曹璐 付影 于旭東 蔡澤坪 羅佳佳 湯竹

摘? 要? 油菜素內(nèi)酯（Brassinolide，BL）能誘導(dǎo)單子葉植物初生根發(fā)生不對(duì)稱生長(zhǎng)，而在雙子葉植物中還未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)外源施加不同濃度2，4-表油菜素內(nèi)酯（2，4-Epibrassinolide，2，4-eBL）觀察小白菜（Brassica chinensis L.）初生根生長(zhǎng)狀況。結(jié)果表明：2，4-eBL能誘導(dǎo)小白菜初生根發(fā)生不對(duì)稱生長(zhǎng)形成卷曲。隨著2，4-eBL濃度的升高，根卷曲比例和曲率逐漸增大，同時(shí)向地性逐漸降低。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外源施加2，4-eBL可誘導(dǎo)雙子葉植物根不對(duì)稱生長(zhǎng)的現(xiàn)象，為研究油菜素甾醇（Brassinosteroids，BRs）在根生長(zhǎng)發(fā)育中的作用提供新途徑。

關(guān)鍵詞? 2，4-表油菜素內(nèi)酯;小白菜;初生根;不對(duì)稱生長(zhǎng);向地性

中圖分類號(hào)? Q945.32? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

1979年Grove等[1]首次從歐洲油菜（Brassica napus L.）花粉中分離出油菜素內(nèi)酯（Brassinolide， BL），至今已分離鑒定出70多種多羥基甾醇衍生物，統(tǒng)稱油菜素甾醇（Brassinosteroids， BRs）[2]。在所有BRs中BL的生物活性最高[3-4]。BRs在根中合成并調(diào)控根的生長(zhǎng)發(fā)育，影響根的伸長(zhǎng)、不定根發(fā)生、側(cè)根發(fā)育、根毛形成、根尖重力反應(yīng)等[5-9]。

BRs在植物體各器官中的分布存在顯著差異，尤其在根中的含量甚微，從而導(dǎo)致其在根中的發(fā)現(xiàn)晚于下胚軸及植物體的其它部位。與此對(duì)應(yīng)的是，根對(duì)BRs的反應(yīng)要比植物體的其他部位敏感得多[10]。BRs最早的分離提純來(lái)自于玉米（Zea mays），隨后相繼在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、豌豆（Pisum sativum）和西紅柿（Lycopersicon esculentum）的根中被發(fā)現(xiàn)[11-13]。研究證明BRs在調(diào)控根端分生組織（root apical meristem，RAM）分化以及根伸長(zhǎng)的過(guò)程中扮演著重要角色[14]。在擬南芥中，BRs在極低濃度下（≤0.1 nmol/L）促進(jìn)根的伸長(zhǎng)[10]，而在高濃度下（≥10 nmol/L）抑制[15-17]。BRs合成或信號(hào)受阻均會(huì)導(dǎo)致RAM變小和根長(zhǎng)縮短[18]。BRs還在影響根的向地性上起關(guān)鍵作用，Soochul等[19]和Kim等[20]發(fā)現(xiàn)BRs可以增加玉米、擬南芥等不同物種主根的向地性曲率。在玉米中，當(dāng)BL濃度為107 mol/L時(shí)向地性角度達(dá)到最大值;而在擬南芥中，當(dāng)BL濃度為10?10～10?7 mol/L時(shí)，根向地性逐漸增強(qiáng)。

雙子葉和單子葉植物根存在一定區(qū)別。其中，大多雙子葉植物根為定根、根系為直根系，而單子葉植物根為不定根、根系為須根系[21]。BRs能夠誘導(dǎo)單子葉須根系植物水稻（Oryza sativa）幼苗初生根發(fā)生不對(duì)稱生長(zhǎng)形成卷曲（coiling）和波浪形彎曲（wave）[22-24]。然而，關(guān)于BRs誘導(dǎo)雙子葉直根系植物初生根不對(duì)稱生長(zhǎng)的研究還未見報(bào)道。本研究用2，4-表油菜素內(nèi)酯（2，4- Epibrassinolide，2，4-eBL）處理雙子葉直根系植物小白菜（Brassica chinensis L.），探究2，4-eBL調(diào)控小白菜根不對(duì)稱生長(zhǎng)、減弱初生根向地性的現(xiàn)象，為植物激素對(duì)根生長(zhǎng)的研究提供新的見解。

1? 材料與方法

1.1? 材料

小白菜（Brassica chinensis L.）種子購(gòu)自蔬菜物資公司，商品名稱為綠領(lǐng)四月慢。2，4-eBL（code E-1641）購(gòu)自sigma公司，用75%乙醇溶解并配制成1 mmol/L母液。

1.2? 方法

1.2.1? 種子滅菌? 選擇飽滿且不開裂的種子，自來(lái)水浸泡30 min，在超凈工作臺(tái)上依次用75%乙醇和0.1%升汞分別浸泡30 s和7 min，無(wú)菌水浸洗5遍。

1.2.2? 初生根向地性角度的測(cè)量? 在超凈工作臺(tái)上，將滅好菌的小白菜種子接入2，4-eBL濃度梯度分別為0、2×10?11、2×10?9、2×10?7 mol/L的MS固體培養(yǎng)基中。每只試管接種1粒種子，重復(fù)10次，并于第3天測(cè)量初生根的向地性角度。

1.2.3? 初生根主根長(zhǎng)、曲率和卷曲比例的測(cè)量? 在超凈工作臺(tái)上，將滅好菌的小白菜種子接入2，4-eBL濃度梯度分別為0、2×10?13、2×10?12、2×10?11、2×10?10、2×10?9、2×10?8、2×10?7 mol/L的MS固體培養(yǎng)基中。每瓶接種10粒種子，重復(fù)6次。第8 d測(cè)量主根長(zhǎng)、曲率和卷曲比例。

1.2.4? 培養(yǎng)條件? 以上均為光照和黑暗培養(yǎng)，光照培養(yǎng)條件為：溫度（25±2）℃，光強(qiáng)1000 lx，光周期為光照16 h/d，黑暗8 h/d;暗培養(yǎng)條件為：溫度（25±2）℃，黑暗24 h/d。

1.3? 數(shù)據(jù)分析

根長(zhǎng)、曲率和向地性角度均采用Image J v1.50i軟件（https：//imagej.nih.gov/ij/index.html）測(cè)量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用LSD檢驗(yàn)和Duncan法進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性多重比較。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 外源施加2，4-eBL對(duì)小白菜初生根向地性的影響

無(wú)論是光照培養(yǎng)還是暗培養(yǎng)，2，4-eBL對(duì)小白菜初生根向地性的作用2～3 d便能表現(xiàn)出來(lái)。濃度大于2×10?11 mol/L時(shí)，隨著2，4-eBL濃度的升高，根尖向地性角度減?。▓D1A～圖1H）。光培養(yǎng)下，2，4-eBL濃度為0時(shí)，根尖向地性角度為（70.9±10.4）;濃度為2×10?11 mol/L時(shí)，根尖向地性角度與對(duì)照相比有顯著差異;濃度為2×10?9 mol/L時(shí)，根尖向地性角度與對(duì)照相比有極顯著差異;濃度為2×10?7 mol/L時(shí)，根尖向地性角度是對(duì)照的38.6%，有極顯著差異（圖1I）。暗培養(yǎng)下，2，4-eBL濃度為0時(shí)，根尖向地性角度為（74.4±10.6）。濃度為2×10?11 mol/L及以上時(shí)，根尖向地性角度與對(duì)照相比有極顯著差異;2，4-eBL濃度為2×10?7 mol/L時(shí)，根尖向地性角度是對(duì)照的43.5%（圖1J）。可見，2，4-eBL對(duì)小白菜初生根向地性有減弱作用。

2.2? 外源施加2，4-eBL對(duì)小白菜初生根不對(duì)稱生長(zhǎng)的影響

無(wú)論是光照培養(yǎng)還是暗培養(yǎng)，外源施加2，4-eBL能誘導(dǎo)小白菜初生根不對(duì)稱生長(zhǎng)形成卷曲。光培養(yǎng)下，2，4-eBL濃度為0時(shí)，初生根卷曲的曲率是（0.17±0.03）mm1，卷曲比例為（3.3± 2.9）%;當(dāng)濃度為2×1013 mol/L時(shí)，卷曲的比例為

A～D：光照培養(yǎng)3 d（A～D對(duì)應(yīng)2，4-eBL濃度分別為0、2×10?11、2×10?9、2×10?7 mol/L）;E～H：黑暗培養(yǎng)3 d（E～H對(duì)應(yīng)2，4-eBL濃度分別為0、2×10?11、2×10?9、2×10?7 mol/L）;I：光培養(yǎng)3 d初生根向地性角度;J：暗培養(yǎng)3 d初生根向地性角度;

比例尺：1 cm。*表示與對(duì)照相比存在顯著差異（p<0.05）;**表示與對(duì)照相比存在極顯著差異（p<0.01）。

（12.97±3.23）%，是對(duì)照的3.89倍，具有極顯著差異（p<0.01）。對(duì)于初生根卷曲曲率而言，當(dāng)濃度小于2×10?10 mol/L時(shí)，初生根卷曲曲率隨著2，4-eBL濃度的升高緩慢上升，當(dāng)濃度大于2×10?10 mol/L時(shí)，初生根卷曲曲率隨著2，4-eBL濃度的升高迅速上升。對(duì)于初生根卷曲比例而言，當(dāng)濃度小于2×10?9 mol/L時(shí)，初生根卷曲比例隨著2，4-eBL濃度的升高緩慢上升，當(dāng)濃度大于2×10?9 mol/L時(shí)，初生根卷曲比例隨著2，4-eBL濃度的升高迅速上升;當(dāng)濃度為2×10?7 mol/L時(shí)卷曲的曲率和比例達(dá)到最大值，分別為（0.65± 0.06）mm1和（95±5）%，是對(duì)照的3.82和28.53倍（圖2A～圖2F、圖3C、圖3E）。暗培養(yǎng)下，2，4-eBL濃度為0時(shí)，初生根卷曲的曲率是（0.20±0.04）mm1，卷曲比例為（3.7±3.2）%;2，4-eBL濃度為2×10?10 mol/L時(shí)，根卷曲的曲率為（0.24± 0.04）mm1，是對(duì)照的1.2倍，差異顯著（p<0.05）;而卷曲比例為（24.57±1.87）%，是對(duì)照的6.59倍，差異極顯著;當(dāng)濃度小于2×10?9 mol/L時(shí)，初生根卷曲曲率和卷曲比例隨著2，4-eBL濃度的升高緩慢上升，當(dāng)濃度大于2×10?9 mol/L時(shí)，初生根卷曲曲率和卷曲比例隨著2，4-eBL濃度的升高迅速上升;濃度為2×10?7 mol/L時(shí)卷曲的曲率和比例達(dá)到最大值，分別為（0.76±0.14）mm1和（98.23± 3.01）%，是對(duì)照的3.80和26.34倍，有極顯著差異（圖2G～圖2L、圖3D、圖3F）。

2，4-eBL對(duì)小白菜幼苗初生根長(zhǎng)度也具有一定的影響。光培養(yǎng)下，2，4-eBL濃度為0時(shí)，初生根長(zhǎng)為（55.2±17.9）mm;當(dāng)濃度為2×10?7 mol/L時(shí)，初生根長(zhǎng)為（23.63±11.39）mm，是對(duì)照的42.8%，根長(zhǎng)明顯縮短，差異極顯著（圖3A）。暗培養(yǎng)下，2，4-eBL濃度為0時(shí)，初生根長(zhǎng)為（67.1±17.7）mm;2，4-eBL濃度為2×10?13 mol/L時(shí)，初生根長(zhǎng)為（94.26±27.82）mm，是對(duì)照的1.4倍，差異顯著;濃度為2×10?12 mol/L時(shí)，初生根長(zhǎng)為（87.35± 15.13）mm，是對(duì)照的1.3倍，差異極顯著;濃度為2×10?8～2×10?7 mol/L時(shí)，初生根長(zhǎng)分別為（50.47±7.57）mm和（37.86±11.68）mm，是對(duì)照的75.2%和56.4%，差異均極顯著（圖3B）。濃度相同的2，4-eBL暗培養(yǎng)下初生根長(zhǎng)普遍大于光培養(yǎng)（圖3A、圖3B）?？梢姡?，4-eBL可誘導(dǎo)小白菜初生根發(fā)生不對(duì)稱生長(zhǎng)以及能影響初生根的根長(zhǎng)。

3? 討論

BRs能夠影響植物的光形態(tài)建成[25]。為了探究光照是否參與了BRs導(dǎo)致的根不對(duì)稱生長(zhǎng)，本試驗(yàn)通過(guò)外源添加不同濃度2，4-eBL，分別在光暗2種培養(yǎng)條件下，觀察小白菜初生根生長(zhǎng)狀況。

當(dāng)2，4-eBL濃度為0時(shí)，小白菜主根也會(huì)出現(xiàn)極少量（<4%）卷曲現(xiàn)象。Mullen等[26]發(fā)現(xiàn)重力刺激和根的接觸刺激可以使擬南芥初生根發(fā)生卷曲或彎曲現(xiàn)象。Jiang等[27]發(fā)現(xiàn)水稻根接觸到培養(yǎng)瓶的底部時(shí)，主根會(huì)發(fā)生卷曲，如果培養(yǎng)瓶中

A～F： 光照培養(yǎng)8 d（A～F所對(duì)應(yīng)的2，4-eBL濃度分別為0、2×10?11、2×10?10、2×10?9、2×10?8、2×10?7 mol/L）;G～L：

黑暗培養(yǎng)8 d（G～L所對(duì)應(yīng)的2，4-eBL濃度分別為0、2×10?11、2×10?10、2×10?9、2×10?8、2×10?7 mol/L）。比例尺：1 cm。

的介質(zhì)足夠深以致主根不能接觸瓶底，主根不會(huì)發(fā)生卷曲。楊文等[23]發(fā)現(xiàn)接觸刺激可使2，4-eBL處理的水稻初生根發(fā)生不對(duì)稱生長(zhǎng)的比例顯著上升。由此可見，接觸刺激對(duì)根的不對(duì)稱生長(zhǎng)具重要作用。

BRs能使單子葉植物初生根發(fā)生不對(duì)稱生長(zhǎng)，楊文等[22]發(fā)現(xiàn)2，4-eBL能夠使水稻初生根發(fā)生不對(duì)稱生長(zhǎng)形成卷曲和波浪形彎曲，當(dāng)2，4-eBL濃度為2×10?13～2×10?9 mol/L時(shí)根發(fā)生不對(duì)稱生長(zhǎng)的比例與對(duì)照無(wú)顯著差異，當(dāng)2，4-eBL濃度達(dá)到2×10?8～2×10?7 mol/L根不對(duì)稱生長(zhǎng)比例開始增大，且均與對(duì)照相比有極顯著差異。而本文也研究了濃度分別為0、2×10?13、2×10?12、2×10?11、2×10?10、2×10?9、2×10?8、2×10?7 mol/L的2，4-eBL對(duì)小白菜初生根不對(duì)稱生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)濃度越高，小白菜初生根不對(duì)稱生長(zhǎng)越明顯?？梢夿Rs不論是對(duì)單子葉植物還是雙子葉植物，都能夠誘導(dǎo)其根發(fā)生不對(duì)稱生長(zhǎng)。

除BRs之外，乙烯（Ethylene， Eth）和茉莉酸（Jasmonic acid， JA）也能夠誘導(dǎo)植物根發(fā)生不對(duì)稱生長(zhǎng)。Woods等[28]發(fā)現(xiàn)外源施加不同濃度的Eth可以誘導(dǎo)番茄幼苗根發(fā)生卷曲，卷曲程度取決于Eth濃度，并且添加銀離子能阻止此現(xiàn)象的發(fā)生。Cai等[24]發(fā)現(xiàn)2，4-eBL誘導(dǎo)水稻初生根不對(duì)稱生長(zhǎng)的作用能被Eth抑制劑氨基氧乙酸（amino oxyacetic acid， AOA）、CoCl2和銀離子抑制，從而證明Eth可參與油菜素內(nèi)酯調(diào)控的水稻初生根不對(duì)稱生長(zhǎng)。Jiang等[27]報(bào)道自然生長(zhǎng)的野生型水稻初生根不會(huì)發(fā)生卷曲，當(dāng)外源施加0.1 μmol/L JA時(shí)，可誘導(dǎo)5%的初生根卷曲，0.5 μmol/L JA能誘導(dǎo)10%的水稻根發(fā)生卷曲。然而BRs在誘導(dǎo)雙子葉植物根發(fā)生不對(duì)稱生長(zhǎng)的過(guò)程與Eth和JA是否存在聯(lián)系還有待進(jìn)一步研究。

BRs還能影響初生根的向地性反應(yīng)以及根長(zhǎng)。Kim等[29]發(fā)現(xiàn)BRs在功能上與生長(zhǎng)素（Auxin， IAA）結(jié)合調(diào)控植物根部向重力性。不同濃度的BL對(duì)玉米根的向地性影響不同，BL濃度范圍在10?9～10?5 mol/L時(shí)，會(huì)增強(qiáng)根的向地性。在濃度為10?7 mol/L時(shí)向地性角度達(dá)到最大值[19]。而本文研究了濃度為0、2×10?11、2×10?9、2×10?7 mol/L 2，4-eBL對(duì)小白菜初生根向地性反應(yīng)的影響，結(jié)果表明在這些濃度下，BRs對(duì)向地性反應(yīng)有減弱作用。且2，4-eBL濃度為2×10?11、2×10?9、2×10?7 mol/L時(shí)，小白菜初生根的向地性角度逐漸減小，而不對(duì)稱生長(zhǎng)的程度逐漸增大。根的向地性與不對(duì)稱生長(zhǎng)之間有何種聯(lián)系還不得而知。

參考文獻(xiàn)

Grove M D， Spencer G F， Rohwedder W K， et al. Brassinolide， a plant growth-promoting steroid isolated from Brassica napus pollen[J]. Nature， 1979， 281（5728）： 216-217.

Oklestkova J， Rárová L， Kvasnica M， et al. Brassinosteroids： synthesis and biological activities[J]. Phytochemistry Reviews， 2015， 14（6）： 1053-1072.

Fujioka S， Yokota T. Biosynthesis and metabolism of brassinosteroids[J]. Physiologia Plantarum， 1997， 100（3）： 137- 164.

Russinova E. Plants grow on Brassinosteroids[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2011， 14（5）： 530.

徐? 曼， 齊天明， 黃立濤， 等. 油菜素內(nèi)酯對(duì)高羊茅種苗萌發(fā)生長(zhǎng)的影響[J]. 生物化工， 2017， 3（4）： 17-19.

劉? 靈， 李海航， 楊麗霞， 等. 油菜素內(nèi)酯促進(jìn)綠豆下胚軸不定根發(fā)生研究[J]. 科技導(dǎo)報(bào)， 2007， 25（5）： 56-60.

Gupta A， Singh M， Laxmi A. Interaction between glucose and brassinosteroid during the regulation of lateral root development in Arabidopsis[J]. Plant Physiology， 2015， 168（1）： 307-320.

Wei Z， Li J. Brassinosteroids regulate root growth， Development， and Symbiosis[J]. Molecular Plant， 2016， 9（1）： 86.

Li L， Xu J， Xu Z H， et al. Brassinosteroids stimulate plant tropisms through modulation of polar auxin transport in Brassica and Arabidopsis[J]. Plant Cell， 2005， 17（10）： 2738.

Müssig C， Shin G H， Altmann T. Brassinosteroids promote root growth in Arabidopsis[J]. Plant Physiology， 2003， 133（3）： 1261-1271.

Yokota T， Sato T， Takeuchi Y， et al. Roots and shoots of tomato produce 6-deoxo-28-norcathasterone， 6-deoxo-28- nort yph asterol and 6-deoxo-28-norcastasterone， possible precursors of 28-norcastasterone[J]. Phytochemistry， 2001， 58（2）： 233-238.

Nomura T， Bishop G J， Koncz C， et al. Regulation of transcript levels of the Arabidopsis cytochrome P450 genes involved in brassinosteroid biosynthesis[J]. Plant Physiology， 2002， 130（1）： 504-513.

Shimada Y， Goda H， Nakamura A， et al. Organ-specific expression of brassinosteroid-biosynthetic genes and distribution of endogenous brassinosteroids in Arabidopsis[J]. Plant Physiology， 2003， 131（1）： 287-297.

Vragovi? K， Sela A， Friedlander-Shani L， et al. Translatome analyses capture of opposing tissue-specific brassinosteroid signals orchestrating root meristem differentiation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2015， 112（3）： 923-928.

Roddick J G， Guan M. Brassinosteroids and root development[C]//ACS Symposium Series， 1991（474）： 231-245.

Sasse J M. Recent progress in brassinosteroid research[J]. Physiologia Plantarum， 1997， 100（3）： 696-701.

Konishi H， Komatsu S. A proteomics approach to investigating promotive effects of brassinolide on lamina inclination and root growth in rice seedlings[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin， 2003， 26（4）： 401-408.

Hacham Y， Holland N， Butterfield C， et al. Brassinosteroid perception in the epidermis controls root meristem size[J]. Development， 2011， 138（5）： 839-848.

Soochul S K， Eunjoo L， Woosook C， et al. Involvement of brassinosteroids in the gravitropic response of primary root of maize[J]. Plant Physiology， 2000， 123（3）： 997-1004.

Kim T W， Lee S M， Joo S H， et al. Elongation and gravitropic responses of Arabidopsis roots are regulated by brassinolide and IAA[J]. Plant Cell & Environment， 2007， 30（6）： 679-689.

李焜章， 李學(xué)真. 雙子葉植物和單子葉植物的基本區(qū)別[J]. 生物學(xué)通報(bào)， 1988（1）： 18-19.

楊? 文， 蔡澤坪， 于旭東， 等. 生長(zhǎng)素抑制油菜素內(nèi)酯導(dǎo)致的水稻根不對(duì)稱生長(zhǎng)[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2018， 39（7）： 1304-1310.

楊? 文， 于旭東， 蔡澤坪， 等. 接觸刺激在水稻根不對(duì)稱生長(zhǎng)中的作用研究[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2018， 39（9）： 18-23.

Cai Z P， Yang W， Zhang H Y， et al. Ethylene participates in the brassinolide-regulated asymmetric growth of O. sativa root[J]. South African Journal of Botany， 2018（119）： 86-93.

Karnachuk R A， Golovatskaya I F， Efimova M V， et al. The effect of epibrassinolide on Arabidopsis seedling morphogenesis and hormonal balance under green light[J]. Russian Journal of Plant Physiology， 2002， 49（4）： 530-533.

Mullen J L， Turk E， Johnson K， et al. Root-growth behavior of the Arabidopsis mutant rgr1. Roles of gravitropism and circumnutation in the waving / coiling phenomenon[J]. Plant Physiology， 1998， 118（4）： 1139-1145.

Jiang J， Li J， Xu Y， et al. RNAi knockdown of Oryza sativa root meander curling gene led to altered root development and coiling which were mediated by jasmonic acid signalling in rice[J]. Plant Cell & Environment， 2007， 30（6）： 690-699.

Woods S L， Roberts J A， Taylor I B. Ethylene-induced root coiling in tomato seedlings[J]. Plant Growth Regulation， 1984， 2（3）： 217-225.

Kim S K， Chang S C， Lee E J， et al. Involvement of brassinosteroids in the gravitropic response of primary root of maize [J]. Plant Physiology， 2000， 123（3）： 997-1004.