寇小妮 解新科 郝明霞 吳維 邊倩 馬文軍
NAD依賴(lài)性脫乙酰酶(Sirtuin 3,SIRT3)是一種NAD +依賴(lài)性蛋白質(zhì)脫乙?;福赏ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)多種蛋白質(zhì)的乙?;絹?lái)調(diào)節(jié)氧化代謝和氧化應(yīng)激。研究表明,長(zhǎng)期高脂肪飲食可導(dǎo)致線粒體基質(zhì)中SIRT3表達(dá)減少和高乙?;鞍譡1]。FOXO1是SIRT3調(diào)控下的重要代謝調(diào)控因子,研究表明,芳香烴受體的激活可降低SIRT3的活性,導(dǎo)致小鼠對(duì)非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的易感性增加[2]。大黃素為蓼科植物虎杖干燥根莖和根的提取物,具有良好的抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)代謝作用[3]。本研究擬基于SIRT3FXO1信號(hào)通路探討大黃素對(duì)NASH大鼠細(xì)胞損傷和肝組織炎癥的影響。為NASH的治療提供理論及臨床依據(jù)。
Sprague-Dawley大鼠100只,6~8周齡,體質(zhì)量(200±20)g購(gòu)自北京維塔爾河實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(北京)。根據(jù)體重隨機(jī)分成5組:對(duì)照組、模型組、大黃素低、中、高劑量組(10、20、40 mg/kg),每組20只,雌雄各半。
大黃素購(gòu)自美倫生物科技有限公司。 將大黃素溶解在10% DMSO中,大鼠用藥量為成人的20.13 倍,以10 mL/kg灌胃,將藥液濃度配制成為10 g/mL。SIRT3、FXO1、AST、ALT、TNF-α、IL-6、CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9 ELISA試劑盒購(gòu)于南京森貝伽生物科技有限公司,抗SIRT3(Bioss)、抗FXO1(Santa Cruz;達(dá)拉斯,TX)、DAB顯色試劑盒購(gòu)于博士德生物工程有限公司,HematoxylinEosin Stain試劑盒(南京建城生物工程研究所),SABC-AP試劑盒(建國(guó)生物工程研究所,南京)。
對(duì)照組大鼠采用普通動(dòng)物飼料喂養(yǎng),模型組和大黃素劑量組采用高脂(普通標(biāo)準(zhǔn)飼料82%、豬油 10%、膽固醇2%、3號(hào)膽鹽1%、蛋黃粉5%)飲食喂養(yǎng)。第12周每組處死兩只大鼠以驗(yàn)證模型。從第13周開(kāi)始,大黃素劑量大鼠每天給予10、20、40 mg/kg的大黃素灌胃,而模型組和對(duì)照組給予同等體積的蒸餾水灌胃。12周后,處死大鼠,取出肝臟以計(jì)算肝臟指數(shù)(肝臟濕重/體重≤100%)。
根據(jù)Brunt標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估肝臟脂肪變性,炎癥反應(yīng)和球狀樣變化及NASH活動(dòng)度積分(NAS)等病理組織學(xué)變化進(jìn)行診斷。制作常規(guī)HE切片,將切片用檸檬酸鉛和乙酸鈾酰染色10 min,并在透射電子顯微鏡下觀察。在相同的放大倍數(shù)下,隨機(jī)選擇并觀察每組中的三個(gè)樣品。
無(wú)菌條件操作制作肝勻漿。ELISA測(cè)定組織液中AST、ALT、TNF-α、IL-6的水平。
RNATrizol Kit(Sangon Biotech,上海)從 50 mg肝臟組織樣品中分離總RNA。瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的的完整性。并通過(guò)QuantiTect○R反轉(zhuǎn)錄試劑盒(QIAGEN GmbH; Hilden,Germany)產(chǎn)生cDNA。 cDNA的擴(kuò)增通過(guò)QuaniNovaTMSYBR○RGreenPCR試劑盒(QIAGEN)在ABI 7 500上進(jìn)行。將SIRT3、FXO1 mRNA的表達(dá)水平歸一化為GAPDH mRNA后,通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)RNA表達(dá)。
通過(guò)免疫組化法檢測(cè)SIRT3、FXO1在肝臟組織中的表達(dá)。在400放大倍數(shù)下,隨機(jī)選擇五個(gè)不同的顯微鏡視野。以高放大倍數(shù)觀察500個(gè)細(xì)胞。在至少五個(gè)視野中使用半定量方法對(duì)染色的組織切片進(jìn)行評(píng)分。
與對(duì)照組比較,大黃素各劑量組脂肪變積分、炎癥壞死灶積分、氣球樣變積分、NAS 積分升高(P<0.05);與模型組比較,大黃素各劑量組脂肪變積分、炎癥壞死灶積分、氣球樣變積分、NAS 積分降低,且隨著大黃素給藥劑量的增加,脂肪變積分、炎癥壞死灶積分、氣球樣變積分、NAS 積分逐漸降低,劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯(P<0.05)。見(jiàn)表1。
與對(duì)照組比較,大黃素各劑量組AST、ALT、TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05);與模型組比較,大黃素各劑量組AST、ALT、TNF-α、IL-6水平降低,且隨著大黃素給藥劑量的增加,AST、ALT、TNF-α、IL-6水平逐漸降低,劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯(P<0.05)。見(jiàn)表2。
圖1可見(jiàn),對(duì)照組肝臟細(xì)胞細(xì)胞完整,單層索狀排列圍繞中央靜脈放射狀分布,結(jié)構(gòu)正常,染色清晰,核呈卵圓形位于中央膠,在肝臟細(xì)胞間質(zhì)及血管周?chē)?jiàn)少量亮綠色膠原纖維。模型組可見(jiàn)大量脂肪變性及壞死肝臟細(xì)胞,排列紊亂,且細(xì)胞脫失現(xiàn)象明顯,細(xì)胞核固縮,肝臟纖維化明顯,間質(zhì)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),膠原纖維明顯增加。大黃素高劑量組幾乎無(wú)脂肪變性,見(jiàn)少量壞死肝臟細(xì)胞,綠色膠原纖維較模型組而言明顯減少;大黃素中、低劑量組較模型組而言,壞死肝臟細(xì)胞減少,仍可見(jiàn)脂肪變性,但綠色膠原纖維依然明顯存在,具有明顯的劑量依賴(lài)效應(yīng)。
與對(duì)照組比較,大黃素各劑量肝臟組織SIRT3、FXO1 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05);與模型組比較,大黃素各劑量肝臟組織SIRT3、FXO1 mRNA表達(dá)水平升高,且隨著大黃素組給藥劑量的增加,肝臟組織SIRT3、FXO1 mRNA表達(dá)水平逐漸升高,劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯(P<0.05)。
與對(duì)照組比較,大黃素各劑量肝臟組織SIRT3、FXO1 蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05);與模型組比較,大黃素各劑量肝臟組織SIRT3、FXO1 蛋白表達(dá)水平升高,且隨著大黃素組給藥劑量的增加,肝臟組織SIRT3、FXO1 蛋白表達(dá)水平逐漸升高,劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯(P<0.05)。免疫組化結(jié)果顯示,SIRT3、FXO1陽(yáng)性表達(dá)為棕褐色,各組SIRT3、FXO1陽(yáng)性表達(dá)情況與各蛋白表達(dá)水平符合。見(jiàn)表3,圖2、3。
表1 大黃素對(duì)肝細(xì)胞損傷指標(biāo)的影響(分,±s)
表2 大黃素對(duì)大鼠肝組織炎癥指標(biāo)的影響(±s)
圖1 大黃素對(duì)各組大鼠肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響(HE. 400) A: 對(duì)照組;B: 模型組;C-E: 大黃素組低、中、高劑量組
與對(duì)照組比較,大黃素各劑量肝臟組織CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9表達(dá)水平升高(P<0.05);與模型組比較,大黃素各劑量肝臟組織CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9表達(dá)水平降低,且隨著大黃素組給藥劑量的增加,肝臟組織CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9表達(dá)水平逐漸降低,劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯(P<0.05)。見(jiàn)表4。
大黃是傳統(tǒng)中草藥,廣泛用于治療胰腺炎、膽囊炎、急性腹腔綜合征和其他炎癥性疾病[4]。大黃素是大黃的一種蒽醌元素(樹(shù)脂6-甲基-1,3,8-三羥基蒽醌),具有抗炎、抗氧化作用。研究發(fā)現(xiàn),大黃素可改善大鼠腸系膜微循環(huán)障礙,能降低炎癥因子的表達(dá),保護(hù)重癥急性胰腺炎的腸功能,其機(jī)制可能是通過(guò)抑制NF-κB活化和黏附分子的表達(dá)[5-6]。本研究結(jié)果顯示,與模型組比較,大黃素各劑量組脂肪變積分、炎癥壞死灶積分、氣球樣變積分、NAS 積分、AST、ALT、TNF-α、IL-6水平降低。病理結(jié)果顯示,大黃素高劑量組幾乎無(wú)脂肪變性,見(jiàn)少量壞死肝臟細(xì)胞,綠色膠原纖維較模型組明顯減少;大黃素中、低劑量組與模型組比較,壞死肝臟細(xì)胞減少,仍可見(jiàn)脂肪變性,但綠色膠原纖維依然明顯存在,具有明顯的劑量依賴(lài)效應(yīng)。說(shuō)明大黃素能降低肝臟細(xì)胞炎性反應(yīng)進(jìn)而減輕NASH大鼠肝細(xì)胞損傷程度。
表3 大黃素對(duì)各組大鼠肝臟組織SIRT3、FXO1 mRNA及其蛋白表達(dá)水平的影響(±s)
圖2 大黃素對(duì)各組大鼠肝臟組織SIRT3蛋白表達(dá)水平的影響(免疫組化,400) A: 對(duì)照組;B: 模型組;C-E: 大黃素組低、中、高劑量組
圖3 大黃素對(duì)各組大鼠肝臟組織FXO1蛋白表達(dá)水平的影響(免疫組化,400) A: 對(duì)照組;B: 模型組;C-E: 大黃素組低、中、高劑量組
組別鼠數(shù)CASPASE-3CASPASE-6CASPASE-9對(duì)照組20139.46±5.57145.77±6.4647.13±15.95模型組20179.75±7.37267.86±6.98187.66±9.47大黃素組 10 mg/kg20169.35±8.88239.45±6.98134.14±12.74 20 mg/kg20146.31±12.76180.15±10.6963.23±10.73 40 mg/kg20142.81±9.60 119.63±12.7357.45±8.76
SIRT3是哺乳動(dòng)物sirtuin蛋白家族的成員,是酵母Sir2蛋白的同源物,具有NADP依賴(lài)的脫乙酰酶活性,可通過(guò)組蛋白和非組蛋白的乙?;{(diào)節(jié)各種蛋白質(zhì)的功能。FOXO1通過(guò)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)糖異生和糖原分解,是一種起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子,其決定前脂肪細(xì)胞致力于脂肪形成。FOXO1的活性受乙?;土姿峄p轉(zhuǎn)化后的修飾方式調(diào)節(jié)。 FOXO1與DNA的結(jié)合能力通過(guò)乙?;?去乙?;{(diào)節(jié)。研究表明,人二倍體成纖維細(xì)胞中FOXO1的乙?;绞躍IRT3調(diào)節(jié),使FOXO1脫乙?;?,增加活性,并刺激抗氧化基因如過(guò)氧化氫酶和SOD的表達(dá),進(jìn)而減少超氧陰離子自由基、ROS水平。SIRT3也可以直接脫去乙酰型SOD并增強(qiáng)其活性。SIRT3/FOXO1/SOD信號(hào)通路在增強(qiáng)氧化應(yīng)激耐受和減少氧化應(yīng)激損傷中起重要作用。大黃素可以調(diào)節(jié)sirtuins家族成員的表達(dá)[7-8]。此外,大黃素可通過(guò)核因子k基因結(jié)合、線粒體融合蛋白二、氧化應(yīng)激、高遷移率族蛋白-等信號(hào)通路發(fā)揮肝臟保護(hù)作用。而氧化應(yīng)激是NASH發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素[9-10]。本研究結(jié)果顯示,與模型組比較,大黃素各劑量組SIRT3、FXO1 mRNA、蛋白表達(dá)水平升高,且隨著大黃素劑量的增加,肝臟組織SIRT3、FXO1 mRNA、蛋白表達(dá)水平逐漸升高,劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯。與上述結(jié)論符合,同時(shí)也提示,大黃素能促進(jìn)SIRT3、FXO1mRNA、蛋白的表達(dá)降低肝臟細(xì)胞炎性反應(yīng),進(jìn)而減輕NASH大鼠肝細(xì)胞損傷程度。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn),大黃素能降低凋亡因子CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9的表達(dá);而CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9也是FXO1調(diào)控下的細(xì)胞因子。說(shuō)明大黃素可能降低肝細(xì)胞凋亡進(jìn)而減輕NASH對(duì)肝細(xì)胞的損傷。
綜上所述,大黃素能促進(jìn)SIRT3、FXO1 mRNA、蛋白的表達(dá)降低肝臟細(xì)胞炎性反應(yīng),減少肝細(xì)胞凋亡進(jìn)而減輕NASH大鼠肝細(xì)胞損傷程度。