宋立民　于清海　袁立來　司飛　任玉芹　任建功　張紅濤　李楠

摘 ? ?要：以秦皇島海域回捕牙鲆為材料，應用分子標記將其分成放流和非放流2組，采用形態(tài)學測量、鑒定方法并結合DNA條形碼技術對比分析了2組牙鲆的生長和攝食狀況。結果顯示：（1）放流牙鲆的體長和體質量略大于非放流牙鲆，肥滿度、脂肪含量和腸體比值略小，經過獨立樣本T檢驗，各參數(shù)值的差異并不顯著（P>0.05）;（2） 2組牙鲆的空胃率較高，攝食強度差異不顯著（P>0.05）;（3）胃含物組成和種類基本一致，包括魚類、軟體動物、多毛類和蝦類;（4）針對4種不可辨認的胃含物提取組織DNA，選用線粒體DNA COI基因片段作為分子標記，在Gen Bank中進行比對分析，并利用MEGA 4.0構建NJ系統(tǒng)進化樹，結果鑒定出一種鰕虎魚（Gobiidae sp.）、一種石首魚（Sciaenidae sp.）、赤鼻綾鯷（Thryssa kammalensis）和火槍烏賊（Loliolus beka）。進而說明放流牙鲆經過禁漁期的適應，已經恢復了在增殖海域生存的能力。

關鍵詞：牙鲆;增殖放流;生長指標;胃含物;DNA條形碼

中圖分類號： S932.4 ? ? ? ? 文獻標識碼： A ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.05.008

Growth and Feeding Status of the Captured Population of Paralichthys olivaceus

SONG Limin1，2， YU Qinghai2， YUAN Lilai3， SI Fei2， REN Yuqin2， REN Jiangong2， ZHANG Hongtao2， LI Nan1

（1.Tianjin Fisheries Research Institute， Tianjin 300221， China;2.Beidaihe Central Experiment Station， Chinese Academy of Fishery Sciences， Qinhuangdao， Hebei 066100， China;3.Fisheries Resource and Environment Research Center， Chinese Academy of Fishery Sciences， Beijing 100141， China）

Abstract： The captured population of Japanese flounder in the Qinhuangdao coastal releasing area were divided into two groups by molecular markers， which were the released group and non-released group. Differences of growth indexes and dietary composition between the two groups were compared and analyzed by morphological method and molecular technology. The results showed that： （1） the values of body length and weight in the released group were higher than the non-released group， while the values of condition factor and whole body crude lipid content and viserosomatic index were lower， and all of those did ?not ?show ?any ?significant ?differences ?between the released P. olivaceus and non-released P. olivaceus （P>0.05）; （2） high gastric vacuous rate were showed in released and non-released groups， while values of feeding intensity were not significantly different from each other; （3） stomach contents of the released P. olivaceus and non-released P. olivaceus had little differences， including pisces， mollusk， polychaeta and decapoda; （4） DNA were extracted from 4 sampled fish stomach contents which could not be identified by morphological observation， Mitochondrial DNA COI was amplified as molecular marker， comparative analysis were conducted in Gen Bank， and NJ phylogenetic trees were established by MEGA 4.0， results of a Gobiidae sp.， a Sciaenidae sp.， Thryssa kammalensis and Loliolus beka were identified. Furthermore the released P. olivaceus had pretty much adapted to the wild after the closed season.

Key words： Paralichthys olivaceus; artificial stock enhancement; growth indexes; stomach contents analysis; DNA barcoding

牙鲆（Paralichthys olivaceus）屬于鰈形目、鰈亞目、牙鲆科、牙鲆屬，以黃渤海區(qū)分布較多，其主要捕食底棲非經濟魚類及甲殼類，具有肉質細嫩鮮美、洄游性小、回歸性強等特點[1]。由于捕撈強度的增加和環(huán)境污染的加劇，牙鲆資源顯著減少[2]，為此，我國自20世紀80年代開始在渤海海域進行牙鲆的增殖放流活動[3]，并且規(guī)模逐漸擴大，目前僅秦皇島近海每年就有數(shù)百萬的牙鲆苗種被投放，已成為我國牙鲆增殖放流的主要區(qū)域之一[4]。但是在放流效果評估方面，有研究[5]表明，與高等脊椎動物相比，魚類具有較強表型可塑性，由于傳統(tǒng)繁育場的物理環(huán)境、生物及社群環(huán)境與自然環(huán)境截然不同，加之人工選育的影響，將使養(yǎng)殖群體與野生群體在生物學、行為、生態(tài)適應性和遺傳多樣性等方面表現(xiàn)出差異。目前，已有關于增殖放流對秦皇島海域野生牙鲆遺傳多樣性影響方面的研究報道[4]，但還未見到有關秦皇島海域放流牙鲆生長和攝食情況方面的調查研究，鑒于此，本研究以2015年禁漁期結束后3個月（9—11月）在秦皇島海域回捕的當年生牙鲆幼魚為材料，初步調查和研究了放流群體與野生群體攝食和生長方面的差異，以期為放流牙鲆生長和攝食生態(tài)方面的研究提供參考數(shù)據(jù)，并具體評估放流對象的環(huán)境適應情況，進一步指導增殖放流活動。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

從2015年9月至11月，連續(xù)3個月在秦皇島市轄區(qū)內山海關區(qū)、北戴河區(qū)、昌黎縣主要碼頭漁港回收捕撈牙鲆569尾，參考童愛萍等[6]方法，利用分子標記鑒別出放流個體261尾，非放流個體308尾。

1.2 試驗方法

1.2.1 生長相關參數(shù)測定 用精確到0.01 g的電子天平測量樣本魚體質量（W），對魚體拍照后，采用Motic Images Plus 2.0軟件測定魚體長（L）。肥滿度（CF）的計算公式為（CF）=（W/L3）×100，采用索氏抽提法（GB 5009.6-2016）測定全魚脂肪含量。

1.2.2 腸體比測定 主要參考王青林等[7]方法，具體操作如下：解剖樣本，剪取完整消化道裝袋，稱質量并編號，冷凍待測。對消化道進行稱質量時，先用濾紙吸去表面水分，然后用電子天平（精度0.01g）稱量。腸體比（VI）按照以下公式計算：VI=100%×Wi/W，

其中，Wi為腸質量（g）;W為魚體質量（g）。

1.2.3 攝食強度判斷 參考紀東平等[8]方法根據(jù)胃的飽滿程度將攝食等級分為0～4級：0級，胃中無食物;1級，胃中有少量 （<1/2） 食物;2級，胃中有適量（≥1/2）食物;3級，胃中充滿食物，但胃壁不膨大;4級，胃中充滿食物，并且胃壁膨大。

1.2.4 胃含物分析 方法參考紀東平等[8]。采用形態(tài)學觀察，主要針對食物當中不易消化或未被消化部分，如魚類耳石、骨骼、蝦類額劍等，利用解剖鏡、顯微鏡等工具鑒定食物種類，計算餌料出現(xiàn)頻率;公式如下：

出現(xiàn)頻率=某餌料生物出現(xiàn)次數(shù)/總胃數(shù)×100%

采用DNA條形碼鑒定，具體操作介紹如下：針對形態(tài)上不能準確鑒定的食物團置于無水乙醇中保存，用于DNA條形碼鑒定。

（1） DNA提取。取相對完整的樣品組織20～30 mg，使用海洋動物基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN，DP324）提取基因組DNA。提取完成后，采用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計分別檢測DNA的質量和濃度。

（2） 線粒體DNA COI基因片段擴增。魚類和蝦蟹類使用的引物名稱、引物序列、退火溫度等見表1，引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。PCR反應體系為20 μL，包括dH2O 7.4 μL，2×Es Taq MasterMix 10 μL，上下游引物（10 pmol·μL^-1）各0.3 μL，DNA模板2 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性45 s，52 ℃復性45 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán);最終72 ℃延伸10 min。取2 μL PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用回收試劑盒對目的條帶進行回收和純化，之后送生物公司進行正反鏈測序。

（3）序列分析。使用DNASTAR軟件包對測得序列進行編輯和人工校正;使用NCBI的BLAST進行序列比對分析;通過MEGA 4.0構建鄰接關系樹，并計算遺傳距離。

2 結果與分析

2.1 生長情況

回收所得兩類樣本之間各參數(shù)值見表2，放流牙鲆的體長和體質量平均值略大于非放流牙鲆，肥滿度、脂肪含量和腸體比值略小，獨立樣本T檢驗結果表明參數(shù)值差異不顯著（P>0.05）。

2.2 攝食強度

放流牙鲆和非放流牙鲆樣本的攝食情況如表3，攝食強度均以0級所占比例最高，占到84%，1級占13.28%，2級占2.38%，罕見飽食個體，2組樣本測定數(shù)據(jù)差異不顯著（P>0.05）。

2.3 胃含物組成

回捕牙鲆樣本的食物組成見表4。除放流牙鲆攝食大瀧六線魚和蛇尾外，2組牙鲆所攝食其他食物種類基本相同，包括魚類、軟體動物、多毛類和蝦類。按出現(xiàn)頻率來分，放流牙鲆攝食種類依次為魚類、軟體動物、蝦類、多毛類和蛇尾;非放流牙鲆攝食種類依次為魚類、蝦類、多毛類和軟體動物。魚類出現(xiàn)頻率最高，分別為82.78%（放流牙鲆）和72.85%（非放流牙鲆）。

2.4 利用DNA條形碼鑒定不可辨認牙鲆餌料生物種類

分析餌料生物組成的過程中，發(fā)現(xiàn)4種胃含物樣本，包括3種魚類和1種頭足類，采用形態(tài)學方法無法具體分辨其為何種。利用DNA 條形碼進行鑒定的結果如圖1。

對樣本1中不可辨認魚類擴增得到COI序列的長度為680 bp，BLAST分析相似性最高 （99%） 的相關序列及對應物種是HQ711866.1 （Chaeturichthys stigmatias）、HQ711875.1（Acanthogobius ?hasta）、JN242585.1

（Oxyurichthys tentacularis）和JQ343912.1 （Rhinogobius maculafasciatus），下載序列與樣本比對，遺傳距離分別為0.005，0.007，0.005和0.005。鄰接關系樹顯示，樣品1與他們聚為一支。因此認定樣品1是鰕虎魚科中的一種 Gobiidae sp.。

對樣本2中不可辨認魚類擴增得到COI序列的長度為679 bp，BLAST分析相似性最高 （99%） 的相關序列及對應物種是HM180638.1（Larimichthys crocea）、HQ711868.1（Johnius belangerii） 和KX777972.1 （Johnius heterolepis），與樣品2的遺傳距離分別為0.015，0.010，0.015。鄰接關系樹顯示，樣品2與他們聚為一支。因此認定樣本2是石首魚（Sciaenidae sp.）中的一種。

對樣本3中不可辨認魚類擴增得到COI序列的長度為677 bp，BLAST分析相似性最高 （100%） 的相關序列是KP403952.1 （Thryssa kammalensis）。下載相似度臨近序列EF607589.1（Thryssa hamiltonii）、KP403952.1（Thryssa kammalensis）和KU942838.1（Thryssa chefuensis）與樣本比對，遺傳距離分別為0，0和0.002。鄰接關系樹顯示，樣品4與EF607589.1（Thryssa hamiltonii）、KP403952.1（Thryssa kammalensis） 聚為一支。結合表4中形態(tài)學鑒定結果，認定樣本3可能為赤鼻棱鳀 （Thryssa kammalensis）。

對樣本4中不可辨認頭足類擴增得到COI序列的長度為676 bp，BLAST分析相似性最高 （99%） 的相關序列及對應物種是HQ529509.1（Loliolus beka）。下載相似度臨近序列HQ529509.1（Loliolus beka）和HQ529522.1（Loliolus japonica）與樣本比對，遺傳距離分別為0.008和0.112。鄰接關系樹顯示，樣品4與HQ529509.1（Loliolus beka） 聚為一支。因此，認定樣品4 可能是火槍烏賊（Loliolus beka）。

3 結論與討論

3.1 生長方面

水生動物增殖放流對野生種群破壞后資源的恢復具有重要的意義，也是目前國內外進行資源修復的主要措施[9-10]，但是人工培育環(huán)境與野生環(huán)境條件是有差別的，如光照、海流、底質、敵害生物等環(huán)境條件的變化會對放流對象的攝食和生長產生一定的影響。

放流牙鲆與自然海域的同年牙鲆相比，起始培育時間較早且培育水溫高，因此其體長和體質量值都較高。放流后，由于增殖海域的環(huán)境異于人工培育環(huán)境，在進入新的生存環(huán)境初期，魚總會有一個被脅迫和逐步適應的過程，該階段攝食水平一般較低，生長會略受影響[11-13]，因此會造成放流牙鲆與非放流牙鲆生長略有差異但數(shù)值差異性不顯著的結果。腸體比在一定程度上反映了個體對餌料的吸收和消化能力[14]，腸體比小，自然會影響放流魚的生產性能和采食量[15]，造成能量積累效率低，個體肥滿度和體脂肪含量偏低。不過鑒于放流牙鲆與非放流牙鲆生長參數(shù)值比較接近，說明放流牙鲆經過休漁期，已經基本上適應了自然環(huán)境，所以研究結果與韓現(xiàn)芹等[16]、胡盼[17]存在不同。

3.2 DNA條形碼在胃含物鑒定中的應用

對于特征明顯的樣品，采用形態(tài)學方法能夠直接、迅速得出結果;但是如果樣品量達不到標準或者特征不明顯就有可能誤診或者漏診，造成結果不準確、不全面。結合DNA條形碼技術，就克服了上述缺點，并且2種方法的結合能夠提供更多的種類信息[18]。

DNA 條形碼（DNA barcoding）是一種基于分子生物學技術進行物種鑒定的新方法，在進行胃含物傳統(tǒng)的形態(tài)學分析過程中，結合此技術進行有針對性的鑒定，具備比較大的應用潛力[19]。現(xiàn)已有國內外學者將DNA條形碼技術應用到食性分析中，并取得較好效果[8，19-24]。在本次胃含物樣本分析過程中為了解決在形態(tài)分析上面臨的困難，采用了DNA條形碼技術，同樣得到了較圓滿的結果。

DNA條形碼技術優(yōu)勢主要表現(xiàn)在，能夠鑒定出現(xiàn)存量較少、不完整的樣本種類，且操作簡便，適用范圍廣，準確率較高，但是此方法依賴于物種鑒定和分類相關DNA序列的數(shù)據(jù)積累[19，25]。另外，DNA條形碼僅能滿足于定性鑒定的要求，不能達到定量分析的目的，因此還需要結合形態(tài)學觀察進行定量分析，才能得到較完整的食性分析結果[18]。

3.3 攝食情況分析

調查結果表明回捕牙鲆空胃率較高，參照龔玉艷等[26]對南海鳶烏賊攝食習性的分析方法，表明牙鲆在采樣前一段時間內，該海域可供牙鲆攝食的餌料生物量比較少，或者環(huán)境有過劇烈的波動，也可能由于放流時間和放流活動過于集中，而牙鲆游動擴散能力較弱[17]，造成區(qū)域內食物量相對偏少，這也是一段時間內牙鲆肥滿度偏低的原因。

有關牙鲆的食物組成，劉嬋馨和秦克靜[27]認為其食物種類廣泛，以魚類為主，其次為蝦類、蟹類、軟體動物、環(huán)節(jié)動物和棘皮動物等;竇碩增和楊紀明[28]認為渤海南部牙鲆的食性同樣以魚類為主，軟體動物及甲殼類居其次，?？悶榕既恍允澄?。顯然，牙鲆是捕食性（游泳生物食性）魚類，本次研究結果同樣表明牙鲆的主要食物為魚類，但是具體餌料魚的種類上是有區(qū)別的，經過調查和鑒定，餌料魚主要是矛尾蝦虎魚、小黃魚、叫姑魚等，而竇碩增和楊紀[28]報道為斑鰶、鳀魚、黃鯽、六絲矛尾蝦虎魚及焦氏舌鰨等，另外，鑒定結果胃含物中也沒有發(fā)現(xiàn)棘皮動物和海葵，這有可能是樣本生長階段差異或者餌料豐度和種類不同影響所致。