曲均革 余誠(chéng)成 陳月新

摘要 [目的]篩選對(duì)農(nóng)業(yè)病害真菌有較強(qiáng)拮抗作用的海洋細(xì)菌。[方法]以油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）為篩選模型，采用平皿拮抗法篩選抗菌活性，對(duì)活性菌株進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化，并對(duì)活性物質(zhì)提取進(jìn)行初探。[結(jié)果]海洋細(xì)菌菌株MB133具有明顯抑菌現(xiàn)象，最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為最適培養(yǎng)溫度28 ℃，發(fā)酵液中最適葡萄糖濃度2.0%，最適培養(yǎng)時(shí)間72 h;熱穩(wěn)定性試驗(yàn)表明活性物質(zhì)對(duì)熱不穩(wěn)定;醇沉法提取有效物質(zhì)發(fā)現(xiàn)抑菌組分在沉淀中。[結(jié)論]該研究為農(nóng)用病害真菌的生物防治擴(kuò)充了菌種資源。

關(guān)鍵詞 海洋細(xì)菌;農(nóng)業(yè)病害真菌;發(fā)酵工藝優(yōu)化;分離提取

中圖分類號(hào) S432.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）04-0140-03

Abstract [Objective]To screen the marine bacteria with strong antagonistic effect against agricultural diseases and fungi.[Method]Using Sclerotinia sclerotiorum as the screening model，the antimicrobial activity was screened by plate antagonism method.The optimization of fermentation process and the extraction of active substances from active strains were studied.[Result]The marine bacteria MB133 had obvious bacteriostasis phenomenon.The optimum fermentation conditions were as follows：the optimum culture temperature was 28 ℃，the optimum concentration of glucose in fermentation broth was 2.0%，and the optimum incubation time was 72 hours.Thermal stability test showed that the active substances were unstable to heat.Extraction of effective substances by alcohol precipitation showed that the antimicrobial components were in the precipitation.[Conclusion]This study expanded the strain resources for biological control of agricultural diseases and ?fungi.

Key words Marine bacterium;Agricultural diseases and fungi;Fermentation process optimization;Separation and extraction

近年來(lái)化學(xué)農(nóng)藥的過(guò)度使用給人類社會(huì)帶來(lái)了一系列的生態(tài)危機(jī)和安全隱患[1-3]。相對(duì)而言，生物農(nóng)藥對(duì)人畜無(wú)毒、環(huán)境友好并且不容易產(chǎn)生抗藥性，所以生物農(nóng)藥是未來(lái)農(nóng)藥發(fā)展的希望和方向[4]。 海洋微生物因其具有繁殖迅速、容易大規(guī)模培養(yǎng)以及所含次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)新穎、生物活性獨(dú)特等特點(diǎn)而備受青睞[5-7]。真菌侵染引起的植物病害位于植物病害起因的首位，它導(dǎo)致農(nóng)作物大量減產(chǎn)。油菜菌核病是油菜生產(chǎn)中的重要病害之一，發(fā)病率高達(dá)10%～30%，嚴(yán)重的達(dá)80%以上，病株一般減產(chǎn)10%～70%，其病原菌屬子囊菌亞門(mén)真菌[8-11]。筆者以油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）為篩選模型，開(kāi)發(fā)具有抗農(nóng)業(yè)病害真菌特性的海洋細(xì)菌資源，以期為農(nóng)用病害真菌的生物防治擴(kuò)充菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 海洋細(xì)菌菌株。已篩選的海洋細(xì)菌菌株MB133為實(shí)驗(yàn)室從寧波象山海域分離純化到的菌種資源[12]。

1.1.2 供試農(nóng)業(yè)病害真菌菌株。油菜菌核病菌（ACCC 37700）來(lái)源于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.3 培養(yǎng)基。

1.1.3.1 富集、活化、發(fā)酵培養(yǎng)基。采用2216E液體培養(yǎng)基加葡萄糖20 g/L。2216E液體培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g/L、酵母膏1.0 g/L、磷酸高鐵0.01 g/L，人工海水定容至1.0 L，pH 7.6～7.8。

1.1.3.2 農(nóng)業(yè)病害真菌培養(yǎng)基。采用PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯提取液1.0 L、葡萄糖20.0 g、瓊脂15.0 g，自然pH。其中馬鈴薯提取液是取去皮馬鈴薯200.0 g，切成小塊，加水1.0 L，煮沸30 min，濾去馬鈴薯塊，將濾液補(bǔ)足至1.0 L。

1.2 方法

1.2.1 獲得海洋細(xì)菌MB133單菌落。在滅菌過(guò)的超凈工作臺(tái)內(nèi)，用接種環(huán)取一環(huán)保藏的海洋細(xì)菌菌株MB133，將其在2216E培養(yǎng)基上分區(qū)劃線，生化培養(yǎng)箱內(nèi)28 ℃培養(yǎng)16 h得單菌落。

1.2.2 活化分離得到的海洋細(xì)菌。在滅菌過(guò)的超凈工作臺(tái)上，用接種環(huán)取海洋細(xì)菌菌株MB133的單菌落，放入1 mL無(wú)菌海水內(nèi)將其打散，倒入含0.5%葡萄糖的2216E液體培養(yǎng)基（30 mL）中，放在25 ℃、170 r/min條件下恒溫?fù)u床培養(yǎng)16 h，為種子液。再將種子液按2%的接種量接入含0.5%葡萄糖的2216E液體培養(yǎng)基中，25 ℃、170 r/min條件下恒溫?fù)u床培養(yǎng)48 h，觀察其活化情況。

1.2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化。在250 mL三角瓶中進(jìn)行液體發(fā)酵，將種子液按2%的接種量接入2216E液體培養(yǎng)基中，25 ℃、170 r/min培養(yǎng)48 h。改變某一條件，并保持其他發(fā)酵條件不變，通過(guò)測(cè)量菌株的抑菌圈，研究葡萄糖濃度、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間對(duì)農(nóng)業(yè)病害菌抑菌效果的影響。

1.2.3.1 葡萄糖濃度對(duì)抑菌活性的影響。將菌株活化24 h的種子液，按2%的接種量，接種于含0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%葡萄糖的2216E液體培養(yǎng)基中（30 mL），pH 7.5～7.8，25 ℃、170 r/min培養(yǎng)48 h，測(cè)定葡萄糖濃度對(duì)油菜菌核病菌抑菌效果的影響，確定最佳發(fā)酵糖濃度。

1.2.3.2 發(fā)酵溫度對(duì)抑菌活性的影響。將菌株活化24 h的種子液，按2%的接種量，接種于2216E液體培養(yǎng)基中（30 mL），pH 7.5～7.8，分別在25、28、30、32 ℃，170 r/min培養(yǎng)48 h，測(cè)定不同培養(yǎng)溫度對(duì)油菜菌核病菌抑菌效果的影響，確定最佳發(fā)酵溫度。

1.2.3.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑菌活性的影響。將菌株活化24 h的種子液，按2%的接種量，接種于2216E液體培養(yǎng)基中（30 mL），pH 7.5～7.8，放入25 ℃培養(yǎng)箱，170 r/min分別培養(yǎng)24、48、72 h，測(cè)定發(fā)酵時(shí)間對(duì)油菜菌核病菌抑菌效果的影響，確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

1.2.4 離心發(fā)酵液。取活化后的MB133菌液2 mL于離心管中，于4 ℃、13 000 r/min條件下冷凍離心10 min，取其上清液。

1.2.5 抑菌活性測(cè)量。用接種鏟將固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的油菜菌核病菌接種至PDA平板正中間（菌落直徑為7～8 mm），在每塊平板下方用記號(hào)筆劃出6個(gè)相等的區(qū)域，每個(gè)區(qū)域做好標(biāo)記。用鑷子夾取牛津杯放在每個(gè)標(biāo)記區(qū)域的正中間，用移液槍向牛津杯中加入200 μL發(fā)酵上清液，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，25 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.6 抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性研究。將提取得到的發(fā)酵上清液平均分為6份，分別置于40、60、80、100和120 ℃高溫高壓下水浴1 h，并用平皿拮抗法測(cè)量是否有抑菌現(xiàn)象，對(duì)照為不做處理的發(fā)酵上清液。

1.2.7 醇沉法提取活性物質(zhì)。將發(fā)酵液于4 ℃下13 000 r/min離心，上清液和無(wú)水乙醇按1∶3混合，再離心，將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，然后將其與用無(wú)菌水溶解后的沉淀用平皿拮抗法測(cè)量是否有抑菌現(xiàn)象，對(duì)照為不做處理的發(fā)酵上清液。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 葡萄糖濃度對(duì)抑菌活性的影響。由圖1可知，25 ℃培養(yǎng)48 h后，2.0%葡萄糖濃度的發(fā)酵液抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑12 mm，所以最佳葡萄糖濃度為2.0%。

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)抑菌活性的影響。培養(yǎng)48 h后，離心取上清，采用平皿拮抗法對(duì)油菜菌核病菌進(jìn)行抑菌活性比較。由圖2可知，當(dāng)溫度為28 ℃時(shí)，抑菌圈直徑最大，可以達(dá)13.8 mm，故最佳發(fā)酵溫度為28 ℃。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑菌活性的影響。由圖 3可知 ，MB133菌株產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，24 h抑菌圈直徑為0，48 h抑菌圈直徑為8.50 mm，72 h抑菌圈直徑達(dá)12.15 mm，菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)最多，因此確定72 h為最佳發(fā)酵時(shí)間。

2.2 有效抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性 由圖4可知，當(dāng)溫度超過(guò)40 ℃后就沒(méi)有抑菌圈出現(xiàn)，所以有效抑菌物質(zhì)對(duì)熱不穩(wěn)定。

2.3 用醇沉法提取有效物質(zhì) 發(fā)酵液上清經(jīng)無(wú)水乙醇提取，對(duì)提取液上清及沉淀分別進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，如圖5所示，只有沉淀和對(duì)照出現(xiàn)了抑菌圈，即沉淀對(duì)油菜菌核病菌具有抑制作用，所以有效抑菌物質(zhì)在沉淀中。

3 結(jié)論

該研究所用菌株MB133是從寧波象山海域分離純化到的海洋細(xì)菌，經(jīng)平皿拮抗法篩選后發(fā)現(xiàn)其對(duì)農(nóng)業(yè)病害真菌具有較明顯的抑菌作用。經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化發(fā)現(xiàn)最適培養(yǎng)溫度為28 ℃，最適葡萄糖濃度為2.0%，最適發(fā)酵時(shí)間為72 h;熱穩(wěn)定性試驗(yàn)表明活性物質(zhì)具有熱不穩(wěn)定性;醇沉法提取有效物質(zhì)發(fā)現(xiàn)抑菌組分在沉淀中。下一步將深入開(kāi)展抑菌組分的分離提取研究，以期為農(nóng)用抗生素的推廣和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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