楊俊 鄭雪蓮 高歡歡 寇燕 陳旭 郭傲 鄭國華

摘? 要? 以‘解放鐘和‘白梨果實為材料，研究基于轉(zhuǎn)錄組篩選出的表達量較高且在2個品種中有差異的EjNADP-ME2（Unigene0001461）基因，采用RACE和RT-PCR技術成功克隆EjNADP-ME2的cDNA全長。系統(tǒng)進化樹分析表明，EjNADP-ME2與蘋果的NADP-ME基因關系最近。生物信息學預測結果顯示，EjNADP-ME2蛋白應該位于細胞質(zhì)中。用染色體步移法成功克隆了EjNADP-ME2的啟動子序列，序列預測該基因啟動子區(qū)域含有水楊酸、茉莉酸、脫落酸響應的順式作用元件，此外還有厭氧誘導元件、MYB和MYC參與黃化和干旱誘導的結合位點MBS。熒光定量PCR分析表明，EjNADP-ME2基因的表達量變化趨勢在2個品種中大致相同，均呈現(xiàn)出先降低后升高又降低的趨勢，且該基因在低酸品種的表達量稍低于高酸品種。相關性分析結果顯示，低酸品種EjNADP-ME2基因轉(zhuǎn)錄水平與蘋果酸含量呈顯著負相關。本研究的結果為進一步探究EjNADP-ME2基因在蘋果酸代謝途徑中的功能奠定堅實基礎。

關鍵詞? 枇杷;果實;細胞質(zhì)型蘋果酸酶;基因表達分析;啟動子

中圖分類號? S667.3? ? ? 文獻標識碼? A

枇杷（Eriobotrya japonica）是薔薇科亞熱帶常綠果樹，被廣泛種植在中國、日本、意大利、巴西、西班牙等國家[1]。枇杷果實偏酸是影響其果實品質(zhì)和商業(yè)價值的主要因素。有機酸含量和種類是決定果實風味的主要因素之一，通常在果實發(fā)育的早期階段積累，并在果實成熟期間用作呼吸基質(zhì)[2]。大多數(shù)水果中的有機酸是蘋果酸和檸檬酸，枇杷果實屬于蘋果酸型，其中蘋果酸含量占有機酸含量的80%以上[3]。成熟果實中最終有機酸的含量由有機酸生物合成，降解和液泡儲存之間的平衡共同決定[4]。蘋果酸代謝主要受6種關鍵酶基因調(diào)控，其中磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEPC）和NAD型蘋果酸脫氫酶（NAD-MDH）控制蘋果酸的合成;NADP-ME和磷酸烯醇丙酮酸激酶（PEPCK）負責蘋果酸的降解;蘋果酸依賴液泡膜H+-ATPase（VHA）和H+-VPP（V-PPase）質(zhì)子泵積累轉(zhuǎn)運ATP所需要的能量[5]。

蘋果酸酶（MEs）是調(diào)控蘋果酸代謝的關鍵酶之一，催化L-蘋果酸的氧化脫羧，在二價陽離子作用下產(chǎn)生丙酮酸，CO2和NADPH。根據(jù)輔酶的特性，可將蘋果酸酶分為NAD-ME和NADP- ME，均廣泛存在于自然界中[6]。在高等植物中，NAD-ME主要在線粒體中產(chǎn)生丙酮酸，NADP-ME主要存在于細胞質(zhì)和質(zhì)體中，其中cyNADP-ME是參與蘋果酸降解的關鍵酶[7]。目前，對植物中NADP-ME酶的研究主要有煙草、擬南芥、白楊、蘋果、桃、草莓、菠蘿等[8-12]。對該酶功能的研究主要在抗性、防衛(wèi)、果實成熟等方面[13]。在水稻中，Liu等[14]研究表明NADP-ME調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外的滲透壓，能夠提高抗鹽害的能力。李明等[15]成功地從蘋果果實中克隆了細胞質(zhì)型NADP-ME，并且驗證了Mal-ME在果實發(fā)育過程中對蘋果酸的積累起負調(diào)控作用。

本研究以高酸的‘解放鐘和低酸的‘白梨為實驗材料。從轉(zhuǎn)錄組中得到EjNADP-ME2基因的保守區(qū)，采用RACE技術成功分離EjNADP- ME2基因cDNA全長并進行生物信息學分析，同時分析EjNADP-ME2在果實中不同發(fā)育階段的表達水平和蘋果酸含量之間的聯(lián)系。采用染色體步移的方法獲得EjNADP-ME2基因的啟動子序列，對所得序列的順式作用元件進行分析，為深入研究EjNADP-ME2基因的功能與蘋果酸代謝之間的機理提供理論基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試材料枇杷果實采自福建省莆田市常太鎮(zhèn)果園10年生枇杷樹。選取無病蟲害且盛花期一致的‘解放鐘和‘白梨2個品種各3株，于花期后50、65、80、95、110和125 d各采一次果。每株樹上采6個果實，采后迅速去皮去核，用錫箔紙包好于液氮中速凍，保存于80 ℃冰箱中以備后續(xù)提取RNA。本實驗設置3次生物學重復，每次重復隨機選取2 g樣品進行蘋果酸含量的測定。

1.2? 方法

1.2.1? 枇杷果實中蘋果酸提取及測定? 取2 g樣品于10 mL的離心管中，加入一定量的甲醇，75 ℃超聲提取30 min后，12000 r/min離心10 min后取上清轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，重復3次，定容至25 mL，旋轉(zhuǎn)蒸干后，取5 mL雙蒸水溶解，取1 mL提取液過有機濾膜，濾液用于HPLC的檢測，蘋果酸含量的測定參考陳發(fā)興等[16]的HPLC方法，每個樣品設置3次生物學重復。

1.2.2? 枇杷果實RNA、DNA的提取和cDNA合成? 采用天根試劑盒對枇杷果實中RNA和DNA進行提取，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳和 Thermo Scientific Nano Drop 2000c檢測RNA和DNA質(zhì)量和濃度（圖1A）。以枇杷果實的總RNA為模板，利用TaKaRa公司的PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒合成cDNA，用于后續(xù)的RT-PCR和q-PCR。

1.2.3? EjNADP-ME2基因cDNA全長克隆及其啟動子克隆? 分析枇杷花后110 d果肉RNA-seq數(shù)據(jù)庫（未公布）篩選得到EjNADP-ME2保守區(qū)片段，發(fā)現(xiàn)缺少5端序列，參照TaKaRa公司的SMART 5RACE對該基因進行5端擴增。設計5端RACE引物（表1），以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，克隆EjNADP-ME2基因5端序列，用克隆得到的序列與保守區(qū)片段的序列拼接后的全長設計ORF引物驗證，引物由鉑尚生物技術有限公司合成。以枇杷果實取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 ?L為模板對EjNADP-ME2基因進行5RACE第1輪擴增，建立25 ?L如下PCR反應體系：10×Ex-Taq Buffer 2.5 ?L;dNTP Mixture（10 mmol/L）0.5 ?L;上、下游引物（10 mmol/L）各0.5 ?L;cDNA模板1 ?L;Ex-Taq（5 U/?L）0.3 ?L，加ddH2O至 25 ?L。按照如下擴增程序進行：94 ℃預變性8 min;循環(huán)35次（94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸120 s，72 ℃ 8 min）后。以第1輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍作為第2輪擴增的模板，反應體系和條件和第1輪相同，PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后連接到pUCm-T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，用通用引物M13進行菌液PCR檢測，篩選正確的陽性克隆子送深圳華大基因股份有限公司測序。

在EjNADP-ME2的編碼區(qū)序列起始密碼子ATG上游設計3個向外的PCR引物SP1、SP2和SP3（表1），以基因組DNA為模板，參照TaKaRa公司的染色體步移試劑盒進行3次染色體步移，回收PCR產(chǎn)物并連接到pUCm-T載體上，構建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，送往華大基因公司測序。

1.2.4? EjNADP-ME2基因的實時熒光定量（qPCR）表達分析? 采用Beacon Designer 7軟件分別設計內(nèi)參基因Actin和目的基因熒光定量的引物（表1）。實時熒光定量PCR體系和程序均參照TaKaRa 公司的SYBR? Premix Ex TapTM Ⅱ試劑盒說明書進行操作。使用耶拿qTOWER2.2熒光定量儀完成定量分析。反應程序：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，45個循環(huán)。每個樣品設3個生物重復和3個技術重復，利用 2–ΔΔCT對定量數(shù)據(jù)進行分析。

1.2.5? EjNADP-ME2基因的生物信息學分析? ?使用DNAMAN進行比對和拼接目的基因序列。利用ExPASy工具中ProtParam（https：//web. expasy.org/protparam/）程序?qū)Π被嵝蛄械慕M成分子、分子量、等電點及編碼蛋白的親水性進行分析;NetPhos 3.1 Server分析磷酸化位點;TMHMM Sever 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMH M M/）預測蛋白的跨膜區(qū);使用在線軟件SoftBerry ProtComp 9.0（http：//linux1.softberry.com/b err y.p html）進行亞細胞定位預測;SignalP 4.1 （http：//ww w.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測信號肽;SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/n p s a_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sec cons. html）預測蛋白的二級結構;Phyre 2（http：//www. sbg. bio. ic. ac. uk/phyre2/html）在線預測蛋白三級結構;啟動子的順作用元件分析在PlantCar（http：//bioinformatic.psp.ugent. be/webtools/plan tc are/heml）Place（https：//sogo.dna.affrc.go.jp/cg ibin/sogo.cgi？sid=&pj=640&action=newPlaceSite&site=S000362）網(wǎng)頁中共同分析完成。

1.2.6? 數(shù)據(jù)分析及相關性評估? 采用SPSS19.0軟件和Microsoft Excel 2016軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。利用Pearson相關系數(shù)評價EjNADP-ME2基因表達量與枇杷果肉蘋果酸含量之間的關系。

2? 結果與分析

2.1? 枇杷果實中蘋果酸含量的變化

利用HPLC對‘解放鐘和‘白梨的蘋果酸含量進行測定，結果顯示均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢（圖1）。此外，兩者在果實發(fā)育前期的蘋果酸含量不存在顯著差異，花后95 d時兩者的蘋果酸達到最大值，果實發(fā)育后期（花后95 d以后）低酸品種蘋果酸的降解幅度顯著高于高酸的幅度，是導致2個品種之間酸度差異的主要原因。

2.2? EjNADP-ME2基因cDNA全長序列克隆及分析

基于‘解放鐘和‘白梨果肉發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄組測序，分析得Unigene0001461（NADP- ME2）在2個品種果肉發(fā)育后期具有顯著差異，利用Blast數(shù)據(jù)庫對該基因與同源基因進行比對，結果顯示該基因缺少5端序列。在此片段的基礎上設計2輪巢式PCR的引物（表1），對EjNADP-ME2基因進行5端擴增得289 bp的片段（圖2C），最后利用特異性引物擴增該基因的（ORF）全長，經(jīng)過測序拼接之后獲得該基因的ORF為1863 bp（圖2B）。所得的序列與蘋果、白梨的序列具有95%以上的同源性，因此將該基因命名為EjNADP-ME2。

2.3? EjNADP-ME2編碼蛋白質(zhì)生物信息學分析

2.3.1? EjNADP-ME2編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)? 利用ProtParam程序分析EjNADP-ME2編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，結果表明，該基因編碼621個氨基酸（圖3）。理論上的蛋白分子量67895.23 u，理論等電點（pI）為6.56，分子式為：C3061H4851N811O892 S19。半衰變期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為30.72（<40），平均親水性0.094，屬于穩(wěn)定的非親水蛋白。NetPhos 3.1 Server分析推測該蛋白質(zhì)多肽鏈上總共含有78個磷酸化位點。TMHMM Sever 2.0結果表明不存在跨膜區(qū)。SignalP 4.1預測顯示不存在信號肽序列，表明其是非分泌蛋白。SoftBerry ProtComp 9.0在線預測EjNADP-ME2蛋白位于細胞質(zhì)，其預測值為6.2。

2.3.2? EjNADP-ME2編碼蛋白質(zhì)的二級和三級結構分析? 使用在線數(shù)據(jù)庫SOPMA對NADP-ME蛋白進行二級結構預測，結果顯示，該蛋白質(zhì)由39.29%的α-螺旋、16.26%的延伸鏈和44.44%隨機卷曲三部分結構組成，由此可知該蛋白質(zhì)主要是由隨機卷曲結構組成。SWISS-MODEL對EjNADP-ME2蛋白的三級結構進行模擬，GEOM分值為0.74，表明該模型的可信度很高。

2.4? EjNADP-ME2保守結構域及系統(tǒng)進化分析

對蘋果（Malus domestica）、梨（Pyrus? bretschneideri）、李（Prunus avium）、桃（Prunus persica）、草莓（Fragaria vesca subsp. Vesca）、月季（Rosa chinensis）、葡萄（Vitis vinifera）、番茄（Solanum lycopersicum）、煙草（Nicotiana attenuata）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）及枇杷（Eriobotrya japonica）中NADP-ME蛋白氨基酸的保守序列進行分析（圖4）。結果表明：均存在10個Motifs，且前9個 Motifs均有50個保守序列（表2）。

在單子葉植物和雙子葉植物中，選取19個物種，通過從NCBI中下載氨基酸的同源序列，利用MEGA7.0構建系統(tǒng)進化樹，結果見圖5，

2.5? EjNADP-ME2基因啟動子的克隆及序列分析

以‘解放鐘枇杷基因組DNA為模板，利用染色體步移的方法獲得EjNADP-ME2啟動子序列721 bp（圖2D）。將得到的啟動子序列提交到在線工具PlantCare和PLACE進行預測和分析，結果顯示（圖6）：該基因的啟動子順式作用元件除包括大多數(shù)植物啟動子序列的一些保守元件如啟動子和增強子區(qū)域CAAT-Box，厭氧誘導作用元件ARE，G-motif、光響應調(diào)控元件G-Box、轉(zhuǎn)錄開始30左右的核心啟動子元件。還有一些與激素有

圖5? EjNADP-ME2氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹

Fig. 5? The phylogenetic tree of EjNADP-ME2 amino acid sequence

圖6? EjNADP-ME2啟動子序列及順式作用元件

Fig. 6? EjNADP-ME2 promoter sequence and cis-acting element

關的作用元件如脫落酸響應元件、茉莉酸響應元件、水楊酸響應元件。此外，該啟動子還存在轉(zhuǎn)錄因子MYB、MYC結合位點MBS。

2.6? EjNADP-ME果實發(fā)育過程中的表達分析

利用熒光定量PCR技術對‘解放鐘和‘白梨果實發(fā)育過程EjNADP-ME2的表達檢測，結果表明，‘解放鐘和‘白梨的EjNADP-ME2具有相似的表達模式，均表現(xiàn)出先降低后升高又降低的趨勢（圖7），在果實發(fā)育前期（50～80 d）EjNADP-ME2基因在‘解放鐘中總體的轉(zhuǎn)錄水平與‘白梨之間差異不顯著，該基因的表達量在花后95 d時均達到最低值，果實成熟期（花后110 d）高酸品種的表達量顯著高于低酸品種。

2.7? 枇杷果實蘋果酸含量與EjNADP-ME2基因表達的相關性

利用SPSS19.0軟件對2個枇杷品種果實發(fā)育時期的的蘋果酸含量與EjNADP-ME基因的表達量進行相關性評價。結果表明，在低酸品種“白梨”果實發(fā)育時期內(nèi)，蘋果酸含量與EjNADP-ME基因表達量之間的Pearson值為0.779，呈顯著負相關，但在高酸品種果實發(fā)育過程中，兩者的之間為Pearson值為0.117，高酸品種中蘋果酸含量與EjNADP-ME基因表達量之間不存在顯著的相關性。

3? 討論

利用HPLC技術對高酸品種‘解放鐘和低酸品種‘白梨果實發(fā)育期的果肉進行有機酸的測定，結果表明，在果實發(fā)育前期（即花后80 d以前），2個品種中的蘋果酸的含量不存在差異。在花后95 d時，高酸和低酸品種的蘋果酸含量達到最大值。在果實發(fā)育后期（花后95 d以后）低酸品種的降解速度和幅度明顯高于高酸品種，陳發(fā)興等[17]研究表明在花后的105 d時果實中的蘋果酸含量達到最高隨后降低，可能是因為實驗材料所處的地理位置不同所致，但蘋果酸含量的總體變化趨勢相一致，所以仍然可以說明高酸和低酸品種在果實發(fā)育后期蘋果酸降解速度不同可能是導致2個品種酸度差異的主要原因。

在高等植物中，NADP-蘋果酸酶由1個小的基因家族編碼。水稻中的NADP-ME家族由3個細胞質(zhì)NADP-ME和1個質(zhì)體型NADP-ME構成，并且4種NADP-ME的氨基酸序列具有很高的相似性[5]。Tao等[18]分析了12種十字花科植物的NADP-ME家族成員，結果表明NADP-ME的5個基因表現(xiàn)出差異表達模式，每個基因都可能具有特定的生物功能。Wheeler等[19]從擬南芥中克隆出4種NADP-ME基因的序列，并且通過Gus染色技術結果表明NADP-ME2是調(diào)控擬南芥成熟組織中NADP-ME活性的關鍵酶基因。本研究從枇杷果實轉(zhuǎn)錄組中篩選出表達量較高且在兩品種之間有顯著表達差異的EjNADP-ME（Unigene 0001461）基因。采用RACE技術克隆出EjNADP- ME2的cDNA全長，該基因cDNA的全長序列2159 bp，編碼621個氨基酸，通過亞細胞定位軟件結果顯示EjNADP-ME2位于細胞質(zhì)中。EjNADP-ME2基因與其他物種具有相似的功能結構域，表明該基因可能調(diào)控蘋果酸的合成。從系統(tǒng)進化樹中可以看出EjNADP-ME2基因在物種進化上具有較高的保守性。

目前，關于EjNADP-ME2基因啟動子的研究未見報道。本實驗利用染色體步移的技術成功克隆到EjNADP-ME2起始密碼子上游721 bp啟動子片段。對啟動子序列進行生物信息學分析，結果顯示，其含有大多數(shù)基因啟動子的保守元件。此外，還有一些MYC和MYB的結合位點，說明EjNADP-ME2有可能受該轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，這為進一步探究EjNADP-ME2基因如何調(diào)控蘋果酸的降解提供了依據(jù)。

已有人研究EjNADP-ME2基因表達與水果果實中蘋果酸積累之間的關系，Yao等[20]研究表明在蘋果成熟期間EjNADP-ME的轉(zhuǎn)錄對蘋果酸的積累起負調(diào)控的作用。Etienne等[21]成功克隆出桃中6個關鍵酶基因并且對各個基因的表達量進行了分析，結果表明各個基因的表達量與蘋果酸的積累沒有必然聯(lián)系。Mu等[22]通過分析李的轉(zhuǎn)錄組及對蘋果酸相關基因的表達量進行檢測，發(fā)現(xiàn)雖然NADP-ME基因是蘋果酸代謝過程的關鍵基因，但對李果實發(fā)育過程中的有機酸積累并沒有起到?jīng)Q定性的作用。本實驗利用RT-qPCR對2個品種的EjNADP-ME2基因的表達量進行了測定。結果表明，高酸和低酸品種的EjNADP-ME2表達量的變化趨勢大致相同，在果實發(fā)育前期，該基因的表達量均逐漸減小，在花后80 d兩個品種的轉(zhuǎn)錄水平均達到最低，此時蘋果酸的含量達到最大值?；ê?0 d，果實的蘋果酸含量隨EjNADP-ME2基因表達量升高而降低。利用SPSS軟件分析對EjNADP-ME2基因表達與果實蘋果酸積累的相關性進行分析，結果顯示‘白梨中該基因轉(zhuǎn)錄水平與蘋果酸含量呈顯著負相關，說明EjNADP- ME2基因可能是導致低酸的關鍵因素，這與李明等[15]的研究結果一致。在果實發(fā)育前期‘解放鐘EjNADP-ME2基因的表達量略高于‘白梨，在實發(fā)育后期（110～125 d），該基因在兩者之間的表達水平呈現(xiàn)顯著差異。由此說明兩品種之間的酸度差異不是主要由該基因引起的，可能還受其他蘋果酸代謝相關基因的調(diào)控。這與Yang等[23]的結果相似。

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