趙大偉 王浩博 李佳麗 劉俊霞

摘要：目的：利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化五味子果實(shí)中木脂素微波提取工藝。方法：在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以乙醇濃度、料液比、提取次數(shù)、提取功率為自變量，木脂素含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)來確定最佳提取工藝。結(jié)果：響應(yīng)面優(yōu)化的最佳提取工藝為乙醇濃度84%，料液比為1∶15，提取次數(shù)為2次，提取功率為800W。結(jié)論：響應(yīng)面分析所得二次模型方程能較好地預(yù)測實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到的提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，該研究可為從北五味子中提取木脂素成分提供一個(gè)較為有效的方法。

關(guān)鍵詞：五味子;木脂素;響應(yīng)曲面法

基金項(xiàng)目：吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新科研項(xiàng)目（2017063）;吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目（2017411）

中圖分類號： TQ460.6 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼： ?A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI編號： ? 10.14025/j.cnki.jlny.2019.06.014

五味子（Schisandra chinensis）是木蘭科五味子屬植物。五味子中有效成分木脂素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保肝降酶等功效[1]。一直以來，對五味子木脂素提取工藝的研究一直在推陳出新，但多以正交試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)處理，其篩選得到的結(jié)果差異性大、重復(fù)性差[2]。傳統(tǒng)的提取方法常采用超聲提取法，該工藝的不足在于提取時(shí)間長、消耗能源大，而微波提取法是將微波輻射與溶劑萃取相結(jié)合，具有提取時(shí)間短、溶劑用量少、提取成本低等優(yōu)點(diǎn)[3-4]。本研究將微波提取法用于五味子果實(shí)中木脂素的提取，以五味子中含量高的4種木脂素含量為考察指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選五味子果實(shí)中木脂素的最佳提取工藝，提供一個(gè)從五味子中提取木脂素的較為有效的方法。

1 材料與儀器

1.1 儀器

XH-100A微波超聲波合成儀（北京祥鵠科技發(fā)展有限公司）、1260型高效液相色譜儀（安捷倫）、R1001-VN型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）、SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）、SE602F型電子天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司）、HP-010型真空泵（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）、FB-01T過濾器。標(biāo)準(zhǔn)品五味子醇甲（ZJ0109BA13）、五味子醇乙（PM0303SA14）、五味子甲素（P26M6R1）、五味子乙素（PA0414RA14）購買于上海源葉生物科技有限公司，純度均大于98%。所用試劑均為分析純。

1.2 材料

五味子2017年6月采自于吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院藥用植物資源圃。經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院老師李赫男鑒定為五味子科（Schisandraceae）五味子屬（Schisandra）五味子（Schisandra chinensis （Turcz.）Baill.）的果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 五味子果實(shí)的處理

將五味子果實(shí)粉碎，置于55℃烘箱中烘至恒重，過40目篩后備用。

2.2 五味子果實(shí)中木脂素含量測定

2.2.1 溶液的制備

2.2.1.1 對照品溶液 精確稱取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素對照品各5mg于10mL的容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度均為0.5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置4℃冰箱中保存[5]。

2.2.1.2 供試品溶液制備 精密量取單因素考察和響應(yīng)面曲線法制得的五味子果實(shí)溶液10，進(jìn)入HPLC檢測其四種木脂素含量。

2.2.2 色譜條件 色譜柱為ZORBAX SB-C18（4.6×150mm，5μm）;流動(dòng)相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫0～30min 45%A～75%A;30～45min 75%A～100%A;45～55min 100%A;流速1mL/min;柱溫30℃;進(jìn)樣量10μL;在254nm波長處進(jìn)行檢測[6-7]，色譜圖見圖1。

A：對照品溶液;B：樣品溶液;1.五味子醇甲;2.五味子醇乙;3.五味子甲素;4.五味子乙素。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 ?取配制的對照品溶液，分別進(jìn)樣2μL、4μL、6μL、8μL、10μL，按色譜條件進(jìn)行色譜分析，記錄色譜峰面積，以色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出各木脂素線性回歸方程，見表1。

2.2.4方法學(xué)考察

2.2.4.1 精密度試驗(yàn) ?分別精密吸取4種對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，進(jìn)樣量10，按色譜條件進(jìn)行 HPLC分析，記錄峰面積。結(jié)果顯示，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素峰面積的RSD值分別為0.46%、0.88%、0.68%、0.59%（n=5），表明儀器精密度良好。

2.2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) ?取同一批樣品3份，按“2.2.1.2”方法制備成供試品溶液，按色譜條件進(jìn)行HPLC分析，記錄峰面積，測得五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素峰面積的RSD值分別為0.72%、0.79%、1.13%、0.97%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) ?取同一供試品溶液分別放置0h，2h，4h，6h，8h，12h，24h后按上述色譜條件下進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算木脂素含量。結(jié)果顯示：供試品溶液中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素含量的RSD值分別為0.89%、0.78%、1.12%、0.98%（n=5），結(jié)果表明，供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4.4 加樣回收率試驗(yàn) ?精密稱取5份已知上述4種木脂素含量的五味子粉末1.000g，各精密加入適量的對照品溶液，按“2.2.1.2”方法制備樣品溶液，根據(jù)上述色譜條件進(jìn)行檢測分析，測定五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的含量。由測得量和加入量，計(jì)算各成分的加樣回收率，結(jié)果符合定量測定要求，表明本法準(zhǔn)確可靠，詳見表2。

3 響應(yīng)面法優(yōu)化五味子果實(shí)中木脂素的微波提取工藝

在微波提取法單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度（X1）、料液比（X2）、提取次數(shù)（X3）、提取功率（X4）四個(gè)因素，通過Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行Box-Benhnken的響應(yīng)面設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，具體試驗(yàn)因素與各水平值見表3。

根據(jù)Box-Benhnken的組合設(shè)計(jì)原理，采用Design-Expert

8.0.6軟件設(shè)計(jì)四因素三水平共29個(gè)試驗(yàn)，其中心點(diǎn)重復(fù)5次試驗(yàn)，以木脂素含量為響應(yīng)值，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表4。

利用Design-Expert8.0.6軟件對表4中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元擬合，得到五味子醇甲對乙醇濃度（X1）、料液比（X2）、提取次數(shù)（X3）、提取功率（X4）的二元多項(xiàng)模型方程分別為：

Y醇甲=-19.18341+0.15717*X1+0.68745×X2+1.73405*

X3+0.017979*X4+2.01500×10-3*X1X2-0.0269*X1X3+1.73225×104*X1X4+0.019755*X2X3-9.69150×10-4*X2X4+7.49500×10-4*

X3X4-1.52812×10-3*X12-4.14543×10-3*X22-0.11441*X32-9.11233×10-6*X42;對該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5。從表中可看出模型的F值和P值（F醇甲=3.94、P醇甲=0.0075;F醇乙=10.52、P醇乙<0.0001;F甲素=9.13、P醇甲<0.0001;F乙素=7.59、P醇甲=0.0003），表明模型對提取工藝影響極顯著。R醇甲2=0.8977、R醇乙2=0.9132、R甲素2=0.9012、R乙素2=0.8835，變異系數(shù)（C·V%）分別為10%、20.14%、23.95%、31.21%，Radj醇甲2=0.8954、Radj醇乙2=0.8264、Radj甲素2=0.8025、Radj乙素2=0.8671，表明模擬程度良好，試驗(yàn)誤差較小。根據(jù)回歸方程中的各項(xiàng)系數(shù)及表5回歸方程的方差結(jié)果可知，在所選因素范圍內(nèi)各個(gè)因素對五味子木脂素提取含量的影響順序，五味子醇甲和五味子醇乙：提取濃度>料液比>提取次數(shù)>提取功率;五味子甲素和五味子乙素：提取濃度>提取次數(shù)>料液比>提取功率。

響應(yīng)面曲面可較直觀的反映各因素及兩兩因素的交互作用對響應(yīng)值（木脂素含量）的影響。五味子微波提取的響應(yīng)面3D圖（略），乙醇濃度對微波提取木脂素含量影響最大，提取功率影響最小。

運(yùn)用Design-Expert8.0.6軟件優(yōu)化得到的微波提取木脂素最佳提取工藝為乙醇濃度83.97%，料液比為1∶15，提取次數(shù)為2次，提取功率為763.24W，在此條件下五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的含量分別為3.8017、0.9158mg/g、0.9792mg/g、2.5823mg/g。考慮到微波功率參數(shù)為整數(shù)，將提取條件調(diào)整為乙醇濃度84%，料液比為1∶15，提取次數(shù)為2次，提取功率為800W。

4 結(jié)論

本研究以五味子中4種含量高的木脂素為測定目標(biāo)，利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化微波提取技術(shù)提取五味子中木脂素成分，通過四因素、三水平的Box-Benhnken 設(shè)計(jì)優(yōu)化得到最佳微波提取工藝，提供一個(gè)從五味子中提取木脂素較為有效的方法。

經(jīng)響應(yīng)曲面法優(yōu)化后的五味子木脂素微波提取工藝，是以乙醇濃度、料液比、提取次數(shù)、提取功率四個(gè)因素為最低值和五味子醇乙含量為最高值來進(jìn)行預(yù)測，實(shí)現(xiàn)了以五味子為原料提取木脂素成分節(jié)省試劑、耗能低、耗時(shí)短、效率高等特點(diǎn)，為微波提取五味子中木脂素成分提供一個(gè)較為有效的方法。

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作者簡介：趙大偉，在讀本科生，研究方向：制藥工程。

通迅作者：劉俊霞，博士研究生，講師，研究方向：中藥新藥開發(fā)與利用。