曹璐 付影 于旭東 蔡澤坪 羅佳佳 湯竹
摘? 要? 油菜素內(nèi)酯(Brassinolide,BL)能誘導單子葉植物初生根發(fā)生不對稱生長,而在雙子葉植物中還未見報道。本試驗通過外源施加不同濃度2,4-表油菜素內(nèi)酯(2,4-Epibrassinolide,2,4-eBL)觀察小白菜(Brassica chinensis L.)初生根生長狀況。結(jié)果表明:2,4-eBL能誘導小白菜初生根發(fā)生不對稱生長形成卷曲。隨著2,4-eBL濃度的升高,根卷曲比例和曲率逐漸增大,同時向地性逐漸降低。試驗發(fā)現(xiàn)外源施加2,4-eBL可誘導雙子葉植物根不對稱生長的現(xiàn)象,為研究油菜素甾醇(Brassinosteroids,BRs)在根生長發(fā)育中的作用提供新途徑。
關(guān)鍵詞? 2,4-表油菜素內(nèi)酯;小白菜;初生根;不對稱生長;向地性
中圖分類號? Q945.32? ? ?文獻標識碼? A
1979年Grove等[1]首次從歐洲油菜(Brassica napus L.)花粉中分離出油菜素內(nèi)酯(Brassinolide, BL),至今已分離鑒定出70多種多羥基甾醇衍生物,統(tǒng)稱油菜素甾醇(Brassinosteroids, BRs)[2]。在所有BRs中BL的生物活性最高[3-4]。BRs在根中合成并調(diào)控根的生長發(fā)育,影響根的伸長、不定根發(fā)生、側(cè)根發(fā)育、根毛形成、根尖重力反應等[5-9]。
BRs在植物體各器官中的分布存在顯著差異,尤其在根中的含量甚微,從而導致其在根中的發(fā)現(xiàn)晚于下胚軸及植物體的其它部位。與此對應的是,根對BRs的反應要比植物體的其他部位敏感得多[10]。BRs最早的分離提純來自于玉米(Zea mays),隨后相繼在擬南芥(Arabidopsis thaliana)、豌豆(Pisum sativum)和西紅柿(Lycopersicon esculentum)的根中被發(fā)現(xiàn)[11-13]。研究證明BRs在調(diào)控根端分生組織(root apical meristem,RAM)分化以及根伸長的過程中扮演著重要角色[14]。在擬南芥中,BRs在極低濃度下(≤0.1 nmol/L)促進根的伸長[10],而在高濃度下(≥10 nmol/L)抑制[15-17]。BRs合成或信號受阻均會導致RAM變小和根長縮短[18]。BRs還在影響根的向地性上起關(guān)鍵作用,Soochul等[19]和Kim等[20]發(fā)現(xiàn)BRs可以增加玉米、擬南芥等不同物種主根的向地性曲率。在玉米中,當BL濃度為107 mol/L時向地性角度達到最大值;而在擬南芥中,當BL濃度為10?10~10?7 mol/L時,根向地性逐漸增強。
雙子葉和單子葉植物根存在一定區(qū)別。其中,大多雙子葉植物根為定根、根系為直根系,而單子葉植物根為不定根、根系為須根系[21]。BRs能夠誘導單子葉須根系植物水稻(Oryza sativa)幼苗初生根發(fā)生不對稱生長形成卷曲(coiling)和波浪形彎曲(wave)[22-24]。然而,關(guān)于BRs誘導雙子葉直根系植物初生根不對稱生長的研究還未見報道。本研究用2,4-表油菜素內(nèi)酯(2,4- Epibrassinolide,2,4-eBL)處理雙子葉直根系植物小白菜(Brassica chinensis L.),探究2,4-eBL調(diào)控小白菜根不對稱生長、減弱初生根向地性的現(xiàn)象,為植物激素對根生長的研究提供新的見解。
1? 材料與方法
1.1? 材料
小白菜(Brassica chinensis L.)種子購自蔬菜物資公司,商品名稱為綠領(lǐng)四月慢。2,4-eBL(code E-1641)購自sigma公司,用75%乙醇溶解并配制成1 mmol/L母液。
1.2? 方法
1.2.1? 種子滅菌? 選擇飽滿且不開裂的種子,自來水浸泡30 min,在超凈工作臺上依次用75%乙醇和0.1%升汞分別浸泡30 s和7 min,無菌水浸洗5遍。
1.2.2? 初生根向地性角度的測量? 在超凈工作臺上,將滅好菌的小白菜種子接入2,4-eBL濃度梯度分別為0、2×10?11、2×10?9、2×10?7 mol/L的MS固體培養(yǎng)基中。每只試管接種1粒種子,重復10次,并于第3天測量初生根的向地性角度。
1.2.3? 初生根主根長、曲率和卷曲比例的測量? 在超凈工作臺上,將滅好菌的小白菜種子接入2,4-eBL濃度梯度分別為0、2×10?13、2×10?12、2×10?11、2×10?10、2×10?9、2×10?8、2×10?7 mol/L的MS固體培養(yǎng)基中。每瓶接種10粒種子,重復6次。第8 d測量主根長、曲率和卷曲比例。
1.2.4? 培養(yǎng)條件? 以上均為光照和黑暗培養(yǎng),光照培養(yǎng)條件為:溫度(25±2)℃,光強1000 lx,光周期為光照16 h/d,黑暗8 h/d;暗培養(yǎng)條件為:溫度(25±2)℃,黑暗24 h/d。
1.3? 數(shù)據(jù)分析
根長、曲率和向地性角度均采用Image J v1.50i軟件(https://imagej.nih.gov/ij/index.html)測量。實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和分析均采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件,采用LSD檢驗和Duncan法進行數(shù)據(jù)差異顯著性多重比較。
2? 結(jié)果與分析
2.1? 外源施加2,4-eBL對小白菜初生根向地性的影響
無論是光照培養(yǎng)還是暗培養(yǎng),2,4-eBL對小白菜初生根向地性的作用2~3 d便能表現(xiàn)出來。濃度大于2×10?11 mol/L時,隨著2,4-eBL濃度的升高,根尖向地性角度減小(圖1A~圖1H)。光培養(yǎng)下,2,4-eBL濃度為0時,根尖向地性角度為(70.9±10.4);濃度為2×10?11 mol/L時,根尖向地性角度與對照相比有顯著差異;濃度為2×10?9 mol/L時,根尖向地性角度與對照相比有極顯著差異;濃度為2×10?7 mol/L時,根尖向地性角度是對照的38.6%,有極顯著差異(圖1I)。暗培養(yǎng)下,2,4-eBL濃度為0時,根尖向地性角度為(74.4±10.6)。濃度為2×10?11 mol/L及以上時,根尖向地性角度與對照相比有極顯著差異;2,4-eBL濃度為2×10?7 mol/L時,根尖向地性角度是對照的43.5%(圖1J)??梢姡?,4-eBL對小白菜初生根向地性有減弱作用。
2.2? 外源施加2,4-eBL對小白菜初生根不對稱生長的影響
無論是光照培養(yǎng)還是暗培養(yǎng),外源施加2,4-eBL能誘導小白菜初生根不對稱生長形成卷曲。光培養(yǎng)下,2,4-eBL濃度為0時,初生根卷曲的曲率是(0.17±0.03)mm1,卷曲比例為(3.3± 2.9)%;當濃度為2×1013 mol/L時,卷曲的比例為
A~D:光照培養(yǎng)3 d(A~D對應2,4-eBL濃度分別為0、2×10?11、2×10?9、2×10?7 mol/L);E~H:黑暗培養(yǎng)3 d(E~H對應2,4-eBL濃度分別為0、2×10?11、2×10?9、2×10?7 mol/L);I:光培養(yǎng)3 d初生根向地性角度;J:暗培養(yǎng)3 d初生根向地性角度;
比例尺:1 cm。*表示與對照相比存在顯著差異(p<0.05);**表示與對照相比存在極顯著差異(p<0.01)。
(12.97±3.23)%,是對照的3.89倍,具有極顯著差異(p<0.01)。對于初生根卷曲曲率而言,當濃度小于2×10?10 mol/L時,初生根卷曲曲率隨著2,4-eBL濃度的升高緩慢上升,當濃度大于2×10?10 mol/L時,初生根卷曲曲率隨著2,4-eBL濃度的升高迅速上升。對于初生根卷曲比例而言,當濃度小于2×10?9 mol/L時,初生根卷曲比例隨著2,4-eBL濃度的升高緩慢上升,當濃度大于2×10?9 mol/L時,初生根卷曲比例隨著2,4-eBL濃度的升高迅速上升;當濃度為2×10?7 mol/L時卷曲的曲率和比例達到最大值,分別為(0.65± 0.06)mm1和(95±5)%,是對照的3.82和28.53倍(圖2A~圖2F、圖3C、圖3E)。暗培養(yǎng)下,2,4-eBL濃度為0時,初生根卷曲的曲率是(0.20±0.04)mm1,卷曲比例為(3.7±3.2)%;2,4-eBL濃度為2×10?10 mol/L時,根卷曲的曲率為(0.24± 0.04)mm1,是對照的1.2倍,差異顯著(p<0.05);而卷曲比例為(24.57±1.87)%,是對照的6.59倍,差異極顯著;當濃度小于2×10?9 mol/L時,初生根卷曲曲率和卷曲比例隨著2,4-eBL濃度的升高緩慢上升,當濃度大于2×10?9 mol/L時,初生根卷曲曲率和卷曲比例隨著2,4-eBL濃度的升高迅速上升;濃度為2×10?7 mol/L時卷曲的曲率和比例達到最大值,分別為(0.76±0.14)mm1和(98.23± 3.01)%,是對照的3.80和26.34倍,有極顯著差異(圖2G~圖2L、圖3D、圖3F)。
2,4-eBL對小白菜幼苗初生根長度也具有一定的影響。光培養(yǎng)下,2,4-eBL濃度為0時,初生根長為(55.2±17.9)mm;當濃度為2×10?7 mol/L時,初生根長為(23.63±11.39)mm,是對照的42.8%,根長明顯縮短,差異極顯著(圖3A)。暗培養(yǎng)下,2,4-eBL濃度為0時,初生根長為(67.1±17.7)mm;2,4-eBL濃度為2×10?13 mol/L時,初生根長為(94.26±27.82)mm,是對照的1.4倍,差異顯著;濃度為2×10?12 mol/L時,初生根長為(87.35± 15.13)mm,是對照的1.3倍,差異極顯著;濃度為2×10?8~2×10?7 mol/L時,初生根長分別為(50.47±7.57)mm和(37.86±11.68)mm,是對照的75.2%和56.4%,差異均極顯著(圖3B)。濃度相同的2,4-eBL暗培養(yǎng)下初生根長普遍大于光培養(yǎng)(圖3A、圖3B)。可見,2,4-eBL可誘導小白菜初生根發(fā)生不對稱生長以及能影響初生根的根長。
3? 討論
BRs能夠影響植物的光形態(tài)建成[25]。為了探究光照是否參與了BRs導致的根不對稱生長,本試驗通過外源添加不同濃度2,4-eBL,分別在光暗2種培養(yǎng)條件下,觀察小白菜初生根生長狀況。
當2,4-eBL濃度為0時,小白菜主根也會出現(xiàn)極少量(<4%)卷曲現(xiàn)象。Mullen等[26]發(fā)現(xiàn)重力刺激和根的接觸刺激可以使擬南芥初生根發(fā)生卷曲或彎曲現(xiàn)象。Jiang等[27]發(fā)現(xiàn)水稻根接觸到培養(yǎng)瓶的底部時,主根會發(fā)生卷曲,如果培養(yǎng)瓶中
A~F: 光照培養(yǎng)8 d(A~F所對應的2,4-eBL濃度分別為0、2×10?11、2×10?10、2×10?9、2×10?8、2×10?7 mol/L);G~L:
黑暗培養(yǎng)8 d(G~L所對應的2,4-eBL濃度分別為0、2×10?11、2×10?10、2×10?9、2×10?8、2×10?7 mol/L)。比例尺:1 cm。
的介質(zhì)足夠深以致主根不能接觸瓶底,主根不會發(fā)生卷曲。楊文等[23]發(fā)現(xiàn)接觸刺激可使2,4-eBL處理的水稻初生根發(fā)生不對稱生長的比例顯著上升。由此可見,接觸刺激對根的不對稱生長具重要作用。
BRs能使單子葉植物初生根發(fā)生不對稱生長,楊文等[22]發(fā)現(xiàn)2,4-eBL能夠使水稻初生根發(fā)生不對稱生長形成卷曲和波浪形彎曲,當2,4-eBL濃度為2×10?13~2×10?9 mol/L時根發(fā)生不對稱生長的比例與對照無顯著差異,當2,4-eBL濃度達到2×10?8~2×10?7 mol/L根不對稱生長比例開始增大,且均與對照相比有極顯著差異。而本文也研究了濃度分別為0、2×10?13、2×10?12、2×10?11、2×10?10、2×10?9、2×10?8、2×10?7 mol/L的2,4-eBL對小白菜初生根不對稱生長的影響,發(fā)現(xiàn)濃度越高,小白菜初生根不對稱生長越明顯。可見BRs不論是對單子葉植物還是雙子葉植物,都能夠誘導其根發(fā)生不對稱生長。
除BRs之外,乙烯(Ethylene, Eth)和茉莉酸(Jasmonic acid, JA)也能夠誘導植物根發(fā)生不對稱生長。Woods等[28]發(fā)現(xiàn)外源施加不同濃度的Eth可以誘導番茄幼苗根發(fā)生卷曲,卷曲程度取決于Eth濃度,并且添加銀離子能阻止此現(xiàn)象的發(fā)生。Cai等[24]發(fā)現(xiàn)2,4-eBL誘導水稻初生根不對稱生長的作用能被Eth抑制劑氨基氧乙酸(amino oxyacetic acid, AOA)、CoCl2和銀離子抑制,從而證明Eth可參與油菜素內(nèi)酯調(diào)控的水稻初生根不對稱生長。Jiang等[27]報道自然生長的野生型水稻初生根不會發(fā)生卷曲,當外源施加0.1 μmol/L JA時,可誘導5%的初生根卷曲,0.5 μmol/L JA能誘導10%的水稻根發(fā)生卷曲。然而BRs在誘導雙子葉植物根發(fā)生不對稱生長的過程與Eth和JA是否存在聯(lián)系還有待進一步研究。
BRs還能影響初生根的向地性反應以及根長。Kim等[29]發(fā)現(xiàn)BRs在功能上與生長素(Auxin, IAA)結(jié)合調(diào)控植物根部向重力性。不同濃度的BL對玉米根的向地性影響不同,BL濃度范圍在10?9~10?5 mol/L時,會增強根的向地性。在濃度為10?7 mol/L時向地性角度達到最大值[19]。而本文研究了濃度為0、2×10?11、2×10?9、2×10?7 mol/L 2,4-eBL對小白菜初生根向地性反應的影響,結(jié)果表明在這些濃度下,BRs對向地性反應有減弱作用。且2,4-eBL濃度為2×10?11、2×10?9、2×10?7 mol/L時,小白菜初生根的向地性角度逐漸減小,而不對稱生長的程度逐漸增大。根的向地性與不對稱生長之間有何種聯(lián)系還不得而知。
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