細胞內發(fā)揮作用。高糖作用下的視網(wǎng)膜血管內皮細胞處于病理狀態(tài)，內皮細胞凋亡增加，使得局部玻璃體中可檢測到濃度相對較高的PFKFB3。

VEGF是目前研究最多、作用最明確的促血管生成因子。王歡等[8]研究發(fā)現(xiàn)，PDR組玻璃體VEGF含量較黃斑裂孔組、正常對照組均明顯升高。Sydorova 等[9]研究表明，PDR組患者血清和玻璃體中VEGF含量均高于增生型玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreous retinopathy，PVR)組和對照組，而PVR組患者僅在血清中VEGF含量升高，提示PDR患者眼內組織大量合成VEGF參與PDR發(fā)生發(fā)展過程。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗組和對照組玻璃體與血清中VEGF具有顯著相關性，這一結果與Baharivand等[10]研究一致，即PDR組患者血清和玻璃體中VEGF含量均高于對照組，而且血清與玻璃體中VEGF含量具有顯著相關性。

玻璃體內注射抗VEGF抗體是目前公認治療PDR的有效方法，本研究結果顯示，非注藥組玻璃體和血清中濃度水平均明顯高于注藥組，這與Ma等[11]的研究結果一致。眼內注射抗VEGF抗體可直接結合玻璃體內的游離VEGF從而使測得的VEGF濃度大大下降。單俊杰等[12]研究顯示，PDR患者玻璃內注射貝伐單抗后所有樣本血清中VEGF含量均降低，且在術后7 d達最大降幅，術后28 d VEGF有所上升，但仍未達術前水平，這表明局部注射的抗VEGF抗體可到達血液循環(huán)從而引起血清VEGF水平的下降。

在血管生成過程中，內皮細胞的運動和活性受多種基因、分子信號及代謝途徑共同調控，其中包括VEGF和PFKFB3[13-15]。Xu等[7]研究發(fā)現(xiàn)，VEGF可促進PFKFB3的表達，且VEGF同時在轉錄水平及轉錄后水平對PFKFB3進行調控。另外，PFKFB3抑制劑可以擴大阻斷VEGF的效應。因此，VEGF可能是PFKFB3的上游信號分子，它們相互作用共同調節(jié)血管新生過程。本研究結果顯示，非注藥組玻璃體中PFKFB3含量明顯高于注藥組，與兩組間玻璃體中VEGF含量變化趨勢一致，且PFKFB3含量與VEGF含量具有顯著相關性。而各組間血清中僅注藥組PFKFB3與VEGF含量變化具有相關性，這可能是因為使用抗VEGF藥物減少VEGF與VEGF受體的結合，減弱VEGF對PKFKB3表達的上調作用，而血清中VEGF的濃度下降并未引起血清PFKFB3表達水平的改變，其原因可能是由于局部玻璃體內注射的抗VEGF藥物經(jīng)血循環(huán)進入全身的量不足以引起PFKFB3表達量的改變。加之PFKFB3作為糖酵解過程中的關鍵酶，其主要在細胞內發(fā)揮作用，而在血清中可檢測的量是十分有限的。

目前，有關于PFKFB3在DR中作用的研究尚十分有限，但從迄今已有的研究來看，通過抑制PFKFB3而減少病理性新生血管形成來在延緩DR可能成為有效的治療策略。