唐穎悅 李靜 雷曉紅 李春敏 曾民德 茅益民

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)作為非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)中更具肝臟病變進展風險的臨床表型，已成為美國肝移植的第二大適應(yīng)證[1]。其發(fā)病機制復(fù)雜，迄今尚無藥物獲批用于NASH的治療。有研究認為，轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1(AP-1)在NASH進展中具有重要作用[2]，可通過調(diào)節(jié)Toll樣受體和PPARγ等信號通路影響NAFLD進展[3]。作為AP-1家族成員之一，B細胞轉(zhuǎn)錄激活因子(BATF)被認為是AP-1的抑制劑，主要表達于造血干細胞和免疫細胞如T淋巴細胞、B淋巴細胞、NKT細胞及巨噬細胞[4-5]。已有研究提示，BATF及其誘導的Th17細胞反應(yīng)可能在慢性乙型肝炎的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[6]。也有研究提示，BATF的表達異常與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7-8]。然而，目前鮮有研究探討B(tài)ATF對NASH的影響，本研究旨在通過NASH小鼠模型，初步探討B(tài)ATF在NASH進展中的潛在作用。

材料與方法

一、實驗動物、試劑及儀器

雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，購于上海斯萊克動物實驗中心。所有實驗小鼠均飼養(yǎng)于上海睿太莫斯生物科技有限公司實驗動物中心，SPF級獨立通風籠，自由飲食。MCD飼料(A02082002B)購于美國Research Diets公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購自日本Takara公司；PCR引物由上海生工合成，采用HAP方法純化，引物序列見表1。兔抗小鼠BATF抗體購自美國CST公司；兔二步法免疫組化檢測試劑盒、DAB染色液購自北京中杉金橋；Percoll購于德國GE Healthcare公司；流式細胞抗體、FoxP3固定和透化試劑盒均購自美國Biolegend和eBioscience公司。

二、動物分組及模型建立

雄性C57BL/6小鼠14只，隨機分成2組，每組各7只。在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始誘導小鼠NASH模型，實驗組小鼠進食MCD 8周；對照組小鼠進食正常飼料，實驗期間自由飲水，飼養(yǎng)溫度控制在(24±2)℃，濕度為(50±5)%，每天換水和墊料，每周稱量體重及進食量。到第8周末，對實驗組和對照組小鼠進行安樂死處理并收集相應(yīng)樣本。使用全自動生化檢測儀檢測小鼠血清ALT、AST。

三、小鼠肝組織RNA分離及RT-qPCR檢測

取適量肝臟組織，加入1 mL TRIzol裂解液后進行研磨裂解，加入200 μL氯仿后室溫靜置15 min，4 ℃，12 000 rpm離心15 min，取無色水相層加入異丙醇后室溫靜置30 min，4 ℃，12 000 rpm離心15 min，棄上清加入75%乙醇洗滌沉淀，DEPC水充分溶解沉淀并檢測mRNA濃度和純度。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并使用SYBR Green體系進行qPCR檢測，設(shè)3個復(fù)孔，以2-δδCT法計算基因相對表達量。

四、小鼠肝組織石蠟切片免疫組化

肝組織4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。包埋標本均切成4 μm薄片，65 ℃烘烤1 h，常規(guī)脫蠟、水化后，經(jīng)微波抗原修復(fù)，常規(guī)氧化水化，山羊血清封閉，一抗BATF(1∶500，美國CST)4 ℃封閉過夜。棄一抗，加入HRP標記的二抗，室溫孵育30 min，加入 PBS 洗滌3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。

五、流式細胞分析

小鼠肝臟沖洗干凈，取出并研磨，將細胞離心、沖洗，用Percoll分離液分離，棄上清后加紅細胞裂解液離心，用RPMI1640細胞培養(yǎng)液重懸調(diào)整計數(shù)細胞為106/mL,制成肝臟單細胞懸液備用。取肝臟單細胞懸液100 μL, 分別加入Brilliant Violet 421TManti-mouse F4/80(BM8)、APC anti-mouse CD206 (MMR)(C068C2)、Brilliant Violet 605TManti-mouse CD11c(N418)、Zombie NIRTMFixable Viability Kit各1.5 μL 輕柔混合,4 ℃孵育30 min后加入 PBS 洗滌2次，固定透化，先后加入PE F(ab')2 Donkey anti-Rabbit IgG、BATF 4 ℃孵育30 min后加入 PBS 洗滌2次上機檢測，用FlowJo軟件進行后期數(shù)據(jù)分析。

六、統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析,采用GraphPadPrism 7.0進行繪圖，計量資料采用均數(shù)±標準差表示。兩組間比較采用t檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman Correlation方法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、NASH模型肝組織BATF、TNF-α、IL-1β mRNA表達變化

成功構(gòu)建對照組和MCD組動物模型后，對各組肝臟樣本進行RT-qPCR檢測，結(jié)果表明，與對照組相比，MCD組小鼠肝組織中BATF表達明顯增加，同時，TNF-α和IL-1β表達水平明顯上調(diào)。提示在MCD飲食誘導的NASH模型中，肝臟BATF和促炎因子表達水平均明顯增加兩組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表2。

表1 PCR引物序列

表2 對照組和MCD組肝組織BATF、TNF-α、IL-1β mRNA表達水平(±s)

二、免疫組化檢測NASH模型小鼠肝組織BATF的表達

進一步確定BATF的表達水平和位置，如圖1A所示，對照組小鼠肝臟未見BATF陽性的細胞。然而，MCD組小鼠肝組織中可見BATF陽性細胞大量聚集在組織間質(zhì)，表達在細胞核中(見圖1B)，提示BATF在NASH肝組織中表達增強，且主要表達于間質(zhì)的炎性細胞胞核中。

圖1對照組和MCD組BATF蛋白表達(免疫組化DAB染色 200) A：對照組； B：MCD組

三、NASH模型肝巨噬細胞中BATF表達情況

應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測BATF在肝臟巨噬細胞中表達水平。結(jié)果顯示，MCD組F4/80+巨噬細胞的比例明顯高于對照組。MCD組的F4/80+BATF+細胞比例(52.24±13.43)%顯著高于對照組(16.39±6.49)%(P<0.01)。

分析巨噬細胞亞群發(fā)現(xiàn)，MCD組M1型巨噬細胞明顯高于對照組(P<0.01)，其中MCD組F4/80+CD11c+BATF+細胞比例(67.36±7.27)%明顯高于對照組(12.03±6.02)%(P<0.01)。而M2型巨噬細胞比例在兩組中無明顯差異。MCD組的F4/80+CD206+BATF+細胞比例(20.61±8.43)%明顯高于對照組(5.09±6.04)%(P<0.01)。以上結(jié)果表明，MCD組肝巨噬細胞大量浸潤，且以促炎作用的M1型巨噬細胞為主。同時，MCD組中BATF陽性的巨噬細胞比例明顯增多，以F4/80+CD11c+BATF+為主，提示BATF陽性的肝巨噬細胞參與NASH的發(fā)生、進展。

四、 BATF與臨床指標的相關(guān)性分析

對兩組肝組織BATF mRNA水平和生化指標ALT、AST以及肝臟組織學NAS評分進行Spearman Correlation分析。結(jié)果顯示，BATF與ALT、AST存在顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R分別為0.745和0.793(P<0.01)；BATF與NAS積分、肝臟脂肪變、小葉炎癥、氣球樣變評分均存在明顯正相關(guān)(R分別為0.912、0.877、0.912和0.877，P<0.01)。

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，NASH小鼠模型肝臟BATF表達明顯增高，并集中于肝臟的組織間質(zhì)。肝臟BATF陽性的巨噬細胞比例明顯升高，以F4/80+CD11c+BATF+為主，進一步的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，BATF水平與肝臟組織學評分以及肝臟生化的臨床指標存在顯著相關(guān)性。

免疫調(diào)控的失調(diào)以及炎癥浸潤在NASH進展中發(fā)揮著重要作用[9]。在炎癥早期，庫普弗細胞活化，驅(qū)動其他免疫細胞，參與肝損傷的發(fā)生、發(fā)展。庫普弗細胞極化為兩種不同亞型：促炎作用的M1型和抑炎作用的M2型。M1型分泌促炎因子如TNF-α、IL-1β等，同時通過增加二?；视娃D(zhuǎn)移酶的活性增加肝臟的脂肪變性，促進NAFLD進展。IL-1β可通過自分泌或旁分泌方式促使庫普弗細胞和肝星狀細胞持續(xù)性活化，加重體內(nèi)炎癥、纖維化形成。TNF-α可促進Il-1β和IL-6的釋放。本研究發(fā)現(xiàn)，MCD模型肝內(nèi)巨噬細胞以及M1型巨噬細胞比例明顯上升，TNF-α和IL-1β表達明顯增加，與Zhang等[10]研究一致。表明肝內(nèi)以M1型極化為主的巨噬細胞比例增加，并且該類細胞大量分泌促炎因子，可繼續(xù)招募炎癥細胞入肝，進一步加重炎癥反應(yīng)。

已有研究認為，AP-1家族是NAFLD疾病發(fā)展的重要靶點。成員Jun和Fos蛋白調(diào)節(jié)Toll樣受體可介導炎癥反應(yīng)[11]。Dorn等[2]發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者因肝臟脂肪變性誘導c-Jun表達水平明顯增加，加重了NAFLD的肝臟炎癥。既往報道發(fā)現(xiàn)，BATF水平增高與乙型肝炎患者肝損傷程度相關(guān)[6]，可能與其參與調(diào)節(jié)細胞代謝以及免疫應(yīng)答反應(yīng)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，MCD組小鼠的肝臟BATF表達明顯高于NC組，主要表達于肝臟間質(zhì)區(qū)的免疫細胞，而且，NASH組巨噬細胞表達主要以促炎的M1型巨噬細胞為主。因此，推測BATF表達增高可能與NASH肝臟內(nèi)炎癥細胞浸潤增多有關(guān)，進而共同參與NASH進展。與臨床組織學和生化指標的關(guān)聯(lián)分析顯示，BATF與肝臟組織學特征以及肝損傷的生化指標存在顯著正相關(guān)，這提示BATF可能是肝損傷的敏感生物標記，在預(yù)測NASH進展中可能具有潛在價值。