寇小妮 解新科 郝明霞 吳維 邊倩 馬文軍

NAD依賴(lài)性脫乙酰酶(Sirtuin 3，SIRT3)是一種NAD +依賴(lài)性蛋白質(zhì)脫乙?；福赏ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)多種蛋白質(zhì)的乙?；絹?lái)調(diào)節(jié)氧化代謝和氧化應(yīng)激。研究表明，長(zhǎng)期高脂肪飲食可導(dǎo)致線粒體基質(zhì)中SIRT3表達(dá)減少和高乙?；鞍譡1]。FOXO1是SIRT3調(diào)控下的重要代謝調(diào)控因子，研究表明，芳香烴受體的激活可降低SIRT3的活性，導(dǎo)致小鼠對(duì)非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的易感性增加[2]。大黃素為蓼科植物虎杖干燥根莖和根的提取物，具有良好的抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)代謝作用[3]。本研究擬基于SIRT3FXO1信號(hào)通路探討大黃素對(duì)NASH大鼠細(xì)胞損傷和肝組織炎癥的影響。為NASH的治療提供理論及臨床依據(jù)。

材料與方法

一、動(dòng)物分組

Sprague-Dawley大鼠100只，6～8周齡，體質(zhì)量(200±20)g購(gòu)自北京維塔爾河實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(北京)。根據(jù)體重隨機(jī)分成5組：對(duì)照組、模型組、大黃素低、中、高劑量組(10、20、40 mg/kg)，每組20只，雌雄各半。

二、藥物、儀器及試劑

大黃素購(gòu)自美倫生物科技有限公司。 將大黃素溶解在10% DMSO中，大鼠用藥量為成人的20.13 倍，以10 mL/kg灌胃，將藥液濃度配制成為10 g/mL。SIRT3、FXO1、AST、ALT、TNF-α、IL-6、CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9 ELISA試劑盒購(gòu)于南京森貝伽生物科技有限公司，抗SIRT3(Bioss)、抗FXO1(Santa Cruz;達(dá)拉斯，TX)、DAB顯色試劑盒購(gòu)于博士德生物工程有限公司，HematoxylinEosin Stain試劑盒(南京建城生物工程研究所)，SABC-AP試劑盒(建國(guó)生物工程研究所，南京)。

三、各實(shí)驗(yàn)組的制備

對(duì)照組大鼠采用普通動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，模型組和大黃素劑量組采用高脂(普通標(biāo)準(zhǔn)飼料82%、豬油 10%、膽固醇2%、3號(hào)膽鹽1%、蛋黃粉5%)飲食喂養(yǎng)。第12周每組處死兩只大鼠以驗(yàn)證模型。從第13周開(kāi)始，大黃素劑量大鼠每天給予10、20、40 mg/kg的大黃素灌胃，而模型組和對(duì)照組給予同等體積的蒸餾水灌胃。12周后，處死大鼠，取出肝臟以計(jì)算肝臟指數(shù)(肝臟濕重/體重≤100%)。

四、大鼠肝細(xì)胞損傷指標(biāo)的測(cè)定及肝組織病理結(jié)構(gòu)觀察

根據(jù)Brunt標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估肝臟脂肪變性，炎癥反應(yīng)和球狀樣變化及NASH活動(dòng)度積分(NAS)等病理組織學(xué)變化進(jìn)行診斷。制作常規(guī)HE切片，將切片用檸檬酸鉛和乙酸鈾酰染色10 min，并在透射電子顯微鏡下觀察。在相同的放大倍數(shù)下，隨機(jī)選擇并觀察每組中的三個(gè)樣品。

五、大鼠肝組織AST、ALT、TNF-α、IL-6水平的檢測(cè)

無(wú)菌條件操作制作肝勻漿。ELISA測(cè)定組織液中AST、ALT、TNF-α、IL-6的水平。

六、大鼠肝臟中SIRT3、FXO1 mRNA水平的測(cè)定

RNATrizol Kit(Sangon Biotech，上海)從 50 mg肝臟組織樣品中分離總RNA。瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的的完整性。并通過(guò)QuantiTect○R反轉(zhuǎn)錄試劑盒(QIAGEN GmbH; Hilden，Germany)產(chǎn)生cDNA。 cDNA的擴(kuò)增通過(guò)QuaniNovaTMSYBR○RGreenPCR試劑盒(QIAGEN)在ABI 7 500上進(jìn)行。將SIRT3、FXO1 mRNA的表達(dá)水平歸一化為GAPDH mRNA后，通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)RNA表達(dá)。

七、SIRT3、FXO1蛋白水平測(cè)定

通過(guò)免疫組化法檢測(cè)SIRT3、FXO1在肝臟組織中的表達(dá)。在400放大倍數(shù)下，隨機(jī)選擇五個(gè)不同的顯微鏡視野。以高放大倍數(shù)觀察500個(gè)細(xì)胞。在至少五個(gè)視野中使用半定量方法對(duì)染色的組織切片進(jìn)行評(píng)分。

八、大鼠肝臟中CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9蛋白水平測(cè)定ELISA法測(cè)定組織液中CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9的水平。

九、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、大黃素對(duì)肝細(xì)胞損傷指標(biāo)的影響

與對(duì)照組比較，大黃素各劑量組脂肪變積分、炎癥壞死灶積分、氣球樣變積分、NAS 積分升高(P<0.05)；與模型組比較，大黃素各劑量組脂肪變積分、炎癥壞死灶積分、氣球樣變積分、NAS 積分降低，且隨著大黃素給藥劑量的增加，脂肪變積分、炎癥壞死灶積分、氣球樣變積分、NAS 積分逐漸降低，劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯(P<0.05)。見(jiàn)表1。

二、大黃素對(duì)大鼠肝組織炎癥指標(biāo)的影響

與對(duì)照組比較，大黃素各劑量組AST、ALT、TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05)；與模型組比較，大黃素各劑量組AST、ALT、TNF-α、IL-6水平降低，且隨著大黃素給藥劑量的增加，AST、ALT、TNF-α、IL-6水平逐漸降低，劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯(P<0.05)。見(jiàn)表2。

三、 大黃素對(duì)各組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)的影響

圖1可見(jiàn)，對(duì)照組肝臟細(xì)胞細(xì)胞完整，單層索狀排列圍繞中央靜脈放射狀分布，結(jié)構(gòu)正常，染色清晰，核呈卵圓形位于中央膠，在肝臟細(xì)胞間質(zhì)及血管周?chē)?jiàn)少量亮綠色膠原纖維。模型組可見(jiàn)大量脂肪變性及壞死肝臟細(xì)胞，排列紊亂，且細(xì)胞脫失現(xiàn)象明顯，細(xì)胞核固縮，肝臟纖維化明顯，間質(zhì)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原纖維明顯增加。大黃素高劑量組幾乎無(wú)脂肪變性，見(jiàn)少量壞死肝臟細(xì)胞，綠色膠原纖維較模型組而言明顯減少；大黃素中、低劑量組較模型組而言，壞死肝臟細(xì)胞減少，仍可見(jiàn)脂肪變性，但綠色膠原纖維依然明顯存在，具有明顯的劑量依賴(lài)效應(yīng)。

四、大黃素對(duì)大鼠肝臟組織SIRT3、FXO1 mRNA及其蛋白表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組比較，大黃素各劑量肝臟組織SIRT3、FXO1 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)；與模型組比較，大黃素各劑量肝臟組織SIRT3、FXO1 mRNA表達(dá)水平升高，且隨著大黃素組給藥劑量的增加，肝臟組織SIRT3、FXO1 mRNA表達(dá)水平逐漸升高，劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯(P<0.05)。

與對(duì)照組比較，大黃素各劑量肝臟組織SIRT3、FXO1 蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；與模型組比較，大黃素各劑量肝臟組織SIRT3、FXO1 蛋白表達(dá)水平升高，且隨著大黃素組給藥劑量的增加，肝臟組織SIRT3、FXO1 蛋白表達(dá)水平逐漸升高，劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯(P<0.05)。免疫組化結(jié)果顯示，SIRT3、FXO1陽(yáng)性表達(dá)為棕褐色，各組SIRT3、FXO1陽(yáng)性表達(dá)情況與各蛋白表達(dá)水平符合。見(jiàn)表3，圖2、3。

表1 大黃素對(duì)肝細(xì)胞損傷指標(biāo)的影響(分，±s)

表2 大黃素對(duì)大鼠肝組織炎癥指標(biāo)的影響(±s)

圖1 大黃素對(duì)各組大鼠肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響(HE. 400) A: 對(duì)照組;B: 模型組;C-E: 大黃素組低、中、高劑量組

六、大黃素對(duì)各組大鼠肝臟組織凋亡因子水平的影響

與對(duì)照組比較，大黃素各劑量肝臟組織CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9表達(dá)水平升高(P<0.05)；與模型組比較，大黃素各劑量肝臟組織CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9表達(dá)水平降低，且隨著大黃素組給藥劑量的增加，肝臟組織CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9表達(dá)水平逐漸降低，劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯(P<0.05)。見(jiàn)表4。

討 論

大黃是傳統(tǒng)中草藥，廣泛用于治療胰腺炎、膽囊炎、急性腹腔綜合征和其他炎癥性疾病[4]。大黃素是大黃的一種蒽醌元素(樹(shù)脂6-甲基-1,3,8-三羥基蒽醌)，具有抗炎、抗氧化作用。研究發(fā)現(xiàn)，大黃素可改善大鼠腸系膜微循環(huán)障礙，能降低炎癥因子的表達(dá)，保護(hù)重癥急性胰腺炎的腸功能，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制NF-κB活化和黏附分子的表達(dá)[5-6]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，大黃素各劑量組脂肪變積分、炎癥壞死灶積分、氣球樣變積分、NAS 積分、AST、ALT、TNF-α、IL-6水平降低。病理結(jié)果顯示，大黃素高劑量組幾乎無(wú)脂肪變性，見(jiàn)少量壞死肝臟細(xì)胞，綠色膠原纖維較模型組明顯減少；大黃素中、低劑量組與模型組比較，壞死肝臟細(xì)胞減少，仍可見(jiàn)脂肪變性，但綠色膠原纖維依然明顯存在，具有明顯的劑量依賴(lài)效應(yīng)。說(shuō)明大黃素能降低肝臟細(xì)胞炎性反應(yīng)進(jìn)而減輕NASH大鼠肝細(xì)胞損傷程度。

表3 大黃素對(duì)各組大鼠肝臟組織SIRT3、FXO1 mRNA及其蛋白表達(dá)水平的影響(±s)

圖2 大黃素對(duì)各組大鼠肝臟組織SIRT3蛋白表達(dá)水平的影響(免疫組化，400) A: 對(duì)照組;B: 模型組;C-E: 大黃素組低、中、高劑量組

圖3 大黃素對(duì)各組大鼠肝臟組織FXO1蛋白表達(dá)水平的影響(免疫組化，400) A: 對(duì)照組;B: 模型組;C-E: 大黃素組低、中、高劑量組

組別鼠數(shù)CASPASE-3CASPASE-6CASPASE-9對(duì)照組20139.46±5.57145.77±6.4647.13±15.95模型組20179.75±7.37267.86±6.98187.66±9.47大黃素組 10 mg/kg20169.35±8.88239.45±6.98134.14±12.74 20 mg/kg20146.31±12.76180.15±10.6963.23±10.73 40 mg/kg20142.81±9.60 119.63±12.7357.45±8.76

SIRT3是哺乳動(dòng)物sirtuin蛋白家族的成員，是酵母Sir2蛋白的同源物，具有NADP依賴(lài)的脫乙酰酶活性，可通過(guò)組蛋白和非組蛋白的乙?；{(diào)節(jié)各種蛋白質(zhì)的功能。FOXO1通過(guò)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)糖異生和糖原分解，是一種起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，其決定前脂肪細(xì)胞致力于脂肪形成。FOXO1的活性受乙?；土姿峄p轉(zhuǎn)化后的修飾方式調(diào)節(jié)。 FOXO1與DNA的結(jié)合能力通過(guò)乙?；?去乙?；{(diào)節(jié)。研究表明，人二倍體成纖維細(xì)胞中FOXO1的乙?；绞躍IRT3調(diào)節(jié)，使FOXO1脫乙?；?，增加活性，并刺激抗氧化基因如過(guò)氧化氫酶和SOD的表達(dá)，進(jìn)而減少超氧陰離子自由基、ROS水平。SIRT3也可以直接脫去乙酰型SOD并增強(qiáng)其活性。SIRT3/FOXO1/SOD信號(hào)通路在增強(qiáng)氧化應(yīng)激耐受和減少氧化應(yīng)激損傷中起重要作用。大黃素可以調(diào)節(jié)sirtuins家族成員的表達(dá)[7-8]。此外，大黃素可通過(guò)核因子k基因結(jié)合、線粒體融合蛋白二、氧化應(yīng)激、高遷移率族蛋白-等信號(hào)通路發(fā)揮肝臟保護(hù)作用。而氧化應(yīng)激是NASH發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素[9-10]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，大黃素各劑量組SIRT3、FXO1 mRNA、蛋白表達(dá)水平升高，且隨著大黃素劑量的增加，肝臟組織SIRT3、FXO1 mRNA、蛋白表達(dá)水平逐漸升高，劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯。與上述結(jié)論符合，同時(shí)也提示，大黃素能促進(jìn)SIRT3、FXO1mRNA、蛋白的表達(dá)降低肝臟細(xì)胞炎性反應(yīng)，進(jìn)而減輕NASH大鼠肝細(xì)胞損傷程度。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，大黃素能降低凋亡因子CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9的表達(dá)；而CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9也是FXO1調(diào)控下的細(xì)胞因子。說(shuō)明大黃素可能降低肝細(xì)胞凋亡進(jìn)而減輕NASH對(duì)肝細(xì)胞的損傷。

綜上所述，大黃素能促進(jìn)SIRT3、FXO1 mRNA、蛋白的表達(dá)降低肝臟細(xì)胞炎性反應(yīng)，減少肝細(xì)胞凋亡進(jìn)而減輕NASH大鼠肝細(xì)胞損傷程度。