趙艷玲 韓瑤

摘? 要? 本研究通過反轉(zhuǎn)錄PCR方法克隆了巨尾桉谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，簡稱GR）基因，該基因定位于巨尾桉細胞質(zhì)、長度為1485 bp，在NCBI申請基因注冊（GenBank Accession Number KU904639）。構(gòu)建了pET-EuGR1原核表達載體，酶活檢測表明轉(zhuǎn)化菌株GR活性較高。利用實時定量 PCR分析巨尾桉EuGR1的時空表達特性，結(jié)果表明：EuGR1的表達量隨著巨尾桉葉片的成熟而降低，在幼葉中表達量最大，近根部的葉片表達量最低;在巨尾桉組培苗中，EuGR1在莖中表達量最大，葉中表達量較低，根中表達量最低。通過轉(zhuǎn)基因抗寒巨尾桉溫室苗研究EuGR1基因在低溫脅迫下的表達模式，發(fā)現(xiàn)常溫和低溫脅迫下耐寒性強的株系其EuGR1的表達量較高（如P40、P41、P52），耐寒性弱的株系其EuGR1的表達量較低（如P36、F44、F76），說明巨尾桉EuGR1的表達量與植株的抗寒能力具有相關(guān)性。隨著低溫脅迫時間的延長，EuGR1的表達量在36 h后出現(xiàn)降低趨勢，表明EuGR1在桉樹耐低溫脅迫的前期發(fā)揮作用較大。

關(guān)鍵詞? 巨尾桉;谷胱甘肽還原酶;克隆;低溫脅迫

中圖分類號? Q943.2? ? ?文獻標識碼? A

桉樹是重要的造紙用材，我國是紙漿進口大國，對外依存度較高。低溫限制了桉木的種植區(qū)帶，研究桉木應(yīng)對低溫脅迫的防御機理和作用機制，制定具有指導性意義的防控措施和培育耐寒能力強的桉樹新品系，以提高桉樹的木材產(chǎn)量，緩解我國造紙用材的供求問題，具有重要社會效益和經(jīng)濟意義。

谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，簡稱GR）催化生成還原型谷胱甘肽（GSH），在非生物脅迫下植物中的GR活性會顯著增加，保護細胞免受生物脅迫引起的氧化破壞[1]，以維持較高水平的還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽比（GSH∶GSSG）[2]。

大量的研究數(shù)據(jù)表明GSH的含量與植物的耐低溫能力直接相關(guān)聯(lián)。雪松在冬季總GSH含量增加[3]，高山植物隨海拔的升高其體內(nèi)的谷胱甘肽含量增加[4];番茄[5]、高粱[6]、玉米[7]的GSH含量和GSH∶GSSG比率在耐寒能力強的植株中較高;研究玉米耐低溫能力與總GSH含量和GR活性關(guān)系的結(jié)果表明二者呈正相關(guān)[8]，用5 μmol/L作物安全劑提高玉米25%的耐低溫能力，總GSH含量和GR活性均增加，此時增加丁亞胺濃度，植物體內(nèi)出現(xiàn)GSH合成抑制因子，玉米體內(nèi)的總GSH含量和GR活性均急速下降，玉米的耐低溫能力也下降了31%;定位于楊樹的葉綠體中正義表達GR基因，楊樹體內(nèi)GSH含量增加，低溫脅迫下楊樹的光抑制耐受能力增強[9]，這些研究數(shù)據(jù)表明較高的GSH含量提高了植物的抗寒能力。但有關(guān)巨尾桉GR基因的研究未見報道。

本文研究了巨尾桉EuGR1基因的表達特性，分析了低溫脅迫下EuGR1基因與巨尾桉耐低溫能力的關(guān)聯(lián)性，為培育抗寒巨尾桉植株提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 細胞和載體? 載體pET-32a（+）、菌株E. coli BL21，巨尾桉組培苗及溫室苗為本實驗室保存。

1.1.2? 試劑? Prime Script II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、Agarose Gel DNA Extraction Kit、Plant RNA Extraction Kit、One Step PLUS RT-PCR Kit均購自寶生物（大連）有限公司;其他試劑和耗材購自上海生工有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 桉樹GR基因的克隆? 利用CTAB法[10]提取巨尾桉葉片總RNA，Poly（A） mRNA 純化試劑盒（上海生工）純化總RNA，合成cDNA第一鏈并以引物GSH2F：ATGGCGAGG AAGAT GC TG A T

TGAT，GSH2R：TTACAGATTGGTCTTAGGC TT

GGG擴增目的條帶，回收目的片段與pMD18-T Vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)并篩選陽性克隆子，委托華大基因公司測序。

1.2.2? 表達載體的構(gòu)建與表達? 以引物EuGR 12F：5-GTCGACATGGCGAGG AAGAT G C TG AT TGAT-3，EuGR12R：5-CTCGAGTTACAG AT TGGTCTTAGGCTTGGG-3擴增目的片段，與pET-32a（+）連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽性質(zhì)粒。參考文獻[11]中的方法研究GR基因的原核表達體系。

1.2.3? GR酶活性測定? 蛋白酶粗酶液提取和測定參考文獻[11]中的方法，谷胱甘肽還原酶的一個酶活力單位定義為25 ℃、pH 7.6、1 min內(nèi)還原1 μmol/L GSSG，計算GR酶活性公式如下：

GR總活性（U/mg）=

A340 sample：樣品吸光度;A340 blank：對照吸光度;X：稀釋倍數(shù);W：樣品蛋白質(zhì)含量（mg/mL）。

1.2.4? 實時定量PCR分析表達量? qPCR方法參見文獻[10]，內(nèi)參基因設(shè)計為巨尾桉18s rRNA，引物序列為Eg18S3：5-CATGGCCGTTCTTAG TT

GGT-3;Eg18S4：5-TAGCAGGCTGA GGT CTC G

T T-3;EgGR1：5-GGGTGAATTGGAGGATGCA

A- 3;E g GR2：5-CAGCATTTGCCAACAATCGC- 3。實驗材料取實驗室保存的溫室苗和組培苗做葉齡和根莖葉的表達特性分析，以實驗室篩選的抗寒的2種轉(zhuǎn)基因巨尾桉株系pBI-eSOD（大量表達EuCu ZnSOD1基因，簡稱P）和pBD-anti- 4CL-eCSD1（大量表達Eu C uZn SOD1基因+反義阻斷4CL1基因，簡稱F）為實驗材料，以常溫下、4 ℃處理36 h、4 ℃處理48 h后的葉片為模板分析EuGR1基因的表達量，以CK為對照計算數(shù)據(jù)。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用2-??CT法計算實時定量PCR的實驗數(shù)據(jù)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 巨尾桉GR基因的克隆與原核表達載體構(gòu)建

根據(jù)巨桉基因組數(shù)據(jù)，預(yù)測巨尾桉GR基因大約為1500 bp，篩選陽性克隆子經(jīng)（委托華大基因公司）測序后，在NCBI申請基因注冊GenBank Accession Number： KU904639。利用WOLF- PROST在線軟件分析巨尾桉GR基因定位于植物細胞質(zhì)表達（圖1）。設(shè)計Sal1、Xho1連接EuGR1和pET-32a（+），因為pET-32 a（+）多酶切位點的Hind Ⅲ已被切除，而在EuGR1的1464 bp處存在一個Hind Ⅲ單酶切位點，所以用Hind Ⅲ對重組質(zhì)粒pET-EuGR1進行單酶切驗證是否連接成功（圖2），Hind Ⅲ酶切后出現(xiàn)一條大小約為7500 bp的單一條帶，說明EuGR1與pET-32 a（+）連接成功。

2.2? 巨尾桉GR基因的原核表達

巨尾桉EuGR1基因全長1485 bp，編碼494個氨基酸，蛋白表達大小為55 ku，加上表達載體的標簽蛋白，預(yù)測融合蛋白大小為60 ku。圖3為pET-EuGR1經(jīng)IPTG誘導表達的SDS-PAGE圖，在55～70 ku之間有一條明顯的蛋白條帶，表明EuGR1在原核中誘導表達。

M：蛋白Marker;1：1.0 mmol/L IPTG誘導E. coil BL21;2：E. coil BL21;3：1.0 mmol/L IPTG誘導pET-EuGR1;1：pET-EuGR1;5：1.0 mmol/L IPTG誘導pET-32a（+）;6：pET-32a

2.3? EuGR1酶活性檢測

分別將含pET-EuGR1、pET-32 a（+）以及空載的E. coli BL21三種菌株在0.1 mmol/L IPTG、37 ℃誘導4 h，室溫下測定谷胱甘肽還原酶活性。圖4中轉(zhuǎn)化菌株pET-EuGR1的GR酶活力比含pET-32 a（+）菌株的GR酶活力增加了1.36倍，比空載的E. coli BL21的GR酶活力增加了1.13倍，表明含有重組外源載體pET-EuGR1的大腸桿菌能夠誘導GR蛋白表達，且具有生物學活性。

2.4? EuGR1基因在巨尾桉中的表達特性

以巨尾桉組培苗葉、莖、根的RNA作模板，以葉的EuGR1表達量為對照，計算莖、根中EuGR1相對表達量倍數(shù)。EuGR1在巨尾桉組培苗的莖中表達量最高，其次為葉片，在根中表達量最低（圖5）。

取巨尾桉溫室苗幼葉、中齡葉、老齡葉3個樣本的RNA為模板，以幼葉EuGR1的表達量為對照，相對定量中齡葉、老齡葉EuGR1的表達量（圖6）。EuGR1在幼葉中表達量最大，其次是中齡葉和老齡葉，說明巨尾桉EuGR1在初生組織表達量較大，隨著葉片的衰老而表達量減少。

2.5? 4 ℃低溫脅迫下EuGR1的表達特性

實驗結(jié)果表明，耐寒能力較強的轉(zhuǎn)基因植株EuGR1表達量較高，P36的耐寒能力最弱，EuGR1表達量最低。但是耐寒能力較強的P40、P41、P52、F44、F52轉(zhuǎn)基因植株中EuGR1表達量隨著低溫脅迫時間的延長，均呈現(xiàn)表達量下降的趨勢，耐寒能力和寒害恢復(fù)能力最強的P40植株，在低溫脅迫48 h后與常溫相比EuGR1表達量下降了85%，但是并非表達量下降最大的植株，表達量下降最大的植株是F52 ，低溫脅迫48 h后EuGR1 表達量下降了93%，耐寒能力和寒害恢復(fù)能力最弱的P36植株中，EuGR1表達量表現(xiàn)為先降低后升高。這些結(jié)果表明EuGR1的表達量受低溫脅迫的影響較大，4 ℃低溫脅迫下表達量隨著時間的延長表達量降低（圖7）。

3? 討論

本研究克隆了巨尾桉定位于細胞質(zhì)表達的GR1基因，通過qPCR數(shù)據(jù)表明該基因的表達特性有別于其他植物的表達模式。橡膠樹中GR1定位于細胞質(zhì)中高表達，葉片中表達量低;GR2在細胞質(zhì)中表達量較低，葉片中高表達，且其表達量與葉片的生長發(fā)育呈正相關(guān)[11]。擬南芥的基因組經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)GR1定位于細胞質(zhì)或過氧化物酶體中，與植物的生長發(fā)育關(guān)聯(lián)度較小，GR2定位于質(zhì)體（線粒體）中，對根及頂端分生組織的生長具有重要作用[12]。在本研究中qPCR的結(jié)果表明巨尾桉細胞質(zhì)EuGR1基因在細胞分化生長旺盛的部位表達量較大，如幼葉、莖中的表達量較大，猜測該基因參與植物的生長發(fā)育以及營養(yǎng)物質(zhì)運輸?shù)裙δ埽@與其他植物的研究結(jié)果存在差異。

本研究選取6株編號為P36、P40、P41、P52、F44、F76的轉(zhuǎn)基因巨尾桉[13]，耐寒能力強的株系EuGR1的表達量較高（如P40、P41、P52），耐寒能力弱的株系EuGR1的表達量較低（如P36、F44、F76），說明EuGR1的表達量與轉(zhuǎn)基因植株的耐寒性有相關(guān)性，這與之前其他植物的研究結(jié)果是相符的。但是轉(zhuǎn)基因巨尾桉植株在4 ℃持續(xù)低溫脅迫下，EuGR1表達量表現(xiàn)為持續(xù)下降，特別是耐寒能力和恢復(fù)能力較好的株系下降程度較大，例如P40和P41號株系在4 ℃、36 h時EuGR1表達量相比常溫表達量分別下降了52%和68%，4 ℃、48 h時EuGR1表達量相比常溫表達量分別下降了84%和89%，推測原因可能是本研究克隆的巨尾桉EuGR1基因定位于細胞質(zhì)表達，先前的研究表明GR基因家族有兩組定位于不同細胞器的基因，GR2基因定位于葉綠體表達，可能與植物在低溫脅迫后的耐受性有關(guān)，有關(guān)這方面的猜測有待進一步的研究證實。

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