丁毅飛 曹春雨 王憑青

摘要[目的]構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的PNX沉默載體，感染GnRH分泌細胞（GT1-7）后進行篩選鑒定，獲得穩(wěn)定的PNX沉默細胞株。[方法]結(jié)合RNAi干擾技術(shù)構(gòu)建出慢病毒沉默載體，在293T細胞中包裝病毒并測定滴度。感染GnRH分泌細胞（GT1-7），嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定細胞后利用Real-time PCR和Western blot檢測PNX沉默效果。[結(jié)果]慢病毒介導(dǎo)的PNX沉默載體構(gòu)建成功，包裝的慢病毒成功感染GT1-7細胞，并且Real-time PCR和Western blot證實了PNX沉默細胞株的PNX沉默效果。[結(jié)論]成功構(gòu)建了慢病毒介導(dǎo)的PNX沉默細胞株，為以后探索PNX對動物生殖發(fā)育的作用打下了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞慢病毒;PNX;生殖

中圖分類號S852文獻標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2019）02-0094-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.027

動物復(fù)雜而精密的生殖發(fā)育過程由中樞神經(jīng)系統(tǒng)與內(nèi)分泌系統(tǒng)共同調(diào)控，下丘腦中眾多生殖相關(guān)的神經(jīng)肽信號匯聚于GnRH（Gonadotropinreleasing hormone，GnRH）神經(jīng)元上，并與下丘腦-垂體-性腺（hypothalamicpituitarygonadal，HPG）軸中的各種生殖相關(guān)因子共同調(diào)控動物生殖發(fā)育過程[1]。PNX是在2013年利用生物信息學(xué)技術(shù)所發(fā)現(xiàn)的一個新的生殖相關(guān)肽，并且檢測到其在下丘腦及外周組織處廣泛表達，在下丘腦中的表達最高[2]。研究發(fā)現(xiàn)PNX可以通過結(jié)合受體GPR173調(diào)控下丘腦、垂體細胞系中某些生殖相關(guān)基因[3-4]，研究也發(fā)現(xiàn)PNX參與了成年大鼠發(fā)情期的調(diào)控 [2，4]，但是PNX參與生殖的調(diào)控方式仍然有許多未知的機制。筆者結(jié)合慢病毒載體以及RNAi干擾2種技術(shù)來構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的PNX沉默載體，對GnRH分泌細胞系（GT1-7）進行慢病毒感染并篩選出穩(wěn)定的PNX沉默細胞株，以期為進一步探索PNX在分子以及模型動物層面的生殖調(diào)控機制打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要材料和試劑

慢病毒pCDH-CMV-GFP-Puro與其輔助質(zhì)粒以及限制性內(nèi)切酶等購買于武漢優(yōu)寶生物科技有限公司;慢病毒干擾序列與對照序列由重慶擎科合成;小鼠GnRH分泌細胞系（GT1-7）由美國加利福利亞大學(xué)Pamela Mellon教授提供;人胚腎293T細胞購買于上海中科院細胞所;質(zhì)粒 DNA 提取試劑盒、切膠回收試劑盒、細胞瓶/板等購買自北京鼎國昌盛生物科技有限公司;抗PNX多克隆抗體（Bioss），HRP標(biāo)記二抗（Proteintech），細胞用高糖培養(yǎng)基、血清、大腸桿菌（DH5α）等均購自Gibco公司。

1.2方法

1.2.1構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的PNX沉默載體。

用BamHI與EcoRI 2種內(nèi)切酶對pCDH-CMV-GFP-Puro載體進行雙酶切，利用切膠回收試劑盒對目的片段進行回收。對Sigma公司已驗證的PNX干擾序列及對照序列合成后，分別進行退火得到雙鏈，接著與回收的目的片段在T4連接酶作用下進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌（DH5α），將用氨芐培養(yǎng)基篩選得到的陽性菌落挑出送給生物公司測序，將測序成功所獲得的質(zhì)粒命名為shPNX和shCON。

1.2.2病毒合成與滴度測定。

將重組質(zhì)粒shPNX和shCON分別與2種包裝質(zhì)粒（PMD2G，pSPAX）按照1∶3∶4的比例共轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染8 h后更換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h收獲1次病毒，換新的培養(yǎng)基后24 h再收獲1次病毒，將2次病毒合并，利用0.45 μm濾器過濾濃縮病毒后分裝于-80 ℃保存。

在24孔板中接種293T細胞，將獲得的干擾及對照病毒稀釋成不同濃度對293T細胞進行感染24 h，換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)96 h后觀察各個組別GFP熒光差異，計算病毒滴度。

1.2.3慢病毒感染GT1-7及穩(wěn)定細胞株篩選。在6孔板中接種GT1-7細胞至其生長至40%左右，用收獲的shPNX及shCON慢病毒對細胞進行感染24 h，之后與6孔板中不加慢病毒的陰性對照CON組細胞一起正常換液培養(yǎng)至72 h。

在熒光顯微鏡下觀察到GFP綠色熒光后利用之前實驗室已優(yōu)化的1 μg/mL的puromycin篩選條件對各組GT1-7細胞進行篩選，每天利用含有1 μg/mL puromycin的新鮮培養(yǎng)基換液直到陰性對照CON組細胞全部死亡，即得到shPNX及shCON穩(wěn)定細胞株，觀察GFP熒光后進行擴大培養(yǎng)。

1.2.4Real-time PCR檢測PNX沉默效果。

在12孔板中分別接種3組細胞（GT1-7，GT1-7-shCON，GT1-7-shPNX）各3孔，待細胞匯聚度在80%左右，利用試劑盒提取RNA然后進行反轉(zhuǎn)及定量PCR檢測，以β-Actin作為內(nèi)參進行分析。PNX定量引物為F：5′-GCGCTCATATTCGGAGGCTT-3′，R： 5′-ACCACACTTTCAACCCTGGC-3′，β-Actin定量引物為F： 5′-ACTCCTATGTGGGTGACGAGG-3′，R：5′-CACACGCAGCTCATTGTAGAAG-3′。

1.2.5Western blot技術(shù)檢測PNX沉默效果。

在6孔板中分別接種3組細胞（GT1-7，GT1-7-shCON，GT1-7-shPNX）各3孔，待細胞匯聚度在80%左右，利用RIPA裂解液在冰上裂解細胞后，離心取上清蛋白液，利用BCA試劑盒進行定量處理后，對蛋白進行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，隨后用一抗結(jié)合4 ℃冰箱過夜，用TBST洗膜3次，再用二抗室溫結(jié)合1 h后再次洗膜3次，最后在暗室進行顯影。用β-Actin蛋白作為內(nèi)參。

1.2.6統(tǒng)計分析。

3次獨立重復(fù)試驗，數(shù)據(jù)采用軟件SPSS 20進行處理分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用單因素方差檢驗對多組數(shù)據(jù)的均數(shù)差異進行檢驗，組間采用獨立t檢驗，P<0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果與分析

2.1構(gòu)建shPNX和shCON載體及測序

構(gòu)建shPNX和shCON載體后送往生物公司進行測序，通過DNA-MAN軟件分析后，提示成功將目的序列插入了慢病毒載體，載體構(gòu)建成功。

2.2慢病毒包裝及滴度測定

shPNX和shCON慢病毒包裝后分別進行滴度測定，得到shPNX慢病毒滴度為2.2×108 TU/mL，shCON慢病毒滴度為2.5×108 TU/mL。

2.3慢病毒感染GT1-7及穩(wěn)定細胞株篩選

利用shPNX和shCON慢病毒感染GT1-7后，用puromycin篩選獲得了穩(wěn)定的慢病毒感染細胞株（圖1）。

2.4PNX mRNA的表達水平

shPNX組的PNX mRNA表達量（0.297）顯著低于shCON組（1.167）及陰性對照組（1.000），差異具有顯著性（P<0.01）。

2.5PNX的蛋白表達水平

shPNX組的PNX 蛋白表達量顯著低于shCON組及陰性對照組，差異具有顯著性（P<0.01，圖2）。

3討論

在研究中構(gòu)建了慢病毒介導(dǎo)的PNX干擾載體，在感染GnRH分泌細胞株GT1-7后篩選得到了穩(wěn)定的PNX沉默細胞株，并且檢測到顯著的PNX沉默效果。動物的生殖發(fā)育調(diào)控由體外環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境共同影響，由多種因子共同調(diào)控，PNX作為一個新發(fā)現(xiàn)的生殖肽，不僅在生殖方面存在調(diào)控作用[5-7]，還在感官處理、記憶、焦慮處理[8-10]等方面有調(diào)控作用。此次試驗所構(gòu)建的慢病毒介導(dǎo)的PNX干擾載體以及PNX沉默的GnRH分泌細胞株，可以進一步用于探索PNX與GnRH等生殖相關(guān)肽的調(diào)控關(guān)系，也可以為以后進一步探索PNX在模式動物中的生殖調(diào)控及其他生物學(xué)作用打下基礎(chǔ)。

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