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        青天葵獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵基因D14的克隆與亞細(xì)胞定位分析

        2019-06-11 09:40:02李炎坤卓一南曾湘達(dá)何瑞
        熱帶作物學(xué)報(bào) 2019年3期

        李炎坤 卓一南 曾湘達(dá) 何瑞

        摘? 要? D14基因是獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵基因,其編碼的蛋白能夠使SLs釋放出活性小分子物質(zhì)而發(fā)揮調(diào)節(jié)腋芽起始的功能。本研究根據(jù)其他物種的D14基因從青天葵轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選獲得2條高度同源的片段,命名為NfD14a和NfD14b。應(yīng)用RT-PCR和RACE技術(shù),克隆獲得NfD14a和NfD14b的cDNA全長(zhǎng)序列,GenBank登錄號(hào)分別為MH028026、MH028027。NfD14a基因全長(zhǎng)1206 bp,ORF為861 bp,編碼286個(gè)氨基酸;NfD14b基因全長(zhǎng)1082 bp,ORF為813 bp,編碼270個(gè)氨基酸。對(duì)NfD14的編碼蛋白序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,結(jié)果表明:NfD14a和NfD14b均屬于a/b折疊蛋白水解酶超家族成員(Abhydrolase superfamily),但系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明兩者同源性不高。利用一步快速克隆的方法構(gòu)建了植物表達(dá)載體35S::NfD14a-EGFP和35S::NfD14b-EGFP,并分別獲得其工程菌。瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果表明,NfD14a和NfD14b均定位在煙草原生質(zhì)體的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。本研究通過(guò)對(duì)NfD14基因全長(zhǎng)cDNA序列的克隆與亞細(xì)胞定位分析,為青天葵獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控植物分枝生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

        關(guān)鍵詞? 青天葵;獨(dú)腳金內(nèi)酯;D14;RACE克隆中圖分類號(hào)? S567? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

        嶺南藥材青天葵來(lái)源于蘭科植物毛唇芋蘭[Nervilia fordii (Hance) Schltr.]的干燥葉或全草,主要分布于兩廣、海南、四川、云南等地區(qū)。青天葵具有清熱潤(rùn)肺、解毒消腫的功效,主治肺癆咳血、肺熱咳嗽、口瘡、喉嚨腫痛等[1]呼吸道疾病,代表性中成藥有天龍咳喘靈膠囊、天龍茶、天龍喘咳靈等[2-3],具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而青天葵自身繁殖能力低,臨床需求量大,過(guò)度采挖造成青天葵野生資源嚴(yán)重枯竭。雖然研究人員已經(jīng)對(duì)青天葵展開了多方面的研究[4-6],但對(duì)于解決青天葵藥用資源短缺的問題收效甚微。

        近年來(lái),研究人員從植物的多分枝突變體中發(fā)現(xiàn)了一類新型植物激素——獨(dú)腳金內(nèi)酯(Stri golactones,SLs),具有抑制植物分枝生長(zhǎng)、控制中胚軸伸長(zhǎng)、促進(jìn)側(cè)根形成和誘導(dǎo)根毛伸長(zhǎng)的作用[7-8]。目前已經(jīng)被證實(shí)參與獨(dú)腳金內(nèi)酯的合成和運(yùn)輸途徑的關(guān)鍵基因有D27、CCD7、CCD8、MAX1、D3、D53和D14等[9-10]。其中D14基因是獨(dú)腳金內(nèi)酯運(yùn)輸途徑中的關(guān)鍵基因,能夠與D3蛋白形成SCF蛋白復(fù)合體,與SLs結(jié)合釋放出活性小分子物質(zhì)CLIM(covalently linked inter mediate mole cule),從而發(fā)揮SLs的生理活性,同時(shí)促進(jìn)D53被26S降解,抑制植物的分枝[11]。另外,研究人員從水稻中克隆得到了參與到獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的3個(gè)D14基因,包括DWARF2、D88和HTD2,發(fā)現(xiàn)這些基因都參與控制水稻的分蘗[11];在擬南芥中,研究發(fā)現(xiàn)CLIM與受體AtD14的催化中心以共價(jià)鍵結(jié)合,進(jìn)而激活SLs的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),揭示了“底物-酶-活性分子-受體”的新機(jī)制[12-15]。矮牽牛中克隆得到D14的同源基因DAD2,在酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中,在GR24存在的條件下,可以與PhMAX2A相互作用啟動(dòng)SCF介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑,而且其構(gòu)象發(fā)生變化;同時(shí),DAD2可以水解GR24,但水解產(chǎn)物不能促進(jìn)蛋白間的相互作用,對(duì)植物的分枝不起調(diào)控作用,暗示DAD2在獨(dú)腳金內(nèi)酯通路中可能不起水解酶的作用[16]。除此之外,D14基因還參與了植物的其他應(yīng)激反應(yīng)。有文獻(xiàn)報(bào)道,水稻OsD14基因在正常條件下是被抑制表達(dá)從而促進(jìn)其分蘗,但是受到寒冷脅迫后,OsMADS57與OsWRKY94結(jié)合并激活OsD14的轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)OsD14基因的表達(dá)而抑制其分蘗[17]。

        青天葵每株僅一個(gè)塊莖及一片葉子,產(chǎn)量極低,具分枝的青天葵植株極為罕見。開展青天葵中獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中D14基因的相關(guān)研究,有助于了解獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在青天葵中對(duì)側(cè)枝生長(zhǎng)發(fā)育的影響,可為今后深入研究NfD14的蛋白結(jié)構(gòu)與功能等奠定基礎(chǔ)。

        1? 材料與方法

        1.1? 材料

        1.1.1? 植物材料? 本研究所用植物材料青天葵為廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院中藥資源研究所黃云峰老師采集并鑒定,確認(rèn)其為蘭科植物毛唇芋蘭[Nervilia fordii ( Hance) Schltr.],于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心實(shí)驗(yàn)室培育。煙草NC89種子為華南植物園潘麗珠老師饋贈(zèng),采用土培直播法培育2個(gè)月后采集葉片用于亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)。

        1.1.2? 菌株與質(zhì)粒? 大腸桿菌(Escherichia coli)菌株E. coli Top10感受態(tài)細(xì)胞和pLB Vector均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。農(nóng)桿菌菌株EHA105感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自廣州市春泥生物科技有限公司。

        1.2? 方法

        1.2.1? 青天葵NfD14基因的篩選? 從NCBI下載得到水稻和擬南芥的D14同源基因堿基序列,與課題組前期建立的青天葵轉(zhuǎn)錄組注釋的Unigenes數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),篩選得到高度同源的Unigenes-NfD14片段。

        1.2.2? 葉片總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成? 參照梁凌玲等[18]優(yōu)化的RNA提取方法(改良RNAiso Plus法)提取青天葵葉片總RNA,用微量分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度,并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性,于-80 ℃保存?zhèn)溆?。參照PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa)說(shuō)明書合成cDNA第一鏈,利用18S rRNA驗(yàn)證cDNA的完整性。

        1.2.3? 青天葵NfD14基因核心片段的克隆? 以Unigenes-NfD14基因?yàn)槟0澹肞rimer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物a-F和a-R、b-F和b-R(見表1)。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為10 μL:2×PCR Buffer for KOD FX(TOYOBO公司)5 μL,dNTPs(2 mmol/L) 2.5 μL,上游引物和下游引物(10 μmol/L)各0.25 μL,模板cDNA 0.25 μL,KOD FX(200 μL)0.25 μL,ddH2O 1. 5 μL。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性180 s;然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)反應(yīng),循環(huán)反應(yīng)為94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s;最后72 ℃再延伸300 s,4 ℃保存。PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),確認(rèn)目的片段后,按比例擴(kuò)大體積至50 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增,用通用型DNA純化回收試劑盒(天根)回收目的片段。參照pLB零背景克隆試劑盒(天根)說(shuō)明書,將目的片段連接到pLB Vector并轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞,進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證和DNA測(cè)序。DNA測(cè)序由廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司完成。

        1.2.4? 5?與3?端序列RACE克隆? 以Unige nes NfD14序列為模板,分別設(shè)計(jì)5?端和3?端特異性巢式PCR引物,5?端特異性巢式引物5?a-1F和5?a-2F、5?b-1F和5?b-2F,3?端特異性巢式引物3?a-1F和3?a-2F、3?b-1F和3?b-2F(表1)。按照Ta K aRa公司的SMARTer RACE 5?/3?Kit User Manual說(shuō)明書擴(kuò)增得到5?-RACE和3?-RACE的cDNA第一鏈。分別以5?-RACE和3?-RACE的cDNA第一鏈為模板,擴(kuò)增D14基因的5?端和3?端序列。PCR反應(yīng)體系和條件參見1.2.3節(jié),退火溫度為55 ℃。將目的片段進(jìn)行回收、連接、轉(zhuǎn)化和鑒定后,挑取陽(yáng)性菌株送廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

        1.2.5? NfD14基因的開放閱讀框的擴(kuò)增? 用DNAMAN軟件拼接NfD14基因的cDNA全長(zhǎng)序列,再用SnapGene軟件預(yù)測(cè)其開放閱讀框(ORF),設(shè)計(jì)特異性引物aORF-F和aORF-R、bORF-F和bORF-R(表1),以cDNA為模板,擴(kuò)增NfD14基因的編碼區(qū)序列。PCR反應(yīng)體系和條件參見1.2.3節(jié),退火溫度為60 ℃。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收、菌液PCR驗(yàn)證和測(cè)序參見1.2.3節(jié)。編碼區(qū)序列測(cè)序結(jié)果與拼接全長(zhǎng)序列進(jìn)行比對(duì),糾正拼接序列個(gè)別錯(cuò)誤堿基,獲得NfD14基因的編碼區(qū)序列。

        1.3? NfD14基因的生物信息學(xué)分析

        采用ProtParam(http://web.expasy.org/protpar am/)在線工具計(jì)算目的基因所編碼蛋白的分子量、等電點(diǎn)、總平均疏水指數(shù)(GRAVY)、脂肪系數(shù)(AI)、穩(wěn)定性系數(shù)等理化性質(zhì)。用Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。采用WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)對(duì)編碼蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。用SignalP 4.1 Server在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。利用NCBI的BLASTP和Smart BLAST對(duì)氨基酸序列進(jìn)行同源檢索和功能域在線預(yù)測(cè),并用DNAMAN進(jìn)行多重序列比對(duì),再用MEGA 5.10構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

        1.4? 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及亞細(xì)胞定位

        根據(jù)諾唯贊ClonExpressⅡ One Step Cloning Kit說(shuō)明書構(gòu)建植物表達(dá)載體,以含有NfD14a和NfD14b的完整編碼區(qū)序列質(zhì)粒,以及由陳秀珍等[19]構(gòu)建含有EGFP片段的pRI101-EGFP質(zhì)粒為模板,設(shè)計(jì)特異性引物pa-F和pa-R、pb-F和pb-R、EGFP-F和EGFP-R(表1)擴(kuò)增NfD14a和NfD14b的完整編碼區(qū)序列,以及EGFP片段。PCR反應(yīng)體系和條件參見1.2.3節(jié),退火溫度為60 ℃。然后參照試劑盒說(shuō)明書,將獲得的目的片段與用SalⅠ和EcoRⅠ酶切后的pRI101-AN DNA質(zhì)粒(TaKaRa公司)片段連接轉(zhuǎn)化后,獲得35S::NfD 14a-EGFP、35S::NfD14b-EGFP和35S::EGFP質(zhì)粒。利用凍融法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌EHA105中,用載體通用引物35S和RV(表1)進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證為陽(yáng)性菌株后,用注射法將其導(dǎo)入煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)[20]。提取煙草葉片原生質(zhì)體后,使用LSM800型激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Zeiss)觀察攜帶綠色熒光蛋白標(biāo)記的目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況及其亞細(xì)胞定位特征。

        2? 結(jié)果與分析

        2.1? 青天葵NfD14基因的篩選

        通過(guò)與水稻(Oryza sativa)和擬南芥(Arabido psis thaliana)的OsD14/AtD14比對(duì),從青天葵的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到2條高度同源的Unigenes- NfD14,命名為NfD14a和NfD14b。

        2.2? 葉片總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成

        用改良RNAiso Plus法提取青天葵葉片總RNA,微量分光光度計(jì)檢測(cè)顯示L1、L2、L3和L4總RNA樣品的OD260/OD280均在1.9~2.0,OD260/OD230均在1.7~1.9范圍,說(shuō)明RNA的純度高,未被污染。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,28S rRNA和18S rRNA條帶明亮清晰(圖1),可見所獲得的青天葵葉片總RNA完整性較好,可用于RT-PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。以反轉(zhuǎn)錄后獲得的cDNA為模板,18S-F和18S-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到約500 bp的清晰明亮條帶(圖1),說(shuō)明cDNA的質(zhì)量較好,可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

        2.3? 青天葵NfD14基因的克隆

        通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增得到752 bp的NfD14a核心片段,RACE擴(kuò)增獲得857 bp的5?端序列和964 bp的3?端序列(圖2)。另外,獲得365 bp的NfD14b核心片段,RACE擴(kuò)增獲得422 bp的5?端序列和1029 bp的3?端序列。將核心片段、3?端序列和5?端序列進(jìn)行拼接,分別得到NfD14a和NfD14b的cDNA全長(zhǎng)序列為1206 bp、1082 bp(圖2)。采用SnapGene軟件分析2條基因的全長(zhǎng)序列,分別獲得其開放閱讀框(ORF)、3?非編碼區(qū)(3?UTR)、5?非編碼區(qū)(5?UTR)(表2)。將NfD14a和NfD14b的基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),登錄號(hào)分別為MH028026、MH028027。

        2.4? 青天葵NfD14的生物信息學(xué)分析

        2.4.1? NfD14蛋白的基本理化性質(zhì)? ProtParam在線軟件分析結(jié)果表明,NfD14a蛋白的分子量為31.16 ku,等電點(diǎn)為6.19,原子總數(shù)為4397,穩(wěn)定性系數(shù)為39.81,屬于穩(wěn)定蛋白(穩(wěn)定系數(shù)<40為穩(wěn)定蛋白,>40為不穩(wěn)定蛋白),脂肪系數(shù)(AI)

        為104.97,總平均親水性(GRAVY)為0.181,說(shuō)明NfD14a屬于疏水蛋白。NfD14b蛋白的分子量大小為30.02 ku,等電點(diǎn)為4.94,原子總數(shù)為4226,穩(wěn)定性系數(shù)為38.89,屬于穩(wěn)定蛋白,AI為106.78,GRAVY為0.215,表明NfD14b屬于疏水蛋白。

        2.4.2? NfD14蛋白的保守功能域、三級(jí)結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位和信號(hào)肽預(yù)測(cè)? 將NfD14a和NfD14b蛋白提交到NCBI,用BLASTP在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行蛋白保守功能域分析,結(jié)果表明,NfD14a蛋白在第29個(gè)到第286個(gè)氨基酸序列、NfD14b蛋白在第11個(gè)到第265個(gè)氨基酸之間的序列均包含水解酶超家族(Abhydrolase superfamily)的保守功能域(圖3A,圖3B);再進(jìn)行Smart BLAST,結(jié)果顯示NfD14a和NfD14b均與水解酶相似性高。使用Phyre2在線軟件預(yù)測(cè)NfD14蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu),結(jié)果表明,NfD14a的PDB頭部為水解酶,屬于A鏈,與dad2 s96a突變體的晶體結(jié)構(gòu)相似度達(dá)91%;NfD14b的PDB頭部也是水解酶,屬于A鏈,α/β折疊蛋白質(zhì)家族,與擬南芥D14蛋白的晶體結(jié)構(gòu)相似度達(dá)99%(圖3C,圖3D)。利用WoLF PSORT在線軟件對(duì)NfD14蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)可知,NfD14a蛋白定位的分布大小依次為葉綠體>細(xì)胞核=液泡>細(xì)胞質(zhì),而NfD14b蛋白定位的分布大小依次為細(xì)胞質(zhì)>細(xì)胞核>葉綠體=類囊體。根據(jù)SignalP 4.1 Server在線軟件預(yù)測(cè)可知,NfD14a和NfD14b蛋白的信號(hào)肽平均值分別為0.101、0.108,均小于0.500,因此推測(cè)NfD14a和NfD14b蛋白無(wú)信號(hào)肽及切割位點(diǎn),屬于非分泌蛋白,在細(xì)胞質(zhì)中合成后不能被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外(圖3E,圖3F)。

        2.4.3? NfD14蛋白的進(jìn)化樹分析? 從NCBI上篩選出與NfD14氨基酸序列相似度較高的其他物種的D14蛋白序列,并將其與青天葵NfD14基因預(yù)測(cè)的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)。結(jié)果顯示,NfD14蛋白氨基酸序列與其他物種的D14氨基酸序列有較高的保守性(圖4)。使用MEGA 5.10構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示,NfD14b為單獨(dú)一個(gè)分支;而NfD14a與鐵皮石斛聚為一支,表明其與鐵皮石斛的D14氨基酸序列同源性較高,其次與水稻和甘蔗的親緣關(guān)系較近,說(shuō)明同為單子葉植物的D14基因的親緣性較高(圖5)。但是NfD14a和NfD14b與深圳擬蘭D14的同源性不高,可見青天葵與同為蘭科植物的鐵皮石斛的親緣關(guān)系近,而與深圳擬蘭的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

        2.5? 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及亞細(xì)胞定位

        為了研究NfD14的功能,用一步快速克隆的方法成功將NfD14的ORF序列與EGFP共同構(gòu)建到植物表達(dá)載體pRI101-AN DNA中,獲得了

        水稻OsD14,登錄號(hào):Q10QA5.1;菊花DgD14,登錄號(hào):AJD87462.1;擬南芥AtD14,登錄號(hào):Q9SQR3.1;大豆GmD14,登錄號(hào)AQY54418.1;鐵皮石斛DcD14,登錄號(hào):PKU86591.1;深圳擬蘭AsD14,登錄號(hào):PKA57698.1;煙草NtD14,登錄號(hào):OIT40479.1;草原水綿SpD14,登錄號(hào):AFI78791.1;軟克里藻KfD14,登錄號(hào):AFI78790.1;甘蔗ScHTD2,登錄號(hào):AJY78078.1;矮牽牛PhDAD2,登錄號(hào):AFR68698.1;豌豆PsRMS3,登錄號(hào):AMB61030.1。

        35S::NfD14a-EGFP,35S::NfD14b-EGFP質(zhì)粒。測(cè)序結(jié)果正確無(wú)誤后,用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA 105,分別獲得其工程菌(以轉(zhuǎn)入空載35S::EGFP的農(nóng)桿菌作為對(duì)照),菌液PCR結(jié)果顯示分別擴(kuò)增獲得2107 bp和2059 bp的片段產(chǎn)物,說(shuō)明含有NfD14a-EGFP和NfD14a-EGFP基因片段的載體質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入到了農(nóng)桿菌EHA105。將獲得的工程菌培養(yǎng)后進(jìn)行煙草葉片下表皮注射并培養(yǎng)4~6 d,提取煙草葉片原生質(zhì)體觀察蛋白的定位情況。結(jié)果顯示,在瞬時(shí)表達(dá)35S::NfD14a-EGFP,35S:: NfD14b-EGFP的原生質(zhì)體的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均觀察到綠色熒光,說(shuō)明NfD14定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。

        3? 討論

        獨(dú)腳金內(nèi)酯(SLs)作為一種新型植物激素而成為了人們的研究熱點(diǎn)。雖然獨(dú)腳金內(nèi)酯的生物合成途徑、生理學(xué)功能、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定等已逐漸被了解,但是有關(guān)SLs的生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑仍有待進(jìn)一步闡明。本研究著重探討青天葵中獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵基因NfD14,利用RT-PCR和RACE技術(shù),獲得NfD14a和NfD14b基因的cDNA全長(zhǎng)序列。經(jīng)生物信息學(xué)分析,獲得了NfD14a和NfD14b的基本理化信息。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)NfD14a和NfD14b并未在進(jìn)化樹上聚為一支,提示這兩條基因的功能上可能有差異,還需進(jìn)一步研究。其中NfD14a與水稻、甘蔗的親緣關(guān)系較近,可能具有OsD14和ScHTD2參與獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的類似功能,后續(xù)將進(jìn)行擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),將對(duì)該推斷進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。另外,在線軟件預(yù)測(cè)NfD14a主要定位于葉綠體而NfD14b主要定位于細(xì)胞質(zhì)中,提示NfD14可能參與調(diào)控植物的光合作用[21],NfD14a與王閔霞等[22]對(duì)水稻Dwarf 14(D14)的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果一致,同樣是定位于葉綠體中,但是亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示NfD14a和NfD14b均定位于煙草葉片原生質(zhì)體的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì),與水稻和擬南芥的D14基因的定位結(jié)果一致[13-14],表明青天葵、水稻和擬南芥的D14基因細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的表達(dá)情況相似。2個(gè)NfD14基因在青天葵中的發(fā)育或應(yīng)激反應(yīng)中是否具有不同的作用有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。本研究為進(jìn)一步鑒定NfD14基因的功能提供依據(jù),為青天葵中獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控植物分枝生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。

        參考文獻(xiàn)

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