吳光輝 李偉

肝細(xì)胞癌(HCC)是肝癌最主要的類型，病死率高[1]。目前，HCC的診斷主要依賴影像技術(shù)與甲胎蛋白(AFP)[2-5]。但30%～40%患者血清AFP 仍處于正常水平(<25 μg/L)，這類HCC也被稱為AFP陰性肝細(xì)胞癌(AFP-NHCC)[6]。AFP-NHCC的臨床診斷主要依賴于影像學(xué)檢查。然而，由于AFP-NHCC的瘤體通常較小，影像學(xué)檢查易漏診。近年研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA (circRNA)與高爾基體蛋白73(GP73)可通過(guò)多種途徑參與HCC發(fā)生、發(fā)展。本研究對(duì)300例AFP-NHCC患者、300例肝良性病變患者和300例健康對(duì)照血清circRNA PTENP1、circRNA HIPK3和GP73表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，旨在為AFP-NHCC的鑒別診斷提供新思路。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2013年1月至2018年1月在我院經(jīng)穿刺活檢或術(shù)中病理切片確診的AFP-NHCC患者300例為病例組，與同期我院經(jīng)影像學(xué)聯(lián)合病理確診的肝良性病變患者300例為良性病變組(肝硬化100例，肝血管瘤100例，肝囊腫100例)，300例于我院行常規(guī)體檢的健康人群為健康對(duì)照組。排除已接受放、化療治療及有其他惡性腫瘤病史者。對(duì)研究對(duì)象的年齡、性別、BMI、吸煙史、飲酒史等進(jìn)行采集。所有納入對(duì)象均簽署知情同意書。

二、血清circRNAs和GP73水平檢測(cè)

抽取研究對(duì)象外周血并分離血清。采用RT-PCR法檢測(cè)血清circRNAs表達(dá)水平，引物序列見(jiàn)表1。血清總RNA的提取按照血液RNA提取試劑盒(中國(guó)Bioteke公司)說(shuō)明書步驟進(jìn)行。使用去除基因組逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(中國(guó)Takara公司)逆轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。血清GP73檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附法，檢測(cè)試劑盒由武漢默沙克生物科技有限公司提供。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、三組研究對(duì)象的基本臨床信息

如表2所示，三組研究對(duì)象在年齡、性別組成、BMI、吸煙史、飲酒史等方面的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

二、三組間血清circRNA PTENP1、circRNA HIPK3和GP73水平

如表3所示，相比于良性病變組與健康對(duì)照組，AFP-NHCC患者血清circRNA PTENP1水平降低，而circRNA HIPK3、GP73水平均顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而肝良性病變組與健康對(duì)照組三者差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 引物序列

表2 三組研究對(duì)象的基本信息

表3 三組研究對(duì)象的血清circRNA PTENP1、circRNA HIPK3和GP73水平

與良性病變組比較，aP<0.05；與健康對(duì)照組比較，bP<0.05

三、ROC分析

血清circRNA PTENP1、circRNA HIPK3和GP73區(qū)分AFP-NHCC和非AFP-NHCC(包括健康人群和肝良性病變?nèi)巳?的AUC分別為：0.916(95%CI：0.842～0.991，P<0.001)、0.781(95%CI：0.704～0.893，P<0.001)和0.827(95%CI：0.761～0.913，P<0.001)，對(duì)應(yīng)的靈敏度/特異度分別為：78.9%/96.6%、69.3%/80.5%和70.3%/91.5%。聯(lián)合血清circRNA PTENP1、circRNA HIPK3、GP73區(qū)分AFP-NHCC和非AFP-NHCC(包括健康人群和肝良性病變?nèi)巳?的AUC為0.947(95%CI：0.853 ～ 0.997，P<0.001)，靈敏度為91.7%，特異度為92.8%。聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，鑒別AFP-NHCC的靈敏度顯著提高。

四、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

單因素和多因素(校正年齡、性別、BMI、吸煙史、飲酒史等因素后)分析顯示，血清低circRNA PTENP1與高circRNA HIPK3、GP73水平是AFP-NHCC發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見(jiàn)表4。

討 論

circRNA是長(zhǎng)鏈非編碼RNAs的一種，與線性RNAs不同，它是共價(jià)閉合環(huán)路。circRNA具有種類豐富、進(jìn)化保守、在細(xì)胞質(zhì)中相對(duì)穩(wěn)定的特性。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，circRNAs突變或異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，具有作為腫瘤分子標(biāo)志物的潛能。前期研究發(fā)現(xiàn)，circRNA HIPK3參與腫瘤化療耐藥、T細(xì)胞白血病和胃癌等的生物調(diào)控[7]；而circRNA PTENP1則是有望成為肝癌臨床診療的生物學(xué)標(biāo)志物[8]，但目前鮮有關(guān)于該兩項(xiàng)指標(biāo)與AFP-NHCC的報(bào)道。在本次研究中，我們檢測(cè)了AFP-NHCC患者與肝臟良性疾病和健康對(duì)照血清circRNA PTENP1與circRNA HIPK3水平，發(fā)現(xiàn)二者在AFP-NHCC患者與非AFP-NHCC人群中均存在差異性表達(dá)，且在鑒別診斷AFP-NHCC中具有較高價(jià)值。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，二者在AFP-NHCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中也具有潛在意義。GP73主要在膽管上皮細(xì)胞表達(dá)，正常人肝細(xì)胞中表達(dá)量極微。在發(fā)生肝細(xì)胞癌變時(shí)，GP73表達(dá)會(huì)明顯上調(diào)，且GP73 水平與肝癌組織分化程度相關(guān)[9]。前期研究發(fā)現(xiàn)，GP73在肝癌患者體內(nèi)水平顯著高于健康人群，具有作為肝癌早期標(biāo)志物的潛能[10]，但目前尚無(wú)相關(guān)研究對(duì)GP73與AFP-NHCC進(jìn)行探究。本研究中發(fā)現(xiàn)，GP73在AFP-NHCC患者體內(nèi)水平顯著增高，進(jìn)一步分析證實(shí)，GP73對(duì)AFP-NHCC具有較高的診斷和發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估價(jià)值。隨后，我們分析了血清circRNA PTENP1、circRNA HIPK3、GP73三項(xiàng)指標(biāo)對(duì)AFP-NHCC的聯(lián)合診斷價(jià)值，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合三項(xiàng)指標(biāo)可顯著提高診斷靈敏度，優(yōu)于單項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)價(jià)值。本研究結(jié)果與前期研究一致[7-10]，提示血清circRNA PTENP1、circRNA HIPK3、GP73三項(xiàng)指標(biāo)不僅在肝癌中具有應(yīng)用價(jià)值，對(duì)AFP-NHCC的診斷亦具有重要意義。

本研究有以下幾點(diǎn)不足：(1)納入的全部對(duì)象均源于我院，難免會(huì)造成選擇偏倚并在一定程度上影響結(jié)果準(zhǔn)確性；(2)納入的研究對(duì)象例數(shù)有限，今后需要更大人群的隊(duì)列研究證實(shí)；(3)未對(duì)circRNA PTENP1、circRNA HIPK3、GP73參與AFP-NHCC發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制進(jìn)行探討，未來(lái)可設(shè)計(jì)相應(yīng)的細(xì)胞與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入研究。

表4 血清circRNA PTENP1、circRNA HIPK3、GP73對(duì)AFP-NHCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)