李 卓，張雄峰，孫瑞玲，杏朝剛，張 棋，張啟明，焦紹赫

（1.江西省煙草科學(xué)研究所，江西 南昌 330000；2.甘肅省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，甘肅 蘭州 730020；3.浙江大學(xué)農(nóng)生環(huán)測(cè)試中心，浙江 杭州 310058；4.瀘州市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，四川 瀘州 646000）

【研究意義】烤煙中揮發(fā)性化合物是煙葉產(chǎn)生香氣的根本原因，也是衡量煙葉品質(zhì)的重要依據(jù)［1-2］。常用的揮發(fā)性化合物萃取或進(jìn)樣方法有固相微萃取［3］、同時(shí)蒸餾萃?。?］、超臨界萃?。?］和頂空法［6-8］。其中固相微萃取受萃取頭極性和厚度的干擾較大；蒸餾萃取耗時(shí)且樣品平行性較差；超臨界萃取法成本較高且受夾帶劑影響較大。由于靜態(tài)頂空法直接吸取樣品上方氣體進(jìn)行分析，操作簡(jiǎn)單，條件溫和，能杜絕溶劑的污染，所得到的揮發(fā)性成分與人體嗅覺(jué)所感覺(jué)到的氣味最接近，與感官評(píng)價(jià)相關(guān)性好，因此采用靜態(tài)頂空技術(shù)收集煙葉揮發(fā)性化合物。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜組分的分離、鑒定和定量分析，首先根據(jù)樣品中各組分的沸點(diǎn)、極性或吸附性能不同，將混合體系中的化合物分離開(kāi)，隨后通過(guò)分子、離子和不同豐度的碎片離子確定化合物的分子量和結(jié)構(gòu)信息，可以在沒(méi)有部分標(biāo)準(zhǔn)品的情況下確定樣品中多個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)并進(jìn)行定量分析［9］。

【前人研究進(jìn)展】化學(xué)計(jì)量學(xué)是一種統(tǒng)計(jì)學(xué)工具，廣泛用于數(shù)據(jù)處理、方法選擇、信息提取和結(jié)果解釋［10］。目前已有一些研究是通過(guò)建立化學(xué)計(jì)量學(xué)模型將煙草中的感官評(píng)吸質(zhì)量與化學(xué)成分、卷煙材料或氣候特征相關(guān)聯(lián)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)煙草的質(zhì)量控制。陳義強(qiáng)等［11］采用主成分分析和相關(guān)分析的方法，分析了不同移栽期處理下氣溫指標(biāo)與感官評(píng)吸質(zhì)量的關(guān)系，探討影響煙葉品質(zhì)的關(guān)鍵氣溫因子；張亞平等［12］采用偏最小二乘（PLS）回歸法，考察了卷煙紙組分（亞麻配比、包灰劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)、助燃劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)和助燃劑中鉀鈉比）對(duì)常規(guī)和細(xì)支卷煙煙氣成分釋放量及感官質(zhì)量的影響；楊超等［13］以9個(gè)牌號(hào)卷煙的煙葉和配方葉組的氮堿比值、糖氮比值、糖堿比值為研究對(duì)象，分析了不同配方組成煙葉的化學(xué)成分差異及其組合比例對(duì)感官評(píng)吸質(zhì)量及風(fēng)格的影響；李廣才等［14］運(yùn)用廣義可加模型系統(tǒng)研究了湖南烤煙主要化學(xué)成分/指標(biāo)與評(píng)吸質(zhì)量間的線性與非線性關(guān)系；周蕓等［15］分產(chǎn)地、年份、部位系統(tǒng)分析了閩西、滇東、川西南3個(gè)清香型典型產(chǎn)地?zé)熑~中游離氨基酸含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）及構(gòu)成指標(biāo)與感官質(zhì)量指標(biāo)的相關(guān)性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】煙氣化學(xué)成分被認(rèn)為與煙葉感官評(píng)吸質(zhì)量最直接相關(guān)，而揮發(fā)性香氣成分作為部分煙氣組成和煙氣組分的前體物質(zhì)，必然影響著感官評(píng)吸質(zhì)量，目前行業(yè)內(nèi)基于揮發(fā)性化合物的煙草質(zhì)量控制研究并不多見(jiàn)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)靜態(tài)頂空-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定了贛州烤煙樣品中的揮發(fā)性化合物含量，并采用主成分分析、遺傳算法等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法挖掘了贛州不同產(chǎn)地?zé)熑~中揮發(fā)性化合物的含量規(guī)律，并用線性判別分析、反傳-人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、最小二乘-支持向量機(jī)進(jìn)行了產(chǎn)地預(yù)報(bào)分類，在煙草研究和生產(chǎn)領(lǐng)域具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

贛州作為重要的煙葉產(chǎn)地，煙葉產(chǎn)量接近江西全省產(chǎn)量50%，我們收集到贛州6個(gè)產(chǎn)煙區(qū)縣共62個(gè)烤煙樣品，其中石城14個(gè)、瑞金12個(gè)、安遠(yuǎn)9個(gè)、會(huì)昌13個(gè)、興國(guó)5個(gè)、信豐9個(gè)（表1）。檢測(cè)儀器：自動(dòng)頂空進(jìn)樣-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent 7697A-7890B-5977A, 安捷倫, 美國(guó)）。

表1 烤煙樣品的產(chǎn)地信息Table 1 Origin information of flue-cured tobacco samples

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 先用軟毛刷刷去煙葉上的細(xì)土和砂粒，抽去主脈，切絲機(jī)切絲，放入40℃的烘箱中烘干，直至煙絲可捻碎，馬上研磨煙絲，研磨不應(yīng)超過(guò) 2 min，然后過(guò)0.425 mm篩得到粒徑均勻的煙粉樣品［16］。

1.2.2 樣品檢測(cè) （1）靜態(tài)頂空條件。稱樣量：0.3 g；樣品平衡溫度：140℃；樣品環(huán)溫度：170℃；傳輸線溫度：175℃； 輔助加熱區(qū)溫度：185℃；樣品平衡時(shí)間：45 min；進(jìn)樣時(shí)間：0.5 min；進(jìn)樣模式：時(shí)間恒定、高壓進(jìn)樣。

（2）氣相色譜條件。色譜柱：HP-FFAP（50 m×0.32 mm×0.5 μm）；進(jìn)樣量：1.0 μL，不分流進(jìn)樣；載氣：氦氣；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣口溫度：240℃；程序升溫：初始溫度70℃，1.2℃/min升高到110℃，然后1.5℃/min升高到140℃、保持2 min，再5℃/min升高到230℃、保持20min。

（3）質(zhì)譜條件。離子源溫度：230℃；四級(jí)桿溫度：150℃；電離能：70 eV；傳輸線溫度：240℃；掃描質(zhì)量數(shù)范圍：35～455 aum；溶劑延遲：6 min；采集模式：全掃描（Scan）與選擇離子檢測(cè)（SIM）同時(shí)采集。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Matlab軟件（7.0 edtion,Mathworks, 美國(guó)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性化合物的識(shí)別

將總離子流色譜圖解卷積分析，再對(duì)照NIST11庫(kù)和Willy08質(zhì)譜庫(kù)并參考《煙草與煙氣化學(xué)成分》［17］進(jìn)行驗(yàn)證，得到54個(gè)匹配度大于80的化合物（表2）。

表2 匹配出的54種揮發(fā)性化合物Table 2 List of 54 volatile compounds

（續(xù)表2）

2.2 樣品主成分分析

主成分分析（PCA）是一種無(wú)監(jiān)督模式識(shí)別方法，其基本思想是對(duì)原始特征變量進(jìn)行降維并最大限度保留有用信息，通過(guò)對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行線性組合形成若干個(gè)相互正交的新變量（主成分）［18］。將這54種揮發(fā)性化合物的含量作為變量對(duì)62個(gè)烤煙樣品進(jìn)行主成分分析，結(jié)果（圖1）發(fā)現(xiàn)，石城樣品的第一主成分得分最低，可以和其他幾個(gè)產(chǎn)區(qū)區(qū)分開(kāi)，其他5個(gè)產(chǎn)區(qū)的樣品互有重疊，尤其是安遠(yuǎn)和會(huì)昌樣品，在第一和第二主成分上跨度都很大，分布過(guò)于分散；整體而言，第一主成分得分瑞金＜安遠(yuǎn)、會(huì)昌＜興國(guó)、信豐，但由于樣品分布重疊嚴(yán)重，分類規(guī)律并不明顯。為此，我們采用遺傳算法-偏最小二乘法（GAPLS）對(duì)變量進(jìn)行篩選，選擇出有利于產(chǎn)地分類的部分揮發(fā)性化合物。

圖1 樣品的主成分投影（PC1～PC2）Fig. 1 Principal component projections of samples (PC1～PC2）

2.3 對(duì)揮發(fā)性化合物的變量選擇結(jié)果

GA-PLS是一種廣泛應(yīng)用的變量選擇方法，它根據(jù)達(dá)爾文生物進(jìn)化論中“遺傳-變異-適者生存”的思想模擬自然進(jìn)化過(guò)程，對(duì)需優(yōu)化的空間進(jìn)行隨機(jī)搜索，直至目標(biāo)函數(shù)收斂，從而得到最優(yōu)解，由于結(jié)合了PLS，因此具有較好的預(yù)測(cè)能力［19］。圖2是GA-PLS運(yùn)行過(guò)程中交叉驗(yàn)證方差（Cross validation variance, CV）隨變量數(shù)的變化圖，插圖為各變量在迭代運(yùn)算中出現(xiàn)的頻數(shù)圖，經(jīng)過(guò)100次循環(huán)運(yùn)算后，變量選擇完成。當(dāng)變量數(shù)在9以上時(shí)，CV幾乎達(dá)到飽和，上升非常緩慢；當(dāng)變量數(shù)為11時(shí)（黑色箭頭標(biāo)注），CV達(dá)到最大(94.8%），隨后開(kāi)始略有下降。有文獻(xiàn)報(bào)道，特征變量的數(shù)目需遵循以下關(guān)系，S/V＞4（S為樣品數(shù)，V為變量數(shù)）［20］，本研究中，特征變量個(gè)數(shù)不能超過(guò)15，因此我們選擇迭代運(yùn)行中出現(xiàn)頻數(shù)在23次及以上的11個(gè)變量（圖2插圖中虛線以上）作為主成分分析變量。

圖2 GA-PLS變量選擇迭代運(yùn)算Fig. 2 Iterative operation diagram of GA-PLS variable selection

圖3 烤煙樣品的GC圖Fig. 3 GC chromatogram of flue-cured tobacco samples

圖3是烤煙樣品的完整色譜圖，4個(gè)插圖為色譜圖的局部放大圖，11個(gè)所選變量對(duì)應(yīng)的色譜峰被一一標(biāo)出（C1～C11），對(duì)應(yīng)的化合物結(jié)構(gòu)式如圖4所示，可以看出，這11種化合物色譜峰面積大小不一，在煙葉中的含量差距很大，說(shuō)明能引起樣品分類效果改變的指標(biāo)不一定是含量很高的成分，也可以是一些含量很低的組分，這些低含量組分可能在感官評(píng)吸中也起到了重要作用。

圖4 11種揮發(fā)性化合物的結(jié)構(gòu)圖Fig. 4 Structures of 11 volatile compounds

3 討論

3.1 無(wú)監(jiān)督模式識(shí)別分析結(jié)果

圖5 依據(jù)11個(gè)所選變量（揮發(fā)性化合物）的所有樣品的主成分投影（PC1～PC2）Fig. 5 Principal component projections of all samples based on 11 selected variables (volatile compounds) (PC1～PC2)

圖5為42個(gè)樣品的主成分得分投影（PC1～PC2），相比較篩選變量前，分類效果得到顯著改善，尤其是安遠(yuǎn)和會(huì)昌原本分布散落的樣品更加集中，PC1貢獻(xiàn)率達(dá)到78.8%，樣品幾乎是沿著PC1依次分布，圖中用灰線分隔成4個(gè)區(qū)域，PC1得分依次為石城＜瑞金＜安遠(yuǎn)＜會(huì)昌、興國(guó)、信豐，這和變量篩選前的主成分得分趨勢(shì)基本相似，4個(gè)區(qū)域的樣品在PC1上就可以完全區(qū)分開(kāi)，會(huì)昌、興國(guó)、信豐三地樣品的PC1得分較為接近，但是會(huì)昌樣品的PC2得分要明顯高于興國(guó)、信豐，在PC2上也能較好區(qū)分，興國(guó)、信豐樣品分布比較接近，PC2得分相當(dāng)，PC1得分信豐稍高于興國(guó)，換言之，6個(gè)區(qū)縣的樣品幾乎都可以在PC1～PC2投影圖上分開(kāi)，表現(xiàn)較出較高的產(chǎn)地區(qū)分度。

圖6為11個(gè)載荷的主成分投影圖，結(jié)合樣品的投影分布，可以看出這幾種揮發(fā)性化合物整體含量依次為石城＞瑞金＞安遠(yuǎn)＞會(huì)昌、興國(guó)、信豐，而這一地域排序正好與感官評(píng)吸上認(rèn)為的贛州煙葉香型風(fēng)格從醇甜香韻占主導(dǎo)逐漸向焦甜香韻轉(zhuǎn)變的趨勢(shì)相吻合，對(duì)于研究贛州乃至省內(nèi)外煙葉香型風(fēng)格的劃分具有指導(dǎo)意義。其中，樣品中2-乙?；量?、2-乙酰基呋喃、1-羥基-2-丙酮、1-羥基-2-丁酮、3-呋喃甲醇、甲酸糠酯等化合物含量由高到低依次為石城＞瑞金＞安遠(yuǎn)＞會(huì)昌、興國(guó)、信豐，這幾種物質(zhì)可能是引起醇甜香韻的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)的前體組分；興國(guó)、信豐兩區(qū)縣的β-大馬酮、3-甲基-2（5H）-呋喃酮、臧紅花醛含量要低于其他區(qū)縣；會(huì)昌樣品的甲酸糠酯含量最低，石城、信豐含量最高。

圖6 所選揮發(fā)性化合物的載荷（PC1～PC2）Fig. 6 Loading plot of 18 volatile compounds (PC1～PC2）

3.2 有監(jiān)督模式識(shí)別預(yù)報(bào)結(jié)果

為了驗(yàn)證產(chǎn)地分類的可靠性，我們隨機(jī)選取42個(gè)樣品作為校正集（石城9個(gè)、瑞金8個(gè)、安遠(yuǎn)6個(gè)、會(huì)昌9個(gè)、興國(guó)4個(gè)、信豐6個(gè)），剩余20個(gè)樣品作為預(yù)報(bào)集（石城5個(gè)、瑞金4個(gè)、安遠(yuǎn)3個(gè)、會(huì)昌4個(gè)、興國(guó)1個(gè)、信豐3個(gè)），分別采用線性判別分析(LDA）、反傳-人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（BP-ANN）、最小二乘-支持向量機(jī)（LSSVM）3種有監(jiān)督模式識(shí)別方法對(duì)樣品進(jìn)行產(chǎn)地預(yù)報(bào)。

LDA是一種線性參數(shù)方法［21］，它根據(jù)對(duì)象之間的歐氏距離將最近鄰的對(duì)象構(gòu)建成類，通過(guò)減少特征向量使得類間方差的比率最大化而類內(nèi)方差的比率最小化，尋求不同類別之間的最大分離，從而對(duì)未知樣品進(jìn)行分類。

ANN是一種模擬生物神經(jīng)系統(tǒng)的非線性計(jì)算方法［22］，分為輸入層、隱藏層和輸出層，隱藏層和輸出層都有相應(yīng)的激勵(lì)函數(shù)，通過(guò)反復(fù)的數(shù)據(jù)信息刺激調(diào)整權(quán)值（每層神經(jīng)元與下層神經(jīng)元間權(quán)重）；BP是指調(diào)整權(quán)值的方式為采用最速梯度下降法將訓(xùn)練誤差從輸出層開(kāi)始逐層反向傳播到每個(gè)隱藏層。

SVM是一個(gè)具有稀疏性和穩(wěn)健性的分類方法［23］，通過(guò)二次規(guī)劃獲得支持向量（SVs），并將輸入數(shù)據(jù)傳送到高維特征空間。LS-SVM是一種改進(jìn)的支持向量機(jī)方法，通過(guò)運(yùn)用最小二乘系統(tǒng)取代二次規(guī)劃獲得支持向量。該方法的核心是選擇適當(dāng)?shù)暮撕瘮?shù)并優(yōu)化核參數(shù)，核函數(shù)一般選用徑向基函數(shù)，并通過(guò)留一交叉驗(yàn)證法由網(wǎng)格搜索技術(shù)得到高斯中心μ和分布寬度σ。

表3列出了3種模式識(shí)別方法的識(shí)別率和預(yù)報(bào)率結(jié)果。LDA模型的識(shí)別率和預(yù)報(bào)率分別為83.3%和73.7%，分類錯(cuò)誤樣本分別有7個(gè)和5個(gè)；BP-ANN模型的識(shí)別率和預(yù)報(bào)率分別為97.6%和95.0%，分類錯(cuò)誤樣本均只有1個(gè)，LS-SVM模型的識(shí)別率和預(yù)報(bào)率分別為100%和95.0%，只有1個(gè)預(yù)報(bào)集樣本分類錯(cuò)誤。由此可見(jiàn)，BP-ANN和LS-SVM兩個(gè)模型得到的預(yù)報(bào)結(jié)果遠(yuǎn)優(yōu)于LDA，這可能是因?yàn)闃悠泛妥兞恐g并不完全線性相關(guān)，LDA僅適用于線性模式識(shí)別體系，而B(niǎo)PANN和LS-SVM更適用于存在一定非線性的體系，它們對(duì)于非線性模型的預(yù)報(bào)能力更強(qiáng)，由此我們建立了贛州烤煙樣品的產(chǎn)地鑒別模型。

表3 不同模式識(shí)別方法的預(yù)報(bào)結(jié)果Table 3 Classification results of different pattern recognition methods

4 結(jié)論

本研究通過(guò)靜態(tài)頂空-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定了贛州6個(gè)產(chǎn)煙區(qū)縣（石城、瑞金、安遠(yuǎn)、會(huì)昌、興國(guó)、信豐）62個(gè)烤煙樣品中的54種揮發(fā)性化合物含量，利用遺傳算法篩選出其中11種用于主成分分析，可以基本將原本分類效果不理想的6個(gè)區(qū)縣樣品區(qū)分開(kāi)。通過(guò)LDA、BP-ANN、LSSVM等3種有監(jiān)督模式識(shí)別方法進(jìn)行產(chǎn)地預(yù)報(bào)，其中，BP-ANN和LS-SVM的預(yù)報(bào)結(jié)果較好，整體預(yù)報(bào)正確率分別達(dá)到96.8%和98.4%，據(jù)此建立了贛州烤煙樣品的產(chǎn)地鑒別模型。該模型可以較為準(zhǔn)確地判定烤煙樣品的來(lái)源，同時(shí)可以找到不同產(chǎn)地間揮發(fā)性化合物的含量規(guī)律，一定程度上可以作為贛州不同區(qū)縣產(chǎn)地烤煙香型風(fēng)格的判定依據(jù)；該方法也可以推廣用于省內(nèi)其他煙區(qū)乃至全國(guó)煙葉的香型風(fēng)格劃分和質(zhì)量控制，在煙草研究和生產(chǎn)領(lǐng)域具有重要的意義。