周斌+胡秋芬+楊海英+楊新周+牛德云+沈廣劍+來天超+杜剛

摘要：為篩選羥基化多樣性的菌株，對總狀毛霉（Mucor racemosus）生物轉(zhuǎn)化孕酮進行研究。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)HPLC分析，共分離到6個轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，通過NMR、MS及FTIR等手段對孕酮轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu)鑒定。其結(jié)構(gòu)為11α-羥基孕酮（1）；15α-羥基孕酮（2）；11α， 15β-二羥基孕酮（3）；6β， 11α-二羥基孕酮（4）；7β，15β-二羥基孕酮（5）；1-脫氫11α-羥基孕酮（6）。研究結(jié)果表明，總狀毛霉轉(zhuǎn)化孕酮的衍生物具有豐富的多樣性。

關(guān)鍵詞：生物轉(zhuǎn)化；總狀毛霉（Mucor racemosus）；孕酮；結(jié)構(gòu)鑒定

中圖分類號：O621.3 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）03-0666-03

1952年Murray等[1]利用黑根霉轉(zhuǎn)化孕酮得到11α-羥基孕酮， 并在甾體工業(yè)中大規(guī)模應(yīng)用，由此微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在甾體藥物生產(chǎn)中的重要性被廣泛認(rèn)識。而甾體化合物的羥基化是微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)應(yīng)用的主要方面。羥基化反應(yīng)是甾體化合物生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中最重要的反應(yīng)，由于甾體母核上4個環(huán)上有多個次甲基，用化學(xué)法進行羥基化很難區(qū)分，不能反應(yīng)的區(qū)域選擇性及對映體選擇性，微生物能夠?qū)Ｒ坏卦阽摅w母核或側(cè)鏈上引入一個或多個羥基，羥基化改變了甾體的極性，進而影響其毒性、細胞分泌及藥物分布，從而產(chǎn)生不同的藥效，并可應(yīng)用于甾體藥物工業(yè)生產(chǎn)[2]。甾體化合物的羥基化是微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)應(yīng)用的主要內(nèi)容，已有較多的文獻報道[3-6]。

篩選優(yōu)良菌株、發(fā)掘新的生物催化劑是發(fā)展我國甾體工業(yè)的重要課題。而尋找羥基化多樣性豐富的菌株，可產(chǎn)生多種羥基化衍生物，在甾體藥物研發(fā)中會起到事半功倍的作用。已有總狀毛霉（Mucor racemosus）轉(zhuǎn)化甾體化合物的報道[7-11]，但未見轉(zhuǎn)化孕酮的研究。本研究以實驗室保藏總狀毛霉菌株對孕酮進行了生物轉(zhuǎn)化研究，篩選轉(zhuǎn)化甾體化合物的催化系統(tǒng)，將來可進一步用于轉(zhuǎn)化其它的甾體藥物及藥物中間體，為該菌株在開發(fā)甾體藥物中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

孕酮購自江蘇省鹽城信誼醫(yī)藥化工有限公司，經(jīng)NMR及HPLC檢測純度超過98%。

1.2 微生物菌株

總狀毛霉為實驗室保藏菌株，分離自重樓根狀莖。

1.3 粗提物制備

轉(zhuǎn)化用發(fā)酵培養(yǎng)基含3 g/L NaNO3、1 g/L K2HPO4、0.5 g/L MgSO4·7H2O、0.5 g/L KCl、0.01 g/L FeSO4·7H2O、30 g/L蔗糖、孕酮1.0 g/L（pH 6.5），孕酮加少量乙酸乙酯溶解，再加4 g/L吐溫80混勻，加水形成乳濁液加入1 L培養(yǎng)基。250 mL 錐形瓶裝入100 mL發(fā)酵液，共發(fā)酵10 L。于28 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)6 d。發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取，菌絲體用甲醇浸泡超聲提取，真空濃縮合并得到粗提物。

1.4 HPLC分析

取0.1 g粗提物，加入1 mL甲醇溶解，用0.25 μm濾膜過濾。色譜柱，Agilent ZORAX SB-C18柱（4.6 cm×150 mm，5 μm）；檢測器，二級管陣列檢測器；流動相，甲醇-水（60/40，V/V）；流速，1.0 mL/min；檢測波長，244 nm；柱溫，40 ℃；進樣量，5 μL。通過峰面積積分對各轉(zhuǎn)化產(chǎn)物產(chǎn)率進行計算。

1.5 孕酮轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離純化

正相硅膠（200-300目）∶樣品=8∶1（V/V）裝柱上樣，以石油醚-乙酸乙酯體積比為9∶1-1∶9逐級梯度洗脫，含轉(zhuǎn)化產(chǎn)物組分用半制備型高效液相色譜制備，色譜條件，甲醇∶水=50∶50（V/V），流速為3 mL/min，檢測波長為244 nm，柱溫為40 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)化結(jié)果HPLC分析

由圖1可看出，孕酮基本被轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物極性較大，且種類很豐富。

2.2 孕酮轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分離及結(jié)構(gòu)鑒定

經(jīng)半制備分別得到6個組分：S1、S2、S3、S4、S5、S6。經(jīng)核磁共振、紫外、旋光、熔點檢測，結(jié)構(gòu)鑒定分別為：11α-羥基孕酮（1）； 15α-羥基孕酮（2）；11α，15β-二羥基孕酮（3）；6β，11α-二羥基孕酮（4）；7β，15β-二羥基孕酮（5）；1-脫氫11α-羥基孕酮（6）。

化合物的理化鑒定結(jié)果如下：

（1） 11α-羥基-4-孕甾烯-3， 20-二酮 收率為7.2%；熔點： 165～169 ℃； 1H NMR δ： 5.73 （s， 1H， H-4）， 4.03 （td， 1H， H-11）， 2.55 （m， 1H， H-17）， 0.69 （s， 3H， H-18）， 1.31 （s， 3H， H-19）， 2.13 （s， 3H， H-21）； 13C NMR δ： 37.65 （C-1）， 34.30 （C-2）， 200.31 （C-3）， 124.72 （C-4）， 170.95 （C-5）， 33.70 （C-6）， 31.64 （C-7）， 35.07 （C-8）， 55.47 （C-9）， 40.05 （C-10）， 69.02 （C-11）， 50.58 （C-12）， 44.26 （C-13）， 55.47 （C-14）， 24.36 （C-15）， 23.07 （C-16）， 63.24（C-17），14.62 （C-18）， 18.42 （C-19）， 208.93 （C-20），31.49 （C-21）； MS m/z：353[M+ Na]+。與文獻[12]對照一致。

（2）15α-羥基-4-孕甾烯-3， 20-二酮 收率為9.8%；熔點： 229～233 ℃； 1H NMR δ： 5.74 （s， 1H， H-4）， 4.10 （td， 1H， H-15）， 2.81 （s， 1H， H-17）， 0.69 （s， 3H， H-18）， 1.20 （s， 3H， H-19）， 2.13 （ s， 3H， H-21）； 13C NMR δ： 35.86 （C-1）， 34.07 （C-2）， 199.57 （C-3）， 124.01 （C-4）， 170.81 （C-5）， 32.84 （C-6）， 31.10 （C-7）， 35.32 （C-8）， 53.82 （C-9）， 38.71 （C-10）， 21.00 （C-11）， 38.99 （C-12）， 44.68 （C-13）， 61.00 （C-14）， 73.50 （C-15）， 35.44（C-16）， 62.92 （C-17）， 14.76 （C-18）， 17.60 （C-19）， 208.45 （C-20），31.71（C-21）； MS m/z： 353 [M+Na]+。與文獻[13]對照一致。

（3）11α，15β-二羥基-4-孕甾烯-3， 20-二酮 收率為5.7%；熔點： 230～240 ℃； 1H NMR δ： 5.75 （s， 1H， H-4）， 4.05 （m， 1H， H-11）， 4.32 （m， 1H， H-15）， 2.51 （t， 1H， H-17）， 0.97 （s， 3H， H-18）， 1.35（s， 3H， H-19）， 2.15 （s， 3H， H-21）； 13C NMR δ： 35.92 （C-1）， 34.04 （C-2）， 201.64 （C-3）， 124.15 （C-4）， 173.01 （C-5）， 33.64 （C-6）， 30.62 （C-7）， 31.24 （C-8）， 58.82 （C-9）， 40.20 （C-10）， 68.04 （C-11）， 51.25 （C-12）， 43.82 （C-13）， 59.37 （C-14）， 69.39 （C-15）， 37.25 （C-16）， 63.40 （C-17）， 16.90 （C-18）， 18.08 （C-19）， 209.45 （C-20）， 31.28 （C-21）； MS m/z： 369 [M+Na]+。與文獻[13]對照一致。

（4） 6β，11α-二羥基-4 -孕甾烯-3， 20-二酮 收率為32.8%；熔點： 245～248 ℃； 1H NMR δ： 5.78 （s， 1H， H-4 ）， 2.68 （t， 1H， H-17）， 0.73 （s， 3H， H-18）， 1.49 （s， 3H， H-19）， 2.14 （s， 3H， H-21）， 4.34 （m， 1H， H-6）， 4.09 （m， 1H， H-11）； 13C NMR δ： 37.46 （C-1）， 34.12（C-2）， 202.76 （C-3）， 126.00 （C-4）， 170.55 （C-5）， 72.08 （C-6）， 38.61 （C-7）， 28.22 （C-8）， 58.36 （C-9）， 39.15（C-10）， 68.03 （C-11）， 49.43 （C-12）， 44.12 （C-13）， 55.11 （C-14）， 23.98 （C-15）， 22.73（C-16）， 63.07 （C-17）， 14.06 （C-18）， 19.51 （C-19）， 210.63 （C-20）， 30.97 （C-21）； MS m/z： 369 [M+ Na]+。與文獻[14]對照一致。

（5）7β，15β-二羥基-4-孕甾烯-3， 20-二酮 收率為43.4%；熔點： 243～250 ℃； 1H NMR δ： 0.96 （s， 3H， H-18）， 1.24 （s， 3H， H-19）， 2.15 （s， 3H， H-21）， 3.63 （m， 1H， H-7）， 4.46 （m， 1H， H-15）， 5.76 （s， 1H， H-4）； 13C NMR δ： 35.56 （C-1）， 33.81 （C-2）， 200.42 （C-3）， 124.48 （C-4）， 168.63 （C-5）， 42.32 （C-6）， 71.12 （C-7）， 38.68 （C-8）， 50.90 （C-9）， 38.06 （C-10）， 20.93 （C-11），39.51 （C-12）， 43.90 （C-13）， 60.24 （C-14），73.34 （C-15）， 33.48 （C-16）， 63.39 （C-17），15.41 （C-18）， 17.24 （C-19）， 209.52 （C-20），31.41 （C-21）； MS m/z： 369 [M+ Na]+。與文獻[15]對照一致。

（6）11α-羥基-1， 4-孕甾二烯-3， 20-二酮 收率為1.2%；熔點： 225～230 ℃； 1H NMR δ： 6.09 （s， 1H， H-4）， 7.77 （d， 1H， H-1）， 6.16 （dd， 1H， H-2）， 2.52 （m， 1H， H-17）， 0.70 （s ， 3H， H-18）， 1.30 （s， 3H， H-19）， 2.12 （s， 3H， H-21）， 4.04 （m， 1H， H-11）； 13C NMR δ： 158.89 （C-1）， 125.31 （C-2），186.95 （C-3）， 124.74 （C-4）， 168.05 （C-5），33.16 （C-6）， 33.50 （C-7）， 34.40 （C-8），60.43 （C-9）， 44.06 （C-10）， 68.06 （C-11），49.93 （C-12）， 44.09 （C-13）， 54.96 （C-14），23.15 （C-15）， 24.48 （C-16）， 62.92 （C-17），14.51 （C-18）， 18.74 （C-19）， 208.86 （C-20），31.47 （C-21）；MS m/z： 351[M+Na]+。與文獻[16]對照一致。

2.3 轉(zhuǎn)化途徑推測

根據(jù)化合物出現(xiàn)順序及結(jié)構(gòu)特點，對其結(jié)構(gòu)推測如圖2。首先，孕酮C-11、C-15羥基化分別轉(zhuǎn)化成11α-羥基孕酮、15α-羥基孕酮，然后11α-羥基孕酮又同時進行兩個方向轉(zhuǎn)化：一個方向是轉(zhuǎn)化成11α，15β-二羥基孕酮和6β，11α-二羥基孕酮；另一個方向是通過C-1、C-2脫氫酶的作用轉(zhuǎn)化成1-脫氫11α-羥基孕酮。此外，7β，15β-二羥基孕酮轉(zhuǎn)化率相對較高，而且轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中沒發(fā)現(xiàn)7β-羥基孕酮和15β-羥基孕酮的衍生物，因此可以推測孕酮是直接轉(zhuǎn)化成7β，15β-二羥基孕酮。

3 小結(jié)與討論

總狀毛霉轉(zhuǎn)化孕酮得到6個轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，分別在C-6、C-7、C-11、C-15實現(xiàn)羥基化，表明孕酮具有多個位點可以通過生物修飾。通過本研究轉(zhuǎn)化產(chǎn)物7β，15β-二羥基孕酮、15α-羥基孕酮與7α，15β-二羥基孕酮、15β-羥基孕酮相比較，可以說明同一底物在不同微生物的轉(zhuǎn)化條件下，能在同一位點進行對映體選擇，產(chǎn)生不同構(gòu)效的化合物，由于化合物的構(gòu)效不同，其對機體可能會產(chǎn)生不同的藥物特性[17]，這需要人們更多的發(fā)現(xiàn)。孕酮具有多個可以生物修飾位點，而且同一位點能進行對映體選擇，由此孕酮可以轉(zhuǎn)化成多樣性豐富的衍生物。

轉(zhuǎn)化產(chǎn)物6還發(fā)生了1位的脫氫，表現(xiàn)出菌株轉(zhuǎn)化多樣性。說明總狀毛霉不但有羥化酶存在，而且還有脫氫酶的存在，羥基化酶和脫氫酶屬于細胞色素P450酶系[18]，這也說明細胞色素P450酶系的多樣性，為其在其他甾體藥物及藥物中間體轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用提供了依據(jù)。

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轉(zhuǎn)化產(chǎn)物6還發(fā)生了1位的脫氫，表現(xiàn)出菌株轉(zhuǎn)化多樣性。說明總狀毛霉不但有羥化酶存在，而且還有脫氫酶的存在，羥基化酶和脫氫酶屬于細胞色素P450酶系[18]，這也說明細胞色素P450酶系的多樣性，為其在其他甾體藥物及藥物中間體轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用提供了依據(jù)。

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