李長秀 韋明肯 劉國標(biāo)

摘要[目的]研究豬場糞水抑菌毒性的消除。[方法]采集發(fā)生嚴(yán)重發(fā)酵抑制的豬場集糞池糞水，以大腸桿菌作為指示菌，用平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法檢測糞水對(duì)大腸桿菌的抑制作用，并觀察添加硫代硫酸鈉和硫酸鎂對(duì)緩解糞水抑菌毒性的效果。[結(jié)果]豬場糞水懸浮的大腸桿菌存活率僅為1.35%±0.02%，添加硫代硫酸鈉至終濃度為0.4%，可將懸液中大腸桿菌存活率提高到17.4%±0.14%;懸液中Na2S2O3終濃度超過1.2%時(shí)大腸桿菌存活率反而只有0.14%±0.01%，而同時(shí)添加終濃度為0.2%MgSO4和2%Na2S2O3，則懸液中仍然有17.4%±0.85%的大腸桿菌存活，說明MgSO4有利于降低Na2S2O3毒性;豬場糞水在存放2個(gè)月后基本失去抑菌毒性。[結(jié)論]該研究對(duì)解決因消毒劑殘留引起的沼氣發(fā)酵抑制有積極意義。

關(guān)鍵詞豬場;消毒劑;沼液;硫代硫酸鈉

中圖分類號(hào)S216.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2019）02-0202-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.062

在大中型養(yǎng)殖場沼氣發(fā)酵方式對(duì)畜禽糞便進(jìn)行無害化、資源化處理減少糞便對(duì)環(huán)境污染的重要方式[1-2]。沼氣發(fā)酵是一種厭氧發(fā)酵（anaerobic digestion），是厭氧微生物在沒有溶解氧氣、并且完全封閉的條件下，將人類或者牲畜活動(dòng)產(chǎn)生的糞便、農(nóng)民農(nóng)作產(chǎn)生的農(nóng)作物秸稈等有機(jī)物轉(zhuǎn)化為 CH4、CO2和其他營養(yǎng)物質(zhì)的過程[1]。在產(chǎn)乙酸菌、甲烷菌等多種厭氧微生物的協(xié)同作用下，將富含營養(yǎng)的有機(jī)物質(zhì)不斷分解轉(zhuǎn)化為甲烷，并儲(chǔ)存能量，只有小部分的有機(jī)碳被徹底氧化生成二氧化碳，釋放能量維持微生物自身的生命活動(dòng)[2-3]。雖然沼氣工程在養(yǎng)豬場中被普遍應(yīng)用，但在大型養(yǎng)殖場中，定期消毒是必不可少的技術(shù)操作，消毒劑最后也隨著沖洗水滯留在糞水混合物中，對(duì)后續(xù)的沼氣發(fā)酵造成不同程度的抑制[4-7]。目前，關(guān)于消毒劑滯留對(duì)沼氣發(fā)酵的抑制研究并不多，能提出有效解決辦法的更是鮮見報(bào)道。該研究主要觀察硫代硫酸鈉、硫酸鎂等添加物對(duì)降低豬場糞水中消毒劑沼氣發(fā)酵抑制的效果。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)用菌。

試驗(yàn)所用菌株為大腸桿菌ATCC8099菌株，為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2豬場糞水混合物。

豬場糞水混合物采自茂名市某萬頭豬場的集糞池，該豬場的沼氣池產(chǎn)氣量很低，不能正常發(fā)酵。糞水儲(chǔ)存于塑料桶中，在陰涼處存放。

1.1.3主要試劑、藥品和培養(yǎng)基。

硫代硫酸鈉（Na2S2O3）：按需要配制成不同濃度（m/V）;

硫酸鎂（MgSO4）：按需要配制成不同的濃度（m/V）;LB培養(yǎng)基：蛋白胨（10 g）、酵母膏（5 g）、氯化鈉（10 g）、蒸餾水（1 000 mL）、pH 7.0;

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏（3 g）、蛋白胨（10 g）、氯化鈉（5 g）、瓊脂（15～20 g）、蒸餾水（1 000 mL）、pH 7.0～7.2。

1.1.4主要儀器與設(shè)備。

不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）;數(shù)顯式電熱恒溫干燥箱（上海滬越實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）;電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。

1.2方法

1.2.1糞水上清液的制備。

豬場采集的糞水混合物用漩渦振蕩器充分震蕩，然后轉(zhuǎn)入50 mL離心管，10 000 r/min離心5 min，收集上清液并轉(zhuǎn)入三角瓶中滅菌保存，此為糞水上清液，供后續(xù)的試驗(yàn)使用。

1.2.2大腸桿菌懸液的制備。

搖瓶培養(yǎng)24 h的大腸桿菌菌液于5 mL離心管中4 000 r/min離心5 min，棄上清液，加09%生理鹽水打散洗滌，再離心，棄上清液，如此洗滌3次，最后用生理鹽水把菌體重懸，調(diào)整濃度，使其OD600=0.5，并用平板培養(yǎng)法確定此菌液的濃度。菌液于4 ℃冰箱中保藏，3 d內(nèi)使用。

1.2.3硫酸鎂和硫代硫酸鈉溶液的配制。

稱量一定量的固體硫酸鎂和硫代硫酸鈉，用滅菌的糞水上清液溶解至所需要的濃度。

1.2.4硫代硫酸鈉和硫酸鎂對(duì)糞水上清液的毒性中和作用。

用滅菌的沼液上清液對(duì)4 ℃保存的菌懸液進(jìn)行系列10倍濃度梯度稀釋，每個(gè)梯度稀釋均保持孵育20 min，然后加入1/50體積不同濃度的硫代硫酸鈉母液進(jìn)行中和，使硫代硫酸鈉的終濃度分別達(dá)到0.15%、0.25%、0.30%、0.32%、0.40%、1.20%、1.40%和1.80%。陽性對(duì)照不加硫代硫酸鈉，陰性對(duì)照用生理鹽水代替滅菌沼液上清液。

中和作用1 h后，取10-5～10-8稀釋度，每個(gè)梯度涂3個(gè)平板，每個(gè)平板的取樣量為0.1 mL。置于37 ℃下培養(yǎng)24 h，即可進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果的菌落計(jì)數(shù)，平板計(jì)數(shù)的結(jié)果換算成每毫升溶液的菌體存活數(shù)（CFU/mL），進(jìn)而把各試驗(yàn)組的菌體存活數(shù)換算成與生理鹽水對(duì)照組的相對(duì)存活率。

2結(jié)果與分析

2.1硫代硫酸鈉濃度對(duì)解除沼液抑菌作用的影響

由圖1可知，以生理鹽水懸浮稀釋的大腸桿菌成活率為參照（100%），用滅菌的糞水上清液懸浮稀釋后，大腸桿菌的存活率僅為1.35%±0.02%，可見此間豬場的糞水中殘留有高濃度的抑菌物質(zhì)，由此推測他對(duì)其他的沼氣發(fā)酵微生物也具有強(qiáng)烈的抑制作用，這也可以解釋為什么這家豬場的沼氣池產(chǎn)量很低，不能正常發(fā)酵。加入一定濃度的硫代硫酸鈉可明顯提高大腸桿菌在糞水懸液中的存活率：在0.15%～0.40%的范圍內(nèi)，硫代硫酸鈉的濃度越高，成活率提高的越明顯;在硫代硫酸鈉的濃度為0.40%時(shí)，大腸桿菌的成活率達(dá)到17.4%±0.14%。但是當(dāng)硫代硫酸鈉濃度太高時(shí)，對(duì)懸液中的細(xì)菌則產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用，如圖1所示，硫代硫酸鈉終濃度達(dá)到1.2%上時(shí)，僅有0.14%±0.01%的大腸桿菌存活，由此可見，硫代硫酸鈉作為一種還原性化合物，僅在一個(gè)比較窄的濃度范圍內(nèi)用于中和糞水混合物中的殘留毒性物質(zhì)。

2.2硫酸鎂對(duì)硫代硫酸鈉減毒的輔助作用

鎂是一種參與生物體正常生命活動(dòng)及新陳代謝過程必不可少的元素。鎂離子在細(xì)胞中具有多種生物功能，如影響鉀離子和鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)控信號(hào)的傳遞、參與能量代謝、蛋白質(zhì)和核酸的合成等，因此鎂離子的存在可以提高細(xì)胞的生命活力。該試驗(yàn)中，雖然硫代硫酸鈉可以在一定程度緩解糞水中殘留消毒劑的毒性，但是過高的硫代硫酸鈉濃度反過來會(huì)完全抑制大腸桿菌的生長。但是，加入一定量硫酸鎂卻可以使懸液中的大腸桿菌恢復(fù)生長。如圖2所示，當(dāng)懸液為1.2%硫代硫酸鈉+0.2%硫酸鎂時(shí)，有17.4%±0.85%的大腸桿菌可以恢復(fù)生長，如果沒有硫酸鎂存在，則僅有0.14%±0.01%的大腸桿菌存活（圖1）。原因在于MgSO4對(duì)沼液中的抑菌物質(zhì)可能有一定的中和作用。

2.3水樣放置時(shí)間對(duì)抑菌作用的影響

由于該豬場使用的消毒劑是氧化型的消毒劑聚維酮碘，該消毒劑在與糞便的接觸過程中慢慢被還原，毒性也逐漸減弱。如圖3所示，在新鮮的糞水上清液中，大腸桿菌的存活率幾乎為0，而存放2個(gè)月后，糞水上清液中大腸桿菌的存活率提高到7.95%±106%。說明水樣放置超過2個(gè)月后，其中的消毒劑殘留毒性也會(huì)慢慢減弱。

3討論

在大型養(yǎng)殖場中，抗生素和消毒劑是控制疾病必須使用的藥物。抗生素使用后在糞便中殘留及其對(duì)沼氣發(fā)酵的影響已引起人們的注意[8-10]。

試驗(yàn)中的糞水混合物是養(yǎng)豬場日常消毒沖洗用水和豬糞尿的混合物。雖然糞水中本來就含有很多微生物，但是由于其種類和數(shù)量都沒法確定，因此，將糞水經(jīng)滅菌后重新添加已知濃度的大腸桿菌作為消毒劑毒性的指示菌，以平板培養(yǎng)時(shí)大腸桿菌的菌落數(shù)量來表征糞水的抑菌程度，菌落數(shù)量越多，標(biāo)明毒性越小，抑制越弱。

研究發(fā)現(xiàn)沼液對(duì)大腸桿菌具有強(qiáng)烈的抑菌效果，而將具有還原性的硫代硫酸鈉加入沼液后，平板培養(yǎng)的菌落數(shù)明顯增加，說明沼液中可能含有氧化型消毒劑，這與我們對(duì)豬場的調(diào)查結(jié)果可以互相印證。硫代硫酸鈉具有很強(qiáng)的還原性，是許多氧化型消毒劑的中和劑，可以中和殘留的消毒劑[11-12]。該研究所用的沼液取自一個(gè)不能正常發(fā)酵產(chǎn)氣的豬場沼氣池，經(jīng)調(diào)查得知該豬場日常所用的消毒劑是聚維酮碘，因此我們推測沼氣不能正常發(fā)酵的原因是聚維酮碘的殘留抑制了沼氣微生物的活性，并試探性加入硫代硫酸鈉來中和消毒劑的毒性。試驗(yàn)結(jié)果與我們的預(yù)期相符，證明該豬場沼氣池不能正常發(fā)酵的原因是消毒劑殘留。另外有人發(fā)現(xiàn)硫酸鎂能中和四環(huán)素、土霉素、新霉素、多粘菌素、鏈霉素等抗生素[13]，我們?cè)诩尤肓虼蛩徕c后再加入硫酸鎂，能明顯降低沼液對(duì)大腸桿菌的抑制。這種現(xiàn)象有2種可能性，一是硫酸鎂對(duì)硫代硫酸鈉的中和作用具有協(xié)同性，二是沼液中還存在來自于飼料的抗生素殘留。

由于消毒劑和抗生素等對(duì)各種微生物的毒性具有廣譜性，因此只要證明豬糞水對(duì)大腸桿菌具有毒性，那么就說明這種藥物殘留對(duì)沼氣發(fā)酵過程中與發(fā)酵相關(guān)的其他微生物也具有毒性。沼氣發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)體系，沼液對(duì)細(xì)菌的抑制作用與多種因素有關(guān)，除了有毒有害物質(zhì)之外，沼液的pH也是重要的影響因素[14-16]，該試驗(yàn)只研究豬糞水對(duì)大腸桿菌的抑制及其消除辦法，對(duì)于大型豬場的沼氣發(fā)酵抑制，添加硫代硫酸鈉有一定的消除作用，但很難完全中和沼液中的抑菌毒性，可能沼液中還存在其他的非氧化型的消毒劑以及抗生素的影響[17-19]。但該研究表明硫代硫酸鈉對(duì)沼液的毒性有緩解作用，可為豬場的沼氣池非正常的產(chǎn)氣量下降提供應(yīng)急解決方案。另外，還可以在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討用硫酸鎂等作為助劑提高處理效果的可能性。

參考文獻(xiàn)

[1] ROUBIK H，MAZANCOV J，PHUNG L D，et al.Current approach to manure management for smallscale Southeast Asian farmersUsing Vietnamese biogas and nonbiogas farms as an example[J].Renewable energy，2018，115：362-370.

[2] DE BAERE L.Novel trends in anaerobic digestion of municipal solid waste[J].Communications in agricultural and applied biological sciences，2003，68（2 PtA）：117-124.

[3] ABBASI T，TAUSEEF S M，ABBASI S A.A brief history of anaerobic digestion and “biogas”[C]//Biogas energy.New York：Springer，2012：11-23.

[4] 張京景，蘇有勇，孔琳，等.福爾馬林消毒劑對(duì)養(yǎng)殖場糞污產(chǎn)沼氣的影響[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2011，27（S1）：64-67.

[5] 張京景，蘇有勇，李昊，等.消毒劑對(duì)沼氣發(fā)酵影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].化學(xué)與生物工程，2011，28（3）：78-80.

[6] 管運(yùn)濤，蔣展鵬，金鵬.兩相厭氧膜生物系統(tǒng)產(chǎn)氣特性研究[J].中國沼氣，1999，17（4）：3-6.

[7] 朱忠勇，馬立人，王艾麗，等.實(shí)用醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，1992：500.

[8] ALVAREZ J A，OTERO L，LEMA J M，et al.The effect and fate of antibiotics during the anaerobic digestion of pig manure[J].Bioresource technology，2010，101（22）：8581-8586.

[9] SHI J C，LIAO X D，WU Y B，et al.Effect of antibiotics on methane arising from anaerobic digestion of pig manure[J].Animal feed science and technology，2011，166 /167：457-463.

[10] 張敏，張俊，錢金秋，等.磺胺二甲嘧啶對(duì)沼氣發(fā)酵過程中酶活性和微生物群落功能多樣性的影響[J].生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào)，2017，33（7）： 653-659.

[11] 林錦炎，袁朝森.吐溫80對(duì)硫代硫酸鈉中和消毒劑效果的影響[J].中國消毒學(xué)雜志，1995，12（4）：233-234.

[12] 蔣興祥，章迎春，張行燕.復(fù)方硫代硫酸鈉中和含氯復(fù)方消毒劑效果的試驗(yàn)觀察[J].中國消毒學(xué)雜志，2001，18（1）：49-50.

[13] 張呂良，黃忠強(qiáng)，龍鳳鳴，等.抗生素中和劑對(duì)提高細(xì)菌性培養(yǎng)陽性率的研究[J].右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，30（4）：630.

[14] 馬茹霞.氮源對(duì)玉米秸稈沼氣發(fā)酵過程及微生物群落的影響[D].大慶：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，2017.

[15] 董明華.云南沼氣發(fā)酵生態(tài)系統(tǒng)的原核生物群落時(shí)空動(dòng)態(tài)研究[D].昆明：云南大學(xué)，2016.

[16] 張加穩(wěn).沼液抑制云南紅豆杉葉斑病原菌的實(shí)驗(yàn)研究[D].昆明：云南師范大學(xué)，2016.

[17] 張敏，錢金秋，李忠洲，等.恩諾沙星對(duì)厭氧發(fā)酵過程中水解酶活性及沼氣產(chǎn)量的影響[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，24（11）：1539-1546.

[18] 張凱煜，谷潔，趙聽，等.土霉素和磺胺二甲嘧啶對(duì)堆肥過程中酶活性及微生物群落功能多樣性的影響[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2015，35（12）：3927-3936.

[19] 李建昌，孫可偉.淀粉酶前處理應(yīng)用于豬糞沼氣發(fā)酵的研究[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2010，33（4）：117-121.