李炎坤 卓一南 曾湘達(dá) 何瑞

摘? 要? D14基因是獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵基因，其編碼的蛋白能夠使SLs釋放出活性小分子物質(zhì)而發(fā)揮調(diào)節(jié)腋芽起始的功能。本研究根據(jù)其他物種的D14基因從青天葵轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選獲得2條高度同源的片段，命名為NfD14a和NfD14b。應(yīng)用RT-PCR和RACE技術(shù)，克隆獲得NfD14a和NfD14b的cDNA全長(zhǎng)序列，GenBank登錄號(hào)分別為MH028026、MH028027。NfD14a基因全長(zhǎng)1206 bp，ORF為861 bp，編碼286個(gè)氨基酸;NfD14b基因全長(zhǎng)1082 bp，ORF為813 bp，編碼270個(gè)氨基酸。對(duì)NfD14的編碼蛋白序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明：NfD14a和NfD14b均屬于a/b折疊蛋白水解酶超家族成員（Abhydrolase superfamily），但系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明兩者同源性不高。利用一步快速克隆的方法構(gòu)建了植物表達(dá)載體35S：：NfD14a-EGFP和35S：：NfD14b-EGFP，并分別獲得其工程菌。瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果表明，NfD14a和NfD14b均定位在煙草原生質(zhì)體的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。本研究通過(guò)對(duì)NfD14基因全長(zhǎng)cDNA序列的克隆與亞細(xì)胞定位分析，為青天葵獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控植物分枝生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞? 青天葵;獨(dú)腳金內(nèi)酯;D14;RACE克隆中圖分類號(hào)? S567? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

嶺南藥材青天葵來(lái)源于蘭科植物毛唇芋蘭[Nervilia fordii （Hance） Schltr.]的干燥葉或全草，主要分布于兩廣、海南、四川、云南等地區(qū)。青天葵具有清熱潤(rùn)肺、解毒消腫的功效，主治肺癆咳血、肺熱咳嗽、口瘡、喉嚨腫痛等[1]呼吸道疾病，代表性中成藥有天龍咳喘靈膠囊、天龍茶、天龍喘咳靈等[2-3]，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而青天葵自身繁殖能力低，臨床需求量大，過(guò)度采挖造成青天葵野生資源嚴(yán)重枯竭。雖然研究人員已經(jīng)對(duì)青天葵展開了多方面的研究[4-6]，但對(duì)于解決青天葵藥用資源短缺的問題收效甚微。

近年來(lái)，研究人員從植物的多分枝突變體中發(fā)現(xiàn)了一類新型植物激素——獨(dú)腳金內(nèi)酯（Stri golactones，SLs），具有抑制植物分枝生長(zhǎng)、控制中胚軸伸長(zhǎng)、促進(jìn)側(cè)根形成和誘導(dǎo)根毛伸長(zhǎng)的作用[7-8]。目前已經(jīng)被證實(shí)參與獨(dú)腳金內(nèi)酯的合成和運(yùn)輸途徑的關(guān)鍵基因有D27、CCD7、CCD8、MAX1、D3、D53和D14等[9-10]。其中D14基因是獨(dú)腳金內(nèi)酯運(yùn)輸途徑中的關(guān)鍵基因，能夠與D3蛋白形成SCF蛋白復(fù)合體，與SLs結(jié)合釋放出活性小分子物質(zhì)CLIM（covalently linked inter mediate mole cule），從而發(fā)揮SLs的生理活性，同時(shí)促進(jìn)D53被26S降解，抑制植物的分枝[11]。另外，研究人員從水稻中克隆得到了參與到獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的3個(gè)D14基因，包括DWARF2、D88和HTD2，發(fā)現(xiàn)這些基因都參與控制水稻的分蘗[11];在擬南芥中，研究發(fā)現(xiàn)CLIM與受體AtD14的催化中心以共價(jià)鍵結(jié)合，進(jìn)而激活SLs的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，揭示了“底物-酶-活性分子-受體”的新機(jī)制[12-15]。矮牽牛中克隆得到D14的同源基因DAD2，在酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中，在GR24存在的條件下，可以與PhMAX2A相互作用啟動(dòng)SCF介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，而且其構(gòu)象發(fā)生變化;同時(shí)，DAD2可以水解GR24，但水解產(chǎn)物不能促進(jìn)蛋白間的相互作用，對(duì)植物的分枝不起調(diào)控作用，暗示DAD2在獨(dú)腳金內(nèi)酯通路中可能不起水解酶的作用[16]。除此之外，D14基因還參與了植物的其他應(yīng)激反應(yīng)。有文獻(xiàn)報(bào)道，水稻OsD14基因在正常條件下是被抑制表達(dá)從而促進(jìn)其分蘗，但是受到寒冷脅迫后，OsMADS57與OsWRKY94結(jié)合并激活OsD14的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)OsD14基因的表達(dá)而抑制其分蘗[17]。

青天葵每株僅一個(gè)塊莖及一片葉子，產(chǎn)量極低，具分枝的青天葵植株極為罕見。開展青天葵中獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中D14基因的相關(guān)研究，有助于了解獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在青天葵中對(duì)側(cè)枝生長(zhǎng)發(fā)育的影響，可為今后深入研究NfD14的蛋白結(jié)構(gòu)與功能等奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 植物材料? 本研究所用植物材料青天葵為廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院中藥資源研究所黃云峰老師采集并鑒定，確認(rèn)其為蘭科植物毛唇芋蘭[Nervilia fordii （ Hance） Schltr.]，于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心實(shí)驗(yàn)室培育。煙草NC89種子為華南植物園潘麗珠老師饋贈(zèng)，采用土培直播法培育2個(gè)月后采集葉片用于亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)。

1.1.2? 菌株與質(zhì)粒? 大腸桿菌（Escherichia coli）菌株E. coli Top10感受態(tài)細(xì)胞和pLB Vector均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。農(nóng)桿菌菌株EHA105感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自廣州市春泥生物科技有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 青天葵NfD14基因的篩選? 從NCBI下載得到水稻和擬南芥的D14同源基因堿基序列，與課題組前期建立的青天葵轉(zhuǎn)錄組注釋的Unigenes數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，篩選得到高度同源的Unigenes-NfD14片段。

1.2.2? 葉片總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成? 參照梁凌玲等[18]優(yōu)化的RNA提取方法（改良RNAiso Plus法）提取青天葵葉片總RNA，用微量分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。參照PrimeScript RT reagent Kit（TaKaRa）說(shuō)明書合成cDNA第一鏈，利用18S rRNA驗(yàn)證cDNA的完整性。

1.2.3? 青天葵NfD14基因核心片段的克隆? 以Unigenes-NfD14基因?yàn)槟０澹肞rimer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物a-F和a-R、b-F和b-R（見表1）。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為10 μL：2×PCR Buffer for KOD FX（TOYOBO公司）5 μL，dNTPs（2 mmol/L） 2.5 μL，上游引物和下游引物（10 μmol/L）各0.25 μL，模板cDNA 0.25 μL，KOD FX（200 μL）0.25 μL，ddH2O 1. 5 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性180 s;然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)反應(yīng)，循環(huán)反應(yīng)為94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s;最后72 ℃再延伸300 s，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確認(rèn)目的片段后，按比例擴(kuò)大體積至50 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用通用型DNA純化回收試劑盒（天根）回收目的片段。參照pLB零背景克隆試劑盒（天根）說(shuō)明書，將目的片段連接到pLB Vector并轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證和DNA測(cè)序。DNA測(cè)序由廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司完成。

1.2.4? 5?與3?端序列RACE克隆? 以Unige nes NfD14序列為模板，分別設(shè)計(jì)5?端和3?端特異性巢式PCR引物，5?端特異性巢式引物5?a-1F和5?a-2F、5?b-1F和5?b-2F，3?端特異性巢式引物3?a-1F和3?a-2F、3?b-1F和3?b-2F（表1）。按照Ta K aRa公司的SMARTer RACE 5?/3?Kit User Manual說(shuō)明書擴(kuò)增得到5?-RACE和3?-RACE的cDNA第一鏈。分別以5?-RACE和3?-RACE的cDNA第一鏈為模板，擴(kuò)增D14基因的5?端和3?端序列。PCR反應(yīng)體系和條件參見1.2.3節(jié)，退火溫度為55 ℃。將目的片段進(jìn)行回收、連接、轉(zhuǎn)化和鑒定后，挑取陽(yáng)性菌株送廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5? NfD14基因的開放閱讀框的擴(kuò)增? 用DNAMAN軟件拼接NfD14基因的cDNA全長(zhǎng)序列，再用SnapGene軟件預(yù)測(cè)其開放閱讀框（ORF），設(shè)計(jì)特異性引物aORF-F和aORF-R、bORF-F和bORF-R（表1），以cDNA為模板，擴(kuò)增NfD14基因的編碼區(qū)序列。PCR反應(yīng)體系和條件參見1.2.3節(jié)，退火溫度為60 ℃。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收、菌液PCR驗(yàn)證和測(cè)序參見1.2.3節(jié)。編碼區(qū)序列測(cè)序結(jié)果與拼接全長(zhǎng)序列進(jìn)行比對(duì)，糾正拼接序列個(gè)別錯(cuò)誤堿基，獲得NfD14基因的編碼區(qū)序列。

1.3? NfD14基因的生物信息學(xué)分析

采用ProtParam（http：//web.expasy.org/protpar am/）在線工具計(jì)算目的基因所編碼蛋白的分子量、等電點(diǎn)、總平均疏水指數(shù)（GRAVY）、脂肪系數(shù)（AI）、穩(wěn)定性系數(shù)等理化性質(zhì)。用Phyre2 （http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。采用WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）對(duì)編碼蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。用SignalP 4.1 Server在線軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。利用NCBI的BLASTP和Smart BLAST對(duì)氨基酸序列進(jìn)行同源檢索和功能域在線預(yù)測(cè)，并用DNAMAN進(jìn)行多重序列比對(duì)，再用MEGA 5.10構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4? 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及亞細(xì)胞定位

根據(jù)諾唯贊ClonExpressⅡ One Step Cloning Kit說(shuō)明書構(gòu)建植物表達(dá)載體，以含有NfD14a和NfD14b的完整編碼區(qū)序列質(zhì)粒，以及由陳秀珍等[19]構(gòu)建含有EGFP片段的pRI101-EGFP質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)特異性引物pa-F和pa-R、pb-F和pb-R、EGFP-F和EGFP-R（表1）擴(kuò)增NfD14a和NfD14b的完整編碼區(qū)序列，以及EGFP片段。PCR反應(yīng)體系和條件參見1.2.3節(jié)，退火溫度為60 ℃。然后參照試劑盒說(shuō)明書，將獲得的目的片段與用SalⅠ和EcoRⅠ酶切后的pRI101-AN DNA質(zhì)粒（TaKaRa公司）片段連接轉(zhuǎn)化后，獲得35S：：NfD 14a-EGFP、35S：：NfD14b-EGFP和35S：：EGFP質(zhì)粒。利用凍融法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌EHA105中，用載體通用引物35S和RV（表1）進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證為陽(yáng)性菌株后，用注射法將其導(dǎo)入煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)[20]。提取煙草葉片原生質(zhì)體后，使用LSM800型激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)Zeiss）觀察攜帶綠色熒光蛋白標(biāo)記的目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況及其亞細(xì)胞定位特征。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 青天葵NfD14基因的篩選

通過(guò)與水稻（Oryza sativa）和擬南芥（Arabido psis thaliana）的OsD14/AtD14比對(duì)，從青天葵的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到2條高度同源的Unigenes- NfD14，命名為NfD14a和NfD14b。

2.2? 葉片總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成

用改良RNAiso Plus法提取青天葵葉片總RNA，微量分光光度計(jì)檢測(cè)顯示L1、L2、L3和L4總RNA樣品的OD260/OD280均在1.9～2.0，OD260/OD230均在1.7～1.9范圍，說(shuō)明RNA的純度高，未被污染。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，28S rRNA和18S rRNA條帶明亮清晰（圖1），可見所獲得的青天葵葉片總RNA完整性較好，可用于RT-PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。以反轉(zhuǎn)錄后獲得的cDNA為模板，18S-F和18S-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約500 bp的清晰明亮條帶（圖1），說(shuō)明cDNA的質(zhì)量較好，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3? 青天葵NfD14基因的克隆

通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增得到752 bp的NfD14a核心片段，RACE擴(kuò)增獲得857 bp的5?端序列和964 bp的3?端序列（圖2）。另外，獲得365 bp的NfD14b核心片段，RACE擴(kuò)增獲得422 bp的5?端序列和1029 bp的3?端序列。將核心片段、3?端序列和5?端序列進(jìn)行拼接，分別得到NfD14a和NfD14b的cDNA全長(zhǎng)序列為1206 bp、1082 bp（圖2）。采用SnapGene軟件分析2條基因的全長(zhǎng)序列，分別獲得其開放閱讀框（ORF）、3?非編碼區(qū)（3?UTR）、5?非編碼區(qū)（5?UTR）（表2）。將NfD14a和NfD14b的基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)分別為MH028026、MH028027。

2.4? 青天葵NfD14的生物信息學(xué)分析

2.4.1? NfD14蛋白的基本理化性質(zhì)? ProtParam在線軟件分析結(jié)果表明，NfD14a蛋白的分子量為31.16 ku，等電點(diǎn)為6.19，原子總數(shù)為4397，穩(wěn)定性系數(shù)為39.81，屬于穩(wěn)定蛋白（穩(wěn)定系數(shù)<40為穩(wěn)定蛋白，>40為不穩(wěn)定蛋白），脂肪系數(shù)（AI）

為104.97，總平均親水性（GRAVY）為0.181，說(shuō)明NfD14a屬于疏水蛋白。NfD14b蛋白的分子量大小為30.02 ku，等電點(diǎn)為4.94，原子總數(shù)為4226，穩(wěn)定性系數(shù)為38.89，屬于穩(wěn)定蛋白，AI為106.78，GRAVY為0.215，表明NfD14b屬于疏水蛋白。

2.4.2? NfD14蛋白的保守功能域、三級(jí)結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位和信號(hào)肽預(yù)測(cè)? 將NfD14a和NfD14b蛋白提交到NCBI，用BLASTP在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行蛋白保守功能域分析，結(jié)果表明，NfD14a蛋白在第29個(gè)到第286個(gè)氨基酸序列、NfD14b蛋白在第11個(gè)到第265個(gè)氨基酸之間的序列均包含水解酶超家族（Abhydrolase superfamily）的保守功能域（圖3A，圖3B）;再進(jìn)行Smart BLAST，結(jié)果顯示NfD14a和NfD14b均與水解酶相似性高。使用Phyre2在線軟件預(yù)測(cè)NfD14蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，NfD14a的PDB頭部為水解酶，屬于A鏈，與dad2 s96a突變體的晶體結(jié)構(gòu)相似度達(dá)91%;NfD14b的PDB頭部也是水解酶，屬于A鏈，α/β折疊蛋白質(zhì)家族，與擬南芥D14蛋白的晶體結(jié)構(gòu)相似度達(dá)99%（圖3C，圖3D）。利用WoLF PSORT在線軟件對(duì)NfD14蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)可知，NfD14a蛋白定位的分布大小依次為葉綠體>細(xì)胞核=液泡>細(xì)胞質(zhì)，而NfD14b蛋白定位的分布大小依次為細(xì)胞質(zhì)>細(xì)胞核>葉綠體=類囊體。根據(jù)SignalP 4.1 Server在線軟件預(yù)測(cè)可知，NfD14a和NfD14b蛋白的信號(hào)肽平均值分別為0.101、0.108，均小于0.500，因此推測(cè)NfD14a和NfD14b蛋白無(wú)信號(hào)肽及切割位點(diǎn)，屬于非分泌蛋白，在細(xì)胞質(zhì)中合成后不能被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外（圖3E，圖3F）。

2.4.3? NfD14蛋白的進(jìn)化樹分析? 從NCBI上篩選出與NfD14氨基酸序列相似度較高的其他物種的D14蛋白序列，并將其與青天葵NfD14基因預(yù)測(cè)的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)。結(jié)果顯示，NfD14蛋白氨基酸序列與其他物種的D14氨基酸序列有較高的保守性（圖4）。使用MEGA 5.10構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，NfD14b為單獨(dú)一個(gè)分支;而NfD14a與鐵皮石斛聚為一支，表明其與鐵皮石斛的D14氨基酸序列同源性較高，其次與水稻和甘蔗的親緣關(guān)系較近，說(shuō)明同為單子葉植物的D14基因的親緣性較高（圖5）。但是NfD14a和NfD14b與深圳擬蘭D14的同源性不高，可見青天葵與同為蘭科植物的鐵皮石斛的親緣關(guān)系近，而與深圳擬蘭的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.5? 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及亞細(xì)胞定位

為了研究NfD14的功能，用一步快速克隆的方法成功將NfD14的ORF序列與EGFP共同構(gòu)建到植物表達(dá)載體pRI101-AN DNA中，獲得了

水稻OsD14，登錄號(hào)：Q10QA5.1;菊花DgD14，登錄號(hào)：AJD87462.1;擬南芥AtD14，登錄號(hào)：Q9SQR3.1;大豆GmD14，登錄號(hào)AQY54418.1;鐵皮石斛DcD14，登錄號(hào)：PKU86591.1;深圳擬蘭AsD14，登錄號(hào)：PKA57698.1;煙草NtD14，登錄號(hào)：OIT40479.1;草原水綿SpD14，登錄號(hào)：AFI78791.1;軟克里藻KfD14，登錄號(hào)：AFI78790.1;甘蔗ScHTD2，登錄號(hào)：AJY78078.1;矮牽牛PhDAD2，登錄號(hào)：AFR68698.1;豌豆PsRMS3，登錄號(hào)：AMB61030.1。

35S：：NfD14a-EGFP，35S：：NfD14b-EGFP質(zhì)粒。測(cè)序結(jié)果正確無(wú)誤后，用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA 105，分別獲得其工程菌（以轉(zhuǎn)入空載35S：：EGFP的農(nóng)桿菌作為對(duì)照），菌液PCR結(jié)果顯示分別擴(kuò)增獲得2107 bp和2059 bp的片段產(chǎn)物，說(shuō)明含有NfD14a-EGFP和NfD14a-EGFP基因片段的載體質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入到了農(nóng)桿菌EHA105。將獲得的工程菌培養(yǎng)后進(jìn)行煙草葉片下表皮注射并培養(yǎng)4～6 d，提取煙草葉片原生質(zhì)體觀察蛋白的定位情況。結(jié)果顯示，在瞬時(shí)表達(dá)35S：：NfD14a-EGFP，35S：： NfD14b-EGFP的原生質(zhì)體的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均觀察到綠色熒光，說(shuō)明NfD14定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。

3? 討論

獨(dú)腳金內(nèi)酯（SLs）作為一種新型植物激素而成為了人們的研究熱點(diǎn)。雖然獨(dú)腳金內(nèi)酯的生物合成途徑、生理學(xué)功能、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定等已逐漸被了解，但是有關(guān)SLs的生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑仍有待進(jìn)一步闡明。本研究著重探討青天葵中獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵基因NfD14，利用RT-PCR和RACE技術(shù)，獲得NfD14a和NfD14b基因的cDNA全長(zhǎng)序列。經(jīng)生物信息學(xué)分析，獲得了NfD14a和NfD14b的基本理化信息。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)NfD14a和NfD14b并未在進(jìn)化樹上聚為一支，提示這兩條基因的功能上可能有差異，還需進(jìn)一步研究。其中NfD14a與水稻、甘蔗的親緣關(guān)系較近，可能具有OsD14和ScHTD2參與獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的類似功能，后續(xù)將進(jìn)行擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，將對(duì)該推斷進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。另外，在線軟件預(yù)測(cè)NfD14a主要定位于葉綠體而NfD14b主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，提示NfD14可能參與調(diào)控植物的光合作用[21]，NfD14a與王閔霞等[22]對(duì)水稻Dwarf 14（D14）的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果一致，同樣是定位于葉綠體中，但是亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示NfD14a和NfD14b均定位于煙草葉片原生質(zhì)體的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，與水稻和擬南芥的D14基因的定位結(jié)果一致[13-14]，表明青天葵、水稻和擬南芥的D14基因細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的表達(dá)情況相似。2個(gè)NfD14基因在青天葵中的發(fā)育或應(yīng)激反應(yīng)中是否具有不同的作用有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。本研究為進(jìn)一步鑒定NfD14基因的功能提供依據(jù)，為青天葵中獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控植物分枝生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

南京中醫(yī)藥大學(xué). 中藥大辭典： 上冊(cè)[M]. 上海： 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社， 2006： 1731.

邱? 莉， 徐靈源， 繆建華， 等. 青天葵植物化學(xué)成分和藥理活性研究進(jìn)展[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥， 2011， 22（9）： 2258-2260.

蔡? 樂. 青天葵藥材生化成分及藥理活性研究進(jìn)展[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2014， 16（8）： 244-246.

李林軒， 唐美瓊， 韋坤華， 等. 青天葵組織培養(yǎng)條件優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014， 42（7）： 66-68.

[5] 黃瓊林. 青天葵轉(zhuǎn)錄組特征研究[D] 廣州： 廣州中醫(yī)藥大學(xué)， 2013.

[6] 杜? 勤， 龔雪梅， 程鳳麗. 不同包埋基質(zhì)對(duì)青天葵人工種子萌發(fā)率的影響[J]. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2013， 30（6）： 901-904， 944.

[7] Gomez-Roldan V， Fermas S， Brewer P B， et al. Strigolactone inhibition of shoot branching[J]. Nature， 2008， 455（7210）： 189-194.

[8] Umehara M， Hanada A， Yoshida S， et al. Inhibition of shoot branching by new terpenoid plant hormones[J]. Nature， 2008， 455（7210）： 195-200.

[9] Alder A， Jamil M， Marzorati M， et al. The path from beta-carotene to carlactone， a strigolactone-like plant hormone[J]. Science， 2012， 335（6074）： 1348-1351.

[10] Zhou F， Lin Q， Zhu L， et al. Corrigendum： D14-SCF（D3）- dependent degradation of D53 regulates strigolactone signalling[J]. Nature， 2016， 532（7599）： 402.

Zhou F， Lin Q， Zhu L， et al. D14-SCF（D3）-dependent degradation of D53 regulates strigolactone signalling[J]. Nature， 2013， 504（7480）： 406-410.

常金科， 黎? 家. 獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)感知揭示配體-受體作用新機(jī)制[J]. 植物學(xué)報(bào)， 2017， 52（2）： 123-127.

Chevalier F， Nieminen K， Sanchez-ferrero J C， et al. Strigolactone promotes degradation of DWARF14， an alpha/beta hydrolase essential for strigolactone signaling in Arabidopsis[J]. Plant Cell， 2014， 26（3）： 1134-1150.

Yao R， Ming Z， Yan L， et al. DWARF14 is a non-canonical hormone receptor for strigolactone[J]. Nature， 2016， 536（7617）： 469-473.

Waters M T， Nelson D C， Scaffidi A， et al. Specialisation within the DWARF14 protein family confers distinct responses to karrikins and strigolactones in Arabidopsis[J]. Development， 2012， 139（7）： 1285-1295.

Hamiaux C， Drummond R S， Janssen B J， et al. DAD2 is an alpha/beta hydrolase likely to be involved in the perception of the plant branching hormone， strigolactone[J]. Current Biology， 2012， 22（21）： 2032-2036.

Chen L， Zhao Y， Xu S， et al. OsMADS57 together with OsTB1 coordinates transcription of its target OsWRKY94 and D14 to switch its organogenesis to defense for cold adaptation in rice[J]. New Phytologist， 2018， 218（1）： 219-231.

梁凌玲， 鄧宇星， 黃瓊林， 等. 青天葵葉片總RNA提取方法的比較研究[J]. 北方園藝， 2013（2）： 91-94.

陳秀珍. 兩種芋蘭分枝發(fā)育相關(guān)基因LS及其調(diào)控區(qū)的克隆與表達(dá)分析[D]. 廣州： 廣州中醫(yī)藥大學(xué)， 2016.

李曉君， 王紹梅， 謝艷蘭， 等. 農(nóng)桿菌滲透法轉(zhuǎn)化煙草條件的優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014， 42（9）： 45-47.

許曉明， 戴新賓， 陸? 巍， 等. 細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)基因與光合作用的關(guān)系[J]. 生物學(xué)通報(bào)， 1999（10）： 5-6.

王閔霞， 白玉路， 王? 平， 等. 水稻Dwarf 14 （D14） 基因的生物信息學(xué)分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2014， 27（4）： 1347-1352.