黎武 宋勁松

肝纖維化即肝細(xì)胞因炎癥或壞死而誘導(dǎo)的肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生的過程，是肝硬化的重要病理基礎(chǔ)[1-2]。N-乙?；?絲氨酰-天冬氨酰-賴氨酰-脯氨酸( N-acetyl-ser-yl-aspartyl-lysyl-proline，Ac-SDKP)是一種短肽，是某些致纖維化細(xì)胞因子的重要上游激活因子，與肺及其他組織纖維化病理改變存在密切聯(lián)系[3]。Smad7是轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)信號路徑的一種負(fù)調(diào)節(jié)因子，可誘導(dǎo)TGF-β活化，導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化[4]。過氧化酶活化增生受體γ抗體(PPAR- γ)是配體激活核轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，是炎癥、動脈粥樣硬化等多種病理生理改變的調(diào)控因子。本研究觀察肝纖維化患者的Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ的表達(dá)水平，并分析其臨床意義。

資料與方法

一、 患者一般資料

選取2017年2月至2018年2月在我院接受治療的肝纖維化患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥18周歲；(2)經(jīng)影像學(xué)檢查確診為肝纖維化；(3)未合并其他系統(tǒng)疾??；排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)相關(guān)資料不全者；(2)伴肝癌者。參照前述標(biāo)準(zhǔn)共納入80例患者，其中男55例，女25例，年齡41～82歲，平均(54.85±3.22)歲，肝硬化病程4～15年，平均(8.35±1.47)年；對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥18周歲；(2)影像學(xué)檢測顯示肝囊腫；(3)未合并其他系統(tǒng)疾病，共納入80例，男45例，女35例，年齡45～75歲，平均(56.88±3.27)歲。兩組年齡、性別等一般資料具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會評審?fù)ㄟ^，且所有患者均知情同意。

二、方法

對所有患者進(jìn)行穿刺活檢，將10 mg病理樣本打碎制備為懸液，3 500 r/min，12 cm半徑，離心10 min后，滴入10%血清置于溫箱內(nèi)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取部分樣本轉(zhuǎn)染Smad7，并將其稀釋至96孔板內(nèi)培養(yǎng)24 h，隨后選取Western blot法檢測Smad7表達(dá)水平，相關(guān)試劑由上海生工提供，操作參照說明書進(jìn)行。

將10 mg病理樣本常規(guī)切片，并用2%APES處理10 min，枸櫞酸鹽緩沖液修復(fù)抗原。同時(shí)將PPAR-γ抗體稀釋為1∶100，以PBS為一抗陰性對照，以PPAR-γ為陽性對照，根據(jù)美國Santa Cruz公司提供的PPAR-γ試劑盒說明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)一步法檢測。

將10 mg病理樣本打碎，滴入2 mL PBS進(jìn)行勻漿，置于-25 ℃溫箱內(nèi)過夜，以破壞細(xì)胞膜。低溫3 500 r/min離心6 min，取上清，參照上海易匯生物科技有限公司提供的Ac-SDKP ELISA試劑盒進(jìn)行檢測。同時(shí)選用北京普朗(集團(tuán))有限公司生產(chǎn)的PUZS-300普朗全自動生化分析儀檢測患者肝功能指標(biāo)。并選用ELISA法檢測患者TGF-β1、TNF-α和IL-6水平，試劑盒由武漢默沙克生物科技有限公司提供，參照說明書進(jìn)行操作。

三、評價(jià)指標(biāo)

觀察兩組患者肝組織Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ相對表達(dá)量，比較兩組肝功能指標(biāo)(ALT、AST和Alb)、細(xì)胞因子(TGF-β1、TNF-α和IL-6)水平的差異，分析肝纖維化患者Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ表達(dá)水平與肝功能和細(xì)胞因子水平的相關(guān)性。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)錄入后，采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)和計(jì)量資料則應(yīng)用例和均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行處理。選用t檢驗(yàn)對患者肝組織Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ等細(xì)胞因子表達(dá)水平進(jìn)行分析，同時(shí)借助Pearson相關(guān)分析法分析肝纖維化患者Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ表達(dá)水平與肝功能間的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組患者肝組織Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ相對表達(dá)量比較肝纖維化患者肝組織Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ相對表達(dá)量低于對照組(P均<0.001)。見表1。

表1 兩組患者肝組織Ac-SDKP、Smad7

二、兩組患者肝功能指標(biāo)比較

肝纖維化患者的ALT、AST水平均高于對照組(P均<0.001)。見表2。

表2 兩組患者肝功能指標(biāo)的比較

三、兩組患者細(xì)胞因子水平的比較

肝纖維化患者TGF-β1、TNF-α和IL-6水平均高于對照組(P均<0.001)。見表3。

表3 兩組患者細(xì)胞因子水平的比較

四、肝纖維化患者Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ與肝功能和細(xì)胞因子的相關(guān)性

肝纖維化患者的Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ表達(dá)量與ALT、AST、Alb、TGF-β1、TNF-α和IL-6水平負(fù)相關(guān)(P均<0.05)。

討 論

本研究中，肝纖維化患者TGF-β1水平顯著高于對照組，證實(shí)TGF-β1是肝纖維化的重要危險(xiǎn)因子。既往研究顯示，TNF-α和IL-6也是肝纖維化的重要參與因子，這與該兩種物質(zhì)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)[5]。本研究中，肝纖維化患者TNF-α和IL-6水平高于對照組。有研究發(fā)現(xiàn)TNF-α還可促大鼠肝細(xì)胞合成大量膠原蛋白及蛋白多糖；而IL-6則對Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白具有促進(jìn)作用[6]，表明TNF-α和IL-6還可通過影響細(xì)胞外基質(zhì)合成、降解來參與肝纖維化。

Smad7作為TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)控因子，可有效阻滯TGF-β信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。肝臟損傷時(shí)，自分泌TGF-β激活肝星狀細(xì)胞，同時(shí)TGF-β可促使Smad7一過性高表達(dá)，以實(shí)現(xiàn)TGF-β/Smads信號通路的正負(fù)平衡[7]。而Smad7的活化將抑制TGF-β受體TR1對Smad7家族成員Smad2、Smad3的磷酸化，同時(shí)促進(jìn)TR1的自降解，阻滯TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。提示Smad7對TGF-β具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)能力。本研究中，肝纖維化患者肝組織Smad7相對表達(dá)量高于對照組，這與Smad7的TGF-β負(fù)反饋調(diào)節(jié)能力有關(guān)。Ac-SDKP具有促細(xì)胞黏附、促炎性細(xì)胞趨化以及降解細(xì)胞外基質(zhì)功能。Ac-SDKP可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞增殖、分化能力，同時(shí)還可抑制Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)[8]。本研究中，肝纖維化患者肝組織Ac-SDKP相對表達(dá)量高于對照組，說明肝纖維化患者Ac-SDKP應(yīng)激性增高。PPAR-γ具有多種生物活性，其在炎癥、細(xì)胞質(zhì)增殖、細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)代謝等生理活動中發(fā)揮重要作用[9]。本研究中，肝纖維化患者肝組織PPAR-γ相對表達(dá)量高于對照組，表明PPAR-γ與肝纖維化密切相關(guān)。肝纖維化大鼠PPAR-γ可通過抑制FAK下游PI3K/AKT信號通路的激活，并以此抑制纖維化發(fā)展，這可能是本研究中肝纖維化患者肝組織PPAR-γ相對高表達(dá)的原因[10]。隨后的相關(guān)性研究顯示，肝纖維化患者的Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ表達(dá)量與ALT、AST、TGF-β1、TNF-α和IL-6水平負(fù)相關(guān)，表明肝纖維化患者疾病嚴(yán)重程度與其Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ水平相關(guān)，提示Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ或可成為肝纖維化診斷及嚴(yán)重程度評估的重要指標(biāo)。