石佩星 李曉芳 解飛翔 張炳文

（1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，藥物化學(xué)與分子診斷教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071002;2.河北大學(xué)藥學(xué)院，藥物質(zhì)量控制河北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071002）

摘要[目的]對(duì)蟲(chóng)生真菌環(huán)鏈棒束孢（Isaria cateniannulata）的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離并研究其抗腫瘤活性。[方法]采用溶劑萃取、硅膠柱色譜、凝膠Sephadex LH-20等方法進(jìn)行分離純化，根據(jù)理化性質(zhì)和波譜技術(shù)對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，利用MTT法對(duì)化合物的抗腫瘤活性進(jìn)行測(cè)試。[結(jié)果]從蟲(chóng)生真菌Isaria cateniannulata中共分離得到8個(gè)化合物，分別為β-麥角甾醇、豆甾-4-烯-3-酮、5α，8β-過(guò)氧-（22E，24R）-麥角甾-6，22-二烯3β-醇、4-methyl-5，6-dihydro-2H-pyran-2-one、（R）-甲羥戊酸內(nèi)酯、對(duì)羥基苯甲醛、β-石竹烯和石竹烯氧化物。除化合物4外，其余化合物均是從該種中首次分離得到?？鼓[瘤結(jié)果顯示，化合物7、8對(duì)腫瘤細(xì)胞具有一定的抑制能力。[結(jié)論]該研究為新的抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)方面提供了廣闊空間。

關(guān)鍵詞蟲(chóng)生真菌;環(huán)鏈棒束孢;倍半萜類(lèi)化合物;抗腫瘤活性;結(jié)構(gòu)鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2019）03-0196-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.061

環(huán)鏈棒束孢（Isaria cateinannulata）是棒束孢屬中的一種非常重要的蟲(chóng)生病原菌，而且在自然界中分布廣泛[1]。對(duì)該屬的研究主要以玫煙色棒束孢和粉棒束孢為主，而對(duì)環(huán)鏈棒束孢研究較少。到目前為止，對(duì)于環(huán)鏈棒束孢的報(bào)道較多集中在植物病蟲(chóng)害防治領(lǐng)域，朱新燕等[2]對(duì)環(huán)鏈棒束孢不同菌株的固體培養(yǎng)條件進(jìn)行研究;劉愛(ài)英[3]就環(huán)鏈棒束孢對(duì)于幾種昆蟲(chóng)的治病效果進(jìn)行研究，但對(duì)于環(huán)鏈棒束孢的次級(jí)代謝產(chǎn)物的系統(tǒng)研究鮮見(jiàn)報(bào)道。筆者為了尋找新型的具有抗腫瘤活性的化合物，采用溶劑萃取、硅膠柱色譜、凝膠Sephadex LH-20等方法對(duì)蟲(chóng)生真菌環(huán)鏈棒束孢進(jìn)行分離純化，根據(jù)理化性質(zhì)和波譜技術(shù)對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，并利用MTT法對(duì)化合物的抗腫瘤活性進(jìn)行測(cè)試。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1儀器。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-210（瑞士BUCHI公司）;核磁共振儀AM-600（德國(guó)BRUKER公司）;雙層恒溫?fù)u床ZHWY（上海智城分析儀器有限公司）;超凈工作臺(tái)ZHJH-C1112C（上海智城分析儀器有限公司）;薄層層析硅膠板（煙臺(tái)化學(xué)工業(yè)研究所）;柱層析硅膠（200～400目，煙臺(tái)化學(xué)工業(yè)研究所）;Sephadex LH-20（瑞典GE Healthcare公司）。

1.1.2培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基：葡萄糖40 g，去皮土豆400 g，加蒸餾水至2 000 mL，pH 6.5。大米固體培養(yǎng)基：100 mL蒸餾水，80 g大米。

1.1.3

試驗(yàn)菌株。該試驗(yàn)所用菌種為環(huán)鏈棒束孢（Isaria cateniannulata），購(gòu)自安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，保存于河北大學(xué)藥物化學(xué)與分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種庫(kù)。

1.1.4

供試腫瘤細(xì)胞株。人肝癌細(xì)胞（Huh-7）、人宮頸癌細(xì)胞（Hela）、人胃癌細(xì)胞（MGC-803）、人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）以及人肺癌細(xì)胞（A549）在-196 ℃液氮中凍存。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1

發(fā)酵與分離。將Isaria cateniannulata菌種接種到PDA液體培養(yǎng)基中，于26 ℃、150 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)6 d，得到3 L種子液。將3 L種子液以10%的接種量接種到大米培養(yǎng)基中（共30 L），室溫培養(yǎng)30 d，得到固體發(fā)酵物。

將Isaria cateniannulata的大米發(fā)酵物收集，以1.5倍的體積加入乙酸乙酯萃取，每次浸泡48 h，共萃取6次，合并萃取液，減壓濃縮得到浸膏107 g。將107 g浸膏與等體積硅膠拌勻，室溫下干燥。進(jìn)行加壓柱層析，用石油醚/乙酸乙酯系統(tǒng)梯度洗脫[100∶0、20∶1、15∶1、10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1（V/V）]，經(jīng)TCL檢測(cè)之后合并，得到Fr1～Fr5共5個(gè)部分。經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析、Sephadex LH-20凝膠過(guò)濾、薄層TLC制備以及重結(jié)晶后得到化合物1～8。

1.2.2

活性篩選。將5個(gè)細(xì)胞株取出，置于37 ℃水浴鍋復(fù)蘇，待其解凍后吸出細(xì)胞懸液分別放入4個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入細(xì)胞培養(yǎng)液。置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)3次，每3 d傳代一次，使細(xì)胞恢復(fù)健康狀態(tài)。胰酶消化細(xì)胞：用3 mL PBS清洗一次細(xì)胞，然后加入1 mL胰酶，37 ℃孵育1～3 min，終止消化。在96孔板中每孔接種100 μL，其含有8 000個(gè)細(xì)胞。第2天，觀察細(xì)胞密度，待細(xì)胞培養(yǎng)至匯合率80%左右，加藥處理。分別將化合物7、8母液進(jìn)行梯度式稀釋?zhuān)靠准尤? μL各濃度樣品稀釋液，使其作用濃度分別為100.00、50.00、25.00、12.50、6.25 μL，每組設(shè)3個(gè)平行，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。樣品處理細(xì)胞24 h，避光每孔均加入20 μL MTT溶液。37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，然后每孔加入100 μL SDS-HCl，孵育過(guò)夜。在酶標(biāo)儀SpectraMax M2上測(cè)試各孔570 nm的吸光度值。

抑制率=[（對(duì)照組OD570-樣品處理組OD570）/對(duì)照組OD570]×100%，根據(jù)寇式改良公式計(jì)算各個(gè)樣品相應(yīng)細(xì)胞株的IC50，即死亡細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞之比為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的樣品濃度。

2結(jié)果與分析

2.1結(jié)構(gòu)鑒定該試驗(yàn)通過(guò)對(duì)Isaria cateniannulata進(jìn)行大米發(fā)酵培養(yǎng)，從其乙酸乙酯的萃取物中共分離到8個(gè)化合物，分別為化合物1（62.7 mg）、化合物2（22.7 mg）、化合物3（11.2 mg）、化合物4（9.7 mg）、化合物5（13.3 mg）、化合物6（21.5 mg）、化合物7（11.4 mg）、化合物8（2.2 mg）?；衔锏慕Y(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

2.2活性測(cè)試結(jié)果

對(duì)從蟲(chóng)生真菌中分離得到的化合物7、8利用MTT法進(jìn)行抗腫瘤活性測(cè)試。測(cè)試細(xì)胞分別為人胃癌細(xì)胞（MGC-803）、人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）、人肝癌細(xì)胞（Huh-7）、人宮頸癌細(xì)胞（Hela）和人肺癌細(xì)胞（A549），試驗(yàn)結(jié)果如表1。從表1可以看出，化合物7對(duì)A549的半抑制濃度值（IC50）為80.44 μg/mL，表明化合物7對(duì)A549有一定的抑制作用;化合物8對(duì)MGC-803、MCF-7、Huh-7和Hela的IC50值分別為54.88、84.21、61.94、72.99 μg/mL，表明化合物8對(duì)Huh-7、Hela、MGC-803和MCF-7具有一定的抑制能力，但抑制能力較弱。

3結(jié)論

該研究對(duì)蟲(chóng)生真菌環(huán)鏈棒束孢Isaria cateniannulata的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離鑒定，共分離鑒定出8種化合物，分別為β-麥角甾醇、豆甾-4-烯-3-酮、5α，8β-過(guò)氧-（22E，24R）-麥角甾-6，22-二烯3β-醇、4-methyl-5，6-dihydro-2H-pyran-2-one、（R）-甲羥戊酸內(nèi)酯、對(duì)羥基苯甲醛、β-石竹烯和石竹烯氧化物，其中8種化合物均為首次從該種中分離得到。對(duì)化合物7、8進(jìn)行抗腫瘤活性測(cè)試，結(jié)果顯示，化合物7對(duì)A549具有一定的抑制能力，化合物8對(duì)Huh-7、Hela、MGC-803和MCF-7具有一定的抑制能力，但是抑制能力均較弱。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2019年

參考文獻(xiàn)

[1] 張德龍，王小董，陸瑞利，等.液體或固體培養(yǎng)對(duì)環(huán)鏈棒束孢（Isaria cateinannulata）菌絲體中揮發(fā)性成分組成的影響[J].微生物學(xué)報(bào)，2011，51（12）：1616-1624.

[2] 朱新燕，李增智，樊美珍，等.3株環(huán)鏈擬青霉固體培養(yǎng)條件的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，35（1）：38-41.

[3] 劉愛(ài)英，陳月碧，梁宗琦，等.環(huán)鏈擬青霉和玫煙色擬青霉對(duì)菜青蟲(chóng)致病條件的研究[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，1982（1）：57-59.

[4] 萬(wàn)輝.褐圓孔牛肝菌化學(xué)成分的研究[J].中草藥，2000，31（5）：328-330.

[5] 李小軍，袁燕，李芝，等.苗藥冠蓋藤的化學(xué)成分研究[J].中草藥，2014，45（8）：1052-1055.

[6] 和東陽(yáng)，王利勤.神黃豆果實(shí)化學(xué)成分的研究[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2014，31（11）：1355-1359.

[7] YING Y M，ZHANG L W，SHAN W G，et al.Secondary metabolites of Peyronellaea sp.XW-12，an endophytic fungus of Huperzia serrata[J].Chem Nat Compd，2014，50（4）：723-725.

[8] 胡琳，丁智慧，劉吉開(kāi).灰黑擬牛肝菌的化學(xué)成分[J].云南植物研究，2002，24（5）：667-670.

[9] RAGASA C Y，ESPINEI D L，AGOO E M G，et al.Chemical constituents of Cinnamomum cebuense[J].Chin J Nat Med，2013，11（3）：264-268.

[10] RAGASA C Y，GANZON J，HOFILEA J，et al.A new furanoid diterpene from Caesalpinia pulcherrima[J].Chem Pharm Bull，2003，51（10）：1208-1210.