劉婷婷 張偉 李澤方 蒙姿宏 屠紅 甘愉

肝纖維化作為慢性肝損傷的修復(fù)反應(yīng)，是慢性肝病向肝硬化、肝癌發(fā)展的必經(jīng)中間環(huán)節(jié)和可逆階段[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，多種免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子構(gòu)成的免疫微環(huán)境在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色。IL-22作為其中的一種細(xì)胞因子，可以與IL-22RA1和IL-10RA2組成的異源二聚體受體結(jié)合，在肝纖維化過程中發(fā)揮保護(hù)和促進(jìn)組織修復(fù)的作用[2]。

肝臟作為機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)明顯的器官之一，有關(guān)心理應(yīng)激與肝病關(guān)系的研究目前多集中在肝病發(fā)生之后患者抑郁情緒的產(chǎn)生和加重[3-4]，而心理情緒對肝病發(fā)生發(fā)展的影響，尤其是良性心理應(yīng)激對肝臟病理過程的作用，國內(nèi)外研究較少。EE是目前普遍接受的良性心理應(yīng)激模型，它比SE具有更大的空間，更多的小鼠成員和更為多樣新奇的玩具設(shè)施，給小鼠提供了更多的社交機(jī)會和運(yùn)動刺激，較好的模擬了人們生活中的社交、運(yùn)動、適度生存挑戰(zhàn)的狀態(tài)。

本研究中，我們將EE模型引入對肝纖維化的研究中，在成功構(gòu)建EE誘導(dǎo)的良性心理應(yīng)激模型的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步建立CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型，以期探究EE對小鼠肝纖維化發(fā)生發(fā)展的影響及作用機(jī)制，為臨床提供新的診療思路。

資料與方法

一、材料

(一)動物 野生型雄性3周齡C57BL/6小鼠購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2013-0016]。所有動物飼養(yǎng)操作規(guī)范符合上海市腫瘤研究所醫(yī)學(xué)動物委員會的指導(dǎo)方法。

(二)主要試劑 CCl4購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，橄欖油購自生工生物工程(上海)有限公司，高架十字迷宮和SuperMaze軟件購自上海欣軟信息科技有限公司，ALT試劑盒購自上?？迫A生物工程股份有限公司，蘇木素染色液購自北京鼎國昌盛生物科技有限責(zé)任公司，伊紅染色液購自上海源葉生物科技有限公司，Sirius Red染色液購自武漢賽維爾生物科技有限公司，ELISA試劑盒購自美國R&D Systems公司，Trizol Reagent購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司，qPCR試劑SYBR Green Mix購自瑞士Roche公司。引物由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司合成。

二、方法

(一)小鼠飼養(yǎng)環(huán)境分組 3周齡雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為SE組和EE組。SE籠大小為26 cm×16 cm×13 cm，每籠4只小鼠，每周更換新的籠子和墊料。EE籠大小為61 cm×43 cm×21 cm，每籠12只小鼠，并放置跑輪、管道、房屋、廁所、蹺蹺板等木制玩具，房屋處放少許棉花，廁所撒放浴沙，每半周更換玩具位置，每周更換新的籠子、玩具和墊料。環(huán)境溫度維持為20±2℃，濕度維持為40%～60%，維持明暗周期為12 h(6∶00-18∶00)，小鼠自由飲水和進(jìn)食。

(二)高架十字迷宮實驗 高架十字迷宮(elevated plus maze, EPM)由高出地面50cm的一對開臂和一對閉臂組成，臂長30 cm，臂寬5 cm，閉臂兩側(cè)有20 cm高的不透明板封閉，四個臂呈十字交叉。實驗開始前，將房間內(nèi)的光照亮度調(diào)整為(20±2)lux。實驗開始時將小鼠置于迷宮中央?yún)^(qū)域，頭部朝向開放臂，釋放后立即通過行為學(xué)系統(tǒng)分析SuperMaze軟件記錄小鼠在各個區(qū)域的持續(xù)時間及路程等參數(shù)，實驗結(jié)束后將小鼠放回原飼養(yǎng)環(huán)境。每只小鼠測試后用含75%乙醇溶液的棉球清理小鼠排泄物并用干棉球擦干迷宮。

(三)肝纖維化模型的建立 48只C57BL/6小鼠隨機(jī)分配在兩組SE和兩組EE，每組12只，在SE籠和EE籠中飼養(yǎng)3周后，每周兩次腹腔注射10% CCl4橄欖油溶液5 μL/g(0.5 μL/g CCl4)，連續(xù)注射6周。為了更好的觀察該發(fā)展過程中肝臟的急性損傷和修復(fù)階段，分別在CCl4最后一次注射后1 d和5 d處死SE和EE小鼠，留取血清和肝臟組織備用。

(四)小鼠一般情況觀察 包括建模過程中小鼠的精神狀況、毛發(fā)澤度、活躍程度、每周體重和飼料攝入量的變化，并做好記錄。

(五)血清學(xué)ALT檢測 小鼠全血室溫靜置2 h，3 000 rpm，4℃離心15 min，取上清，按丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒說明書進(jìn)行檢測并計算。

(六)小鼠肝組織病理學(xué)檢測 取小鼠肝組織標(biāo)本用4%多聚甲醛固定后，梯度脫水、透明及透蠟后制作石蠟包埋塊、5 μm切片并經(jīng)HE染色和Sirius Red染色，中性樹膠封片，在倒置顯微鏡下比較各組肝組織結(jié)構(gòu)及纖維化程度并拍照。

(七)小鼠肝組織ELISA檢測 肝臟組織自-80℃冰箱取出后，加入RIPA裂解液研磨充分，12 000 rpm，4℃離心10 min，上清稀釋后經(jīng)BCA法測定蛋白濃度，并按IL-22 ELISA試劑盒說明書檢測并計算IL-22表達(dá)。

(八)小鼠肝組織RNA提取及RT-qPCR檢測 肝臟組織自-80℃冰箱取出后，通過Trizol法提取總RNA并測定濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并利用SYBR Green體系進(jìn)行實時定量PCR檢測，IL-22RA1上游引物為5’-GACTA-TGGAGACCCGCAACC-3’，下游引物為5’-GCGGT-TTGATGGTAGTGTGC-3’；IL-10RA2上游引物為5’-CTTCTGGTGCCAGCTCTAGG-3’，下游引物為5’-GGAAAGCAGGTACCTCCCAC-3’；內(nèi)參GADPH上游引物為5’-AAGATGGTGAAGGTCGGTGT-3’，下游引物為5’- GTTGATGGCAACAATGTC-CAC-3’。用儀器自帶軟件(AB7500)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計算2-△△Ct值。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、 小鼠焦慮水平的檢測、一般情況記錄及肝臟損傷變化

有文獻(xiàn)報道，EE能夠減輕小鼠成年后的焦慮樣行為[5]。為明確本研究中建立的小鼠EE模型是否成功，進(jìn)一步采用EPM行為學(xué)實驗檢測SE和EE組小鼠的焦慮水平。結(jié)果顯示，EE組小鼠在高架十字迷宮開放臂中的活動時間相對SE組升高1.46倍(P<0.05)(圖1A和1B)，提示EE模型建立成功。隨后將小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)于原環(huán)境中并開始注射CCl4誘導(dǎo)SE/EE下的肝纖維化動物模型。建模過程中，小鼠精神狀況良好，毛發(fā)光澤無脫落，各組均無死亡情況，EE組較SE組小鼠更為活躍，動作敏捷，飲食攝入量增多。體重變化情況表明，CCl4注射前EE組體重較SE組減輕，而CCl4注射后期EE組體重較SE組明顯增加，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1C)。對血清學(xué)ALT檢測發(fā)現(xiàn)，小鼠在CCl4最后一次注射后1 d，肝臟有明顯的急性損傷，EE組較SE組顯著減輕，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖1D)。

圖1 A. 小鼠EPM示意圖；B. SE和EE相對開臂時間比較；C. 小鼠體重變化趨勢比較；D. 各組小鼠ALT水平比較

二、 各組小鼠肝臟組織病理形態(tài)變化

HE染色顯示，SE組和EE組中均有不同程度的肝細(xì)胞腫大，胞質(zhì)疏松化，并伴有炎細(xì)胞的浸潤。CCl4最后一次注射后1 d，小鼠急性肝損傷較重，EE組肝細(xì)胞壞死面積小于SE組；注射后5 d，肝細(xì)胞再生修復(fù)，較注射后1 d壞死面積明顯減少，EE組肝細(xì)胞排列紊亂程度比SE組較輕(圖2)。

圖2 各組小鼠肝臟HE染色(100)

同時，Sirius red染色結(jié)果顯示，SE組可見明顯肝臟纖維結(jié)締組織增生，分割正常的肝臟組織，EE組明顯減弱了膠原纖維的沉積(圖3A)，通過對Sirius red面積定量進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，EE組較SE組顯著減低了Sirius red的面積，具有統(tǒng)計學(xué)意義(最后一次注射后1 d，P<0.001；5 d，P<0.01)(圖3B)。

三、各組小鼠肝內(nèi)IL-22信號通路表達(dá)情況

對各組小鼠肝臟樣本進(jìn)行ELISA檢測，CCl4最后一次注射后1 d結(jié)果表明EE組中IL-22表達(dá)與SE組相比明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖4A)。IL-22RA1和IL-10RA2是IL-22的結(jié)合受體，經(jīng)實時熒光PCR分析，CCl4最后一次注射后1 d結(jié)果表明EE組小鼠肝臟IL-22RA1和IL-10RA2較SE組均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(IL-22RA1，P<0.05；IL-10RA2，P<0.01)(圖4B)。CCl4最后一次注射后5 d，IL-22的表達(dá)水平以及受體IL-22RA1和IL-10RA2表達(dá)水平兩組間無差異(P>0.05)(圖4)。

討 論

心理應(yīng)激是能影響肝臟疾病發(fā)展的全身性因素之一，有研究明確，焦慮抑郁與慢性肝病有明顯的相關(guān)性[4]，并且肝病死亡率隨著心理壓力評分的增加而顯著增加[3]。目前，越來越多的研究運(yùn)用動物模型進(jìn)一步證實了心理應(yīng)激對肝臟疾病的調(diào)控作用，但主要集中于惡性心理應(yīng)激，如束縛應(yīng)激[6]等，然而研究良性心理應(yīng)激模型對臨床肝病的診療具有更為積極的意義。EE作為一種調(diào)控神經(jīng)可塑性的良性心理應(yīng)激手段，不僅對中樞神經(jīng)系統(tǒng)起到調(diào)控作用[7]，對于外周系統(tǒng)也起到全身性的調(diào)控作用[8]，本研究中我們首次將EE對機(jī)體的系統(tǒng)性調(diào)控作用擴(kuò)展到肝臟病理過程的研究中，觀察了EE誘導(dǎo)的良性心理應(yīng)激對肝纖維化病理過程的影響。我們發(fā)現(xiàn)EE明顯降低了小鼠的焦慮水平，減輕肝臟損傷，并顯著降低了CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化程度，該結(jié)果提示心理應(yīng)激對肝臟病理過程具有重要的調(diào)控作用，同時我們也為生活方式與肝病相關(guān)性研究提供了有效的實驗動物模型。

圖3 A. 各組小鼠肝臟Sirius red染色(100)；B. Sirius red面積定量比較

圖4 A. 各組肝臟組織IL-22 ELISA水平比較；B. 各組肝臟組織IL-22RA1、IL-10RA2水平比較

在機(jī)制研究中，我們發(fā)現(xiàn)在肝臟急性損傷階段，EE顯著上調(diào)了肝臟中IL-22水平，并促進(jìn)了IL-22受體IL-22RA1和IL-10RA2的表達(dá)。IL-22是一種由免疫細(xì)胞分泌的具有特定的生物學(xué)活性并參與機(jī)體炎癥性應(yīng)答的特殊前炎癥性細(xì)胞因子[9]，在研究刀豆蛋白A(ConA)誘導(dǎo)的急性肝損傷時，發(fā)現(xiàn)IL-22基因敲除小鼠對ConA誘導(dǎo)的肝損傷高度敏感，病理檢查顯示有更為廣泛的炎癥和損傷[10]。IL-22在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型中也發(fā)揮重要肝保護(hù)作用，有研究顯示IL-22與其受體結(jié)合后，可通過激活STAT3-SOCS3-p53信號通路，誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞衰老而減少肝纖維化[2]，同時IL-22也能直接減弱肝星狀細(xì)胞的活化并下調(diào)促炎因子的表達(dá)而減輕肝纖維化[11]，我們的結(jié)果則提示，EE可能通過激活肝臟中IL-22信號，從而減輕CCl4引起的肝損傷和肝纖維化。然而IL-22在不同肝臟疾病中所發(fā)揮的作用存在較大差異，在肝癌中IL-22過度表達(dá)發(fā)揮了抗凋亡和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增值、浸潤的作用[12、13]，并且在二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)的肝細(xì)胞癌模型中發(fā)現(xiàn)IL-22轉(zhuǎn)基因小鼠對肝癌的易感性顯著增加[14]。這提示IL-22的短期效應(yīng)和長期效應(yīng)可能是相反的，因此EE通過IL-22抑制肝纖維化的具體機(jī)制以及對于長期CCl4刺激誘導(dǎo)的肝硬化甚至肝癌的影響及機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。