趙艷玲 韓瑤

摘? 要? 本研究通過反轉(zhuǎn)錄PCR方法克隆了巨尾桉谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，簡(jiǎn)稱GR）基因，該基因定位于巨尾桉細(xì)胞質(zhì)、長(zhǎng)度為1485 bp，在NCBI申請(qǐng)基因注冊(cè)（GenBank Accession Number KU904639）。構(gòu)建了pET-EuGR1原核表達(dá)載體，酶活檢測(cè)表明轉(zhuǎn)化菌株GR活性較高。利用實(shí)時(shí)定量 PCR分析巨尾桉EuGR1的時(shí)空表達(dá)特性，結(jié)果表明：EuGR1的表達(dá)量隨著巨尾桉葉片的成熟而降低，在幼葉中表達(dá)量最大，近根部的葉片表達(dá)量最低;在巨尾桉組培苗中，EuGR1在莖中表達(dá)量最大，葉中表達(dá)量較低，根中表達(dá)量最低。通過轉(zhuǎn)基因抗寒巨尾桉溫室苗研究EuGR1基因在低溫脅迫下的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)常溫和低溫脅迫下耐寒性強(qiáng)的株系其EuGR1的表達(dá)量較高（如P40、P41、P52），耐寒性弱的株系其EuGR1的表達(dá)量較低（如P36、F44、F76），說明巨尾桉EuGR1的表達(dá)量與植株的抗寒能力具有相關(guān)性。隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，EuGR1的表達(dá)量在36 h后出現(xiàn)降低趨勢(shì)，表明EuGR1在桉樹耐低溫脅迫的前期發(fā)揮作用較大。

關(guān)鍵詞? 巨尾桉;谷胱甘肽還原酶;克隆;低溫脅迫

中圖分類號(hào)? Q943.2? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

桉樹是重要的造紙用材，我國(guó)是紙漿進(jìn)口大國(guó)，對(duì)外依存度較高。低溫限制了桉木的種植區(qū)帶，研究桉木應(yīng)對(duì)低溫脅迫的防御機(jī)理和作用機(jī)制，制定具有指導(dǎo)性意義的防控措施和培育耐寒能力強(qiáng)的桉樹新品系，以提高桉樹的木材產(chǎn)量，緩解我國(guó)造紙用材的供求問題，具有重要社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)意義。

谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，簡(jiǎn)稱GR）催化生成還原型谷胱甘肽（GSH），在非生物脅迫下植物中的GR活性會(huì)顯著增加，保護(hù)細(xì)胞免受生物脅迫引起的氧化破壞[1]，以維持較高水平的還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽比（GSH∶GSSG）[2]。

大量的研究數(shù)據(jù)表明GSH的含量與植物的耐低溫能力直接相關(guān)聯(lián)。雪松在冬季總GSH含量增加[3]，高山植物隨海拔的升高其體內(nèi)的谷胱甘肽含量增加[4];番茄[5]、高粱[6]、玉米[7]的GSH含量和GSH∶GSSG比率在耐寒能力強(qiáng)的植株中較高;研究玉米耐低溫能力與總GSH含量和GR活性關(guān)系的結(jié)果表明二者呈正相關(guān)[8]，用5 μmol/L作物安全劑提高玉米25%的耐低溫能力，總GSH含量和GR活性均增加，此時(shí)增加丁亞胺濃度，植物體內(nèi)出現(xiàn)GSH合成抑制因子，玉米體內(nèi)的總GSH含量和GR活性均急速下降，玉米的耐低溫能力也下降了31%;定位于楊樹的葉綠體中正義表達(dá)GR基因，楊樹體內(nèi)GSH含量增加，低溫脅迫下楊樹的光抑制耐受能力增強(qiáng)[9]，這些研究數(shù)據(jù)表明較高的GSH含量提高了植物的抗寒能力。但有關(guān)巨尾桉GR基因的研究未見報(bào)道。

本文研究了巨尾桉EuGR1基因的表達(dá)特性，分析了低溫脅迫下EuGR1基因與巨尾桉耐低溫能力的關(guān)聯(lián)性，為培育抗寒巨尾桉植株提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 細(xì)胞和載體? 載體pET-32a（+）、菌株E. coli BL21，巨尾桉組培苗及溫室苗為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2? 試劑? Prime Script II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、Agarose Gel DNA Extraction Kit、Plant RNA Extraction Kit、One Step PLUS RT-PCR Kit均購(gòu)自寶生物（大連）有限公司;其他試劑和耗材購(gòu)自上海生工有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 桉樹GR基因的克隆? 利用CTAB法[10]提取巨尾桉葉片總RNA，Poly（A） mRNA 純化試劑盒（上海生工）純化總RNA，合成cDNA第一鏈并以引物GSH2F：ATGGCGAGG AAGAT GC TG A T

TGAT，GSH2R：TTACAGATTGGTCTTAGGC TT

GGG擴(kuò)增目的條帶，回收目的片段與pMD18-T Vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)并篩選陽(yáng)性克隆子，委托華大基因公司測(cè)序。

1.2.2? 表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)? 以引物EuGR 12F：5-GTCGACATGGCGAGG AAGAT G C TG AT TGAT-3，EuGR12R：5-CTCGAGTTACAG AT TGGTCTTAGGCTTGGG-3擴(kuò)增目的片段，與pET-32a（+）連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性質(zhì)粒。參考文獻(xiàn)[11]中的方法研究GR基因的原核表達(dá)體系。

1.2.3? GR酶活性測(cè)定? 蛋白酶粗酶液提取和測(cè)定參考文獻(xiàn)[11]中的方法，谷胱甘肽還原酶的一個(gè)酶活力單位定義為25 ℃、pH 7.6、1 min內(nèi)還原1 μmol/L GSSG，計(jì)算GR酶活性公式如下：

GR總活性（U/mg）=

A340 sample：樣品吸光度;A340 blank：對(duì)照吸光度;X：稀釋倍數(shù);W：樣品蛋白質(zhì)含量（mg/mL）。

1.2.4? 實(shí)時(shí)定量PCR分析表達(dá)量? qPCR方法參見文獻(xiàn)[10]，內(nèi)參基因設(shè)計(jì)為巨尾桉18s rRNA，引物序列為Eg18S3：5-CATGGCCGTTCTTAG TT

GGT-3;Eg18S4：5-TAGCAGGCTGA GGT CTC G

T T-3;EgGR1：5-GGGTGAATTGGAGGATGCA

A- 3;E g GR2：5-CAGCATTTGCCAACAATCGC- 3。實(shí)驗(yàn)材料取實(shí)驗(yàn)室保存的溫室苗和組培苗做葉齡和根莖葉的表達(dá)特性分析，以實(shí)驗(yàn)室篩選的抗寒的2種轉(zhuǎn)基因巨尾桉株系pBI-eSOD（大量表達(dá)EuCu ZnSOD1基因，簡(jiǎn)稱P）和pBD-anti- 4CL-eCSD1（大量表達(dá)Eu C uZn SOD1基因+反義阻斷4CL1基因，簡(jiǎn)稱F）為實(shí)驗(yàn)材料，以常溫下、4 ℃處理36 h、4 ℃處理48 h后的葉片為模板分析EuGR1基因的表達(dá)量，以CK為對(duì)照計(jì)算數(shù)據(jù)。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用2-??CT法計(jì)算實(shí)時(shí)定量PCR的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 巨尾桉GR基因的克隆與原核表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)巨桉基因組數(shù)據(jù)，預(yù)測(cè)巨尾桉GR基因大約為1500 bp，篩選陽(yáng)性克隆子經(jīng)（委托華大基因公司）測(cè)序后，在NCBI申請(qǐng)基因注冊(cè)GenBank Accession Number： KU904639。利用WOLF- PROST在線軟件分析巨尾桉GR基因定位于植物細(xì)胞質(zhì)表達(dá)（圖1）。設(shè)計(jì)Sal1、Xho1連接EuGR1和pET-32a（+），因?yàn)閜ET-32 a（+）多酶切位點(diǎn)的Hind Ⅲ已被切除，而在EuGR1的1464 bp處存在一個(gè)Hind Ⅲ單酶切位點(diǎn)，所以用Hind Ⅲ對(duì)重組質(zhì)粒pET-EuGR1進(jìn)行單酶切驗(yàn)證是否連接成功（圖2），Hind Ⅲ酶切后出現(xiàn)一條大小約為7500 bp的單一條帶，說明EuGR1與pET-32 a（+）連接成功。

2.2? 巨尾桉GR基因的原核表達(dá)

巨尾桉EuGR1基因全長(zhǎng)1485 bp，編碼494個(gè)氨基酸，蛋白表達(dá)大小為55 ku，加上表達(dá)載體的標(biāo)簽蛋白，預(yù)測(cè)融合蛋白大小為60 ku。圖3為pET-EuGR1經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE圖，在55～70 ku之間有一條明顯的蛋白條帶，表明EuGR1在原核中誘導(dǎo)表達(dá)。

M：蛋白Marker;1：1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)E. coil BL21;2：E. coil BL21;3：1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)pET-EuGR1;1：pET-EuGR1;5：1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)pET-32a（+）;6：pET-32a

2.3? EuGR1酶活性檢測(cè)

分別將含pET-EuGR1、pET-32 a（+）以及空載的E. coli BL21三種菌株在0.1 mmol/L IPTG、37 ℃誘導(dǎo)4 h，室溫下測(cè)定谷胱甘肽還原酶活性。圖4中轉(zhuǎn)化菌株pET-EuGR1的GR酶活力比含pET-32 a（+）菌株的GR酶活力增加了1.36倍，比空載的E. coli BL21的GR酶活力增加了1.13倍，表明含有重組外源載體pET-EuGR1的大腸桿菌能夠誘導(dǎo)GR蛋白表達(dá)，且具有生物學(xué)活性。

2.4? EuGR1基因在巨尾桉中的表達(dá)特性

以巨尾桉組培苗葉、莖、根的RNA作模板，以葉的EuGR1表達(dá)量為對(duì)照，計(jì)算莖、根中EuGR1相對(duì)表達(dá)量倍數(shù)。EuGR1在巨尾桉組培苗的莖中表達(dá)量最高，其次為葉片，在根中表達(dá)量最低（圖5）。

取巨尾桉溫室苗幼葉、中齡葉、老齡葉3個(gè)樣本的RNA為模板，以幼葉EuGR1的表達(dá)量為對(duì)照，相對(duì)定量中齡葉、老齡葉EuGR1的表達(dá)量（圖6）。EuGR1在幼葉中表達(dá)量最大，其次是中齡葉和老齡葉，說明巨尾桉EuGR1在初生組織表達(dá)量較大，隨著葉片的衰老而表達(dá)量減少。

2.5? 4 ℃低溫脅迫下EuGR1的表達(dá)特性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，耐寒能力較強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株EuGR1表達(dá)量較高，P36的耐寒能力最弱，EuGR1表達(dá)量最低。但是耐寒能力較強(qiáng)的P40、P41、P52、F44、F52轉(zhuǎn)基因植株中EuGR1表達(dá)量隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，均呈現(xiàn)表達(dá)量下降的趨勢(shì)，耐寒能力和寒害恢復(fù)能力最強(qiáng)的P40植株，在低溫脅迫48 h后與常溫相比EuGR1表達(dá)量下降了85%，但是并非表達(dá)量下降最大的植株，表達(dá)量下降最大的植株是F52 ，低溫脅迫48 h后EuGR1 表達(dá)量下降了93%，耐寒能力和寒害恢復(fù)能力最弱的P36植株中，EuGR1表達(dá)量表現(xiàn)為先降低后升高。這些結(jié)果表明EuGR1的表達(dá)量受低溫脅迫的影響較大，4 ℃低溫脅迫下表達(dá)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量降低（圖7）。

3? 討論

本研究克隆了巨尾桉定位于細(xì)胞質(zhì)表達(dá)的GR1基因，通過qPCR數(shù)據(jù)表明該基因的表達(dá)特性有別于其他植物的表達(dá)模式。橡膠樹中GR1定位于細(xì)胞質(zhì)中高表達(dá)，葉片中表達(dá)量低;GR2在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)量較低，葉片中高表達(dá)，且其表達(dá)量與葉片的生長(zhǎng)發(fā)育呈正相關(guān)[11]。擬南芥的基因組經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)GR1定位于細(xì)胞質(zhì)或過氧化物酶體中，與植物的生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)聯(lián)度較小，GR2定位于質(zhì)體（線粒體）中，對(duì)根及頂端分生組織的生長(zhǎng)具有重要作用[12]。在本研究中qPCR的結(jié)果表明巨尾桉細(xì)胞質(zhì)EuGR1基因在細(xì)胞分化生長(zhǎng)旺盛的部位表達(dá)量較大，如幼葉、莖中的表達(dá)量較大，猜測(cè)該基因參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)裙δ?，這與其他植物的研究結(jié)果存在差異。

本研究選取6株編號(hào)為P36、P40、P41、P52、F44、F76的轉(zhuǎn)基因巨尾桉[13]，耐寒能力強(qiáng)的株系EuGR1的表達(dá)量較高（如P40、P41、P52），耐寒能力弱的株系EuGR1的表達(dá)量較低（如P36、F44、F76），說明EuGR1的表達(dá)量與轉(zhuǎn)基因植株的耐寒性有相關(guān)性，這與之前其他植物的研究結(jié)果是相符的。但是轉(zhuǎn)基因巨尾桉植株在4 ℃持續(xù)低溫脅迫下，EuGR1表達(dá)量表現(xiàn)為持續(xù)下降，特別是耐寒能力和恢復(fù)能力較好的株系下降程度較大，例如P40和P41號(hào)株系在4 ℃、36 h時(shí)EuGR1表達(dá)量相比常溫表達(dá)量分別下降了52%和68%，4 ℃、48 h時(shí)EuGR1表達(dá)量相比常溫表達(dá)量分別下降了84%和89%，推測(cè)原因可能是本研究克隆的巨尾桉EuGR1基因定位于細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，先前的研究表明GR基因家族有兩組定位于不同細(xì)胞器的基因，GR2基因定位于葉綠體表達(dá)，可能與植物在低溫脅迫后的耐受性有關(guān)，有關(guān)這方面的猜測(cè)有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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