孟 芝，方向明,2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012；2.中藥復(fù)方安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)主要癥狀是反復(fù)發(fā)作的喘息、氣急、咳嗽、胸悶，發(fā)作時雙肺可聞及哮鳴音，大多數(shù)患者可自行緩解或經(jīng)平喘藥物治療緩解。平喘寧是治療寒哮的臨床經(jīng)驗方，由麻黃、半夏等11味中藥組成，可溫肺平喘、化痰止咳。本實驗觀察平喘寧干預(yù)寒哮模型，并采用實時熒光定量PCR法檢測PI3K/Akt信號通路中叉頭蛋白O1(forkhead box protein O1，F(xiàn)KHR)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、促凋亡蛋白Bad mRNA的表達水平，探討平喘寧治療哮喘的作用機制。

1 材料

1.1 動物 105只SD健康雄性大鼠，SPF級，體質(zhì)量180～200 g，6～8周齡，由安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心[生產(chǎn)許可證號為SCXK(皖)2017-001]提供。

1.2 藥品 地塞米松片(批號 015170401)：上海上藥信誼藥廠有限公司；桂龍咳喘寧膠囊(批號 180112)：桂龍醫(yī)藥(安徽)有限公司。平喘寧(由麻黃、細(xì)辛、浙貝母、陳皮、杏仁、黃芪、半夏、地龍、蘇子、太子參、防風(fēng)11味藥組成)，購自安徽中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂中藥房，飲片經(jīng)煎煮、濃縮后，制成濃度分別為1.46、0.73、0.37 g/mL的藥液，作為平喘寧高、中、低劑量組。

1.3 主要試劑 二甲苯(批號 20180310)、氯仿(批號 20161013)、異丙醇(批號 20160614)、無水乙醇(批號 20180410)：上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司；伊紅染色液(批號 718011)、蘇木素染色液(批號 718034)：Baso；Trizol(批號 90803)：Life technogies；DEPC-H2O(批號 1706G10)：Generay Biotech；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號 00519963)：Thermo Scientific。

1.4 主要儀器 生物組織自動脫水機、生物組織包埋機：湖北亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司；切片機：Leica；普通PCR儀：浙江省杭州晶格科學(xué)儀器有限公司；熒光定量PCR儀：Thermo Scientific；低速迷你離心機：江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司；高速臺式冷凍離心機：安徽嘉文儀器裝備有限公司。

2 方法

2.1 分組 隨機將105只SD健康雄性大鼠分為正常組、模型組、平喘寧高劑量組、平喘寧中劑量組、平喘寧低劑量組、桂龍咳喘寧組、地塞米松組，共7組，每組15只。

2.2 模型復(fù)制 參考文獻[1]復(fù)制寒哮模型，第1、8天，除正常組外的各組大鼠以1 mL的10%卵蛋白溶液(使用生理鹽水溶解配制)腹腔注射進行致敏，第15天，以1%卵蛋白溶液對大鼠進行霧化，誘導(dǎo)哮喘，每次30 min，同時將大鼠放入可調(diào)節(jié)寒冷箱(0～2 ℃)中，給予寒冷刺激，每次2 h，每日1次，持續(xù)7 d，正常組大鼠腹腔注射和霧化藥物均以生理鹽水代替。大鼠逐漸出現(xiàn)噴嚏、呼吸急促、咳嗽、蜷縮扎堆、反應(yīng)遲鈍、畏寒、煩躁不安、身體顫抖、食量變小、被毛凌亂無光澤、大便稀溏等現(xiàn)象，說明模型復(fù)制成功[2]。

2.3 給藥 第22天開始灌胃給藥，平喘寧高、中、低劑量組分別按14.6、7.3、3.7 g/kg進行灌胃；地塞米松組將藥片研碎溶于生理鹽水后配制成溶液，按0.4 mg/kg進行灌胃；桂龍咳喘寧組按0.4 g/kg進行灌胃。正常組和模型組灌服等容積生理鹽水。每日1次，灌胃28 d。

2.4 取材 灌胃結(jié)束后禁食24 h，以1%卵蛋白溶液再次霧化30 min，霧化后2 h內(nèi)，對大鼠進行麻醉、處死，取肺組織，分離左右肺。左肺放入甲醛中固定，右肺放入凍存管中，-80 ℃保存。

2.5 病理檢測 取出甲醛中固定好的肺組織，切成0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm大小的切塊，進行脫水、包埋、切片。然后將切片用蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色。最后中性樹膠封片，在400倍光鏡下觀察大鼠肺組織的形態(tài)學(xué)變化。

采用實時熒光定量PCR檢測Bad、FKHR、PKC mRNA的表達水平。①RNA提?。杭羧?0～100 mg肺組織，研碎，加入1 mL TRIzol裂解組織，然后離心去除未完全裂解的組織；加入0.2 mL氯仿，離心，取上清液；加入0.5 mL異丙醇，棄上清液；加1 mL 75%乙醇，棄上清液；室溫放置30 min，加20～50 μL焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate，DEPC)水, 55 ℃下促溶10 min，-80 ℃保存。②RT反應(yīng)：1 μg RNA、10 μmol/L Oligo(dT)1 μL、DEPC水補足至12 μL，點動離心；在PCR儀上65 ℃加熱5 min，冰浴3 min；加5×反應(yīng)緩沖液4.0 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL、Revert AidTMM-MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶 1 μL、RibolockTMRNA酶抑制劑1 μL，PCR儀上42 ℃加熱60 min，70 ℃ 5 min；上述反應(yīng)液即為cDNA，-80 ℃保存。③PCR反應(yīng)：cDNA作為熒光定量模板，反應(yīng)體系2×SYBR Green mixture 5 μL、10 μmol/L正向引物(見表1)1 μL、10 μmol/L反向引物(見表1)1 μL、cDNA 1 μL、去RNA酶水2 μL，反應(yīng)條件為95 ℃ 2 min，95 ℃ 5 s、60 ℃ 10 s，共40個循環(huán)。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(見表1)，計算方法為2-ΔΔCt。

表1 實時熒光定量PCR引物

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠肺組織病理變化比較 正常組大鼠肺組織無明顯炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管結(jié)構(gòu)基本完整，管壁無明顯增厚。模型組大鼠支氣管結(jié)構(gòu)明顯紊亂，管壁明顯增厚，氣道上皮細(xì)胞脫落，有炎癥細(xì)胞浸潤，黏膜充血。藥物治療組大鼠肺組織病理變化均有所改善，其中平喘寧高、中劑量組改善程度優(yōu)于平喘寧低劑量組。見圖1。

注:A.正常組;B.模型組;C.平喘寧高劑量組;D.平喘寧中劑量組;E.平喘寧低劑量組;F.地塞米松組;G.桂龍咳喘寧組

圖1各組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色，10×40倍)

3.2 各組大鼠肺組織PKC、Bad、FKHR mRNA表達水平比較 與正常組比較，模型組PKC mRNA表達水平顯著增高(P<0.05)，Bad mRNA、FKHR mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，各藥物治療組PKC mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，Bad mRNA、FKHR mRNA表達水平顯著增高(P<0.05)；平喘寧對PKC、Bad、FKHR mRNA表達的效應(yīng)具有劑量依賴性，在降低肺組織PKC mRNA表達水平，升高FKHR、Bad mRNA表達水平方面，平喘寧高劑量作用最優(yōu)(P<0.05)；地塞米松組與平喘寧高劑量組Bad mRNA表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但地塞米松組大鼠體形消瘦，狀態(tài)萎靡，不良反應(yīng)較明顯。見表2。

表2 各組大鼠肺組織PKC、Bad、FKHR mRNA相對表達水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與地塞米松組比較，△P<0.05；與桂龍咳喘寧組比較，◇P<0.05；與平喘寧低劑量組比較，□P<0.05；與平喘寧中劑量組比較，○P<0.05

4 討論

哮喘是常見的慢性病之一，是由細(xì)胞組分和多種細(xì)胞(如嗜酸粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞)參與的氣道慢性炎癥性疾病。其發(fā)病機制主要與氣道重構(gòu)、氣道免疫-炎癥機制、神經(jīng)調(diào)節(jié)機制、氣道高反應(yīng)性有關(guān)。哮喘發(fā)作受飲食、藥物和環(huán)境等多因素影響，且具有遺傳傾向。中醫(yī)認(rèn)為哮喘的主要病理因素是“痰”，因多種因素引動“伏痰”而發(fā)病，是哮喘發(fā)作的“夙根”。

平喘寧是治療寒哮的經(jīng)驗方，由三子養(yǎng)親湯和射干麻黃湯加減而來。其中麻黃發(fā)汗解表、宣肺平喘，主要成分麻黃堿能緩解氣管平滑肌的痙攣，解熱、發(fā)汗、鎮(zhèn)咳平喘[3-4]；苦杏仁是治咳喘要藥，能降肺氣、止咳平喘，此外還有調(diào)節(jié)免疫功能的作用[5]；陳皮理氣化痰，有祛痰平喘、擴張支氣管血管作用[6]；浙貝母化痰散結(jié)，可止咳祛痰、松弛平滑肌[7]；防風(fēng)祛風(fēng)止痙，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其還有抗炎、抗過敏作用[8]；細(xì)辛溫肺化痰，其主要成分能減輕支氣管痙攣[9]；黃芪、太子參補脾肺之氣，可增強機體免疫力[10-11]；半夏健脾化痰，所含的生物堿和有機酸具有鎮(zhèn)咳、祛痰等藥理作用[12]；地龍可解痙通絡(luò)、清肺平喘，有研究發(fā)現(xiàn)地龍還有逆轉(zhuǎn)和防治氣道重構(gòu)的作用[13]；蘇子降肺氣、化痰涎，有鎮(zhèn)咳、平喘等藥理作用[14]。全方以溫肺平喘、止咳化痰藥為主，以理氣補虛藥為輔，升降相宜，標(biāo)本兼治，配伍精煉。功能溫肺化痰，止咳平喘，主治寒哮證。

PI3K/Akt通路在細(xì)胞的分化、增殖、凋亡等方面有重要作用[15]。PI3K被激活后，產(chǎn)生PIP3，PIP3能夠激活A(yù)kt，Akt活化后可以調(diào)控下游蛋白，對細(xì)胞生長、凋亡進行調(diào)節(jié)[16]。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號通路阻斷后，可以抑制氣道結(jié)構(gòu)改變，減少炎癥細(xì)胞浸潤及減輕氣道高反應(yīng)，改善哮喘癥狀[17]。Bad是促凋亡蛋白，屬Bcl-2家族成員，可與Bcl-2或Bcl-xl結(jié)合促進細(xì)胞凋亡，而磷酸化的Bad(p-Bad)不再發(fā)揮促凋亡作用。Akt是Bad激酶之一，能夠磷酸化Bad，阻斷Bad促細(xì)胞凋亡功能[18]。孫磊明[19]研究表明，p-Bad相對含量與氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cells，ASMCs)凋亡負(fù)相關(guān)，而ASMCs凋亡減少參與哮喘氣道重塑。FKHR屬FOXO(forkhead box,class O)家族，可以激活細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)節(jié)因子P27來調(diào)控細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增生；還可以上調(diào)FasL、Bim、TRAIL等促凋亡因子的表達，促進細(xì)胞凋亡[20]，F(xiàn)KHR受PI3K/Akt的負(fù)向調(diào)控，Akt可以磷酸化FKHR，使其無法發(fā)揮其功能[21]。研究表明，F(xiàn)KHR可以抑制肺癌細(xì)胞周期并能促進癌細(xì)胞的凋亡[22-23]。PKC是一種多功能蛋白，在細(xì)胞中大多無活性，激活后可以調(diào)控細(xì)胞的增殖分化和凋亡，促進炎癥因子釋放。有研究表明，PKC對氣道平滑肌的增值、分化具有重要作用[24]，PKC表達降低能夠減輕哮喘大鼠的氣道炎癥[25]，PKC還可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞因子平衡，減輕氣道炎癥，改善哮喘[26]。

本實驗結(jié)果顯示，平喘寧高劑量組對PKC、FKHR、Bad mRNA的作用較其他組明顯。結(jié)果表明，平喘寧能夠調(diào)控信號通路PI3K/Akt中PKC、FKHR、Bad的表達水平，使肺組織炎癥浸潤減少，氣道平滑肌增殖得到抑制，減輕炎癥反應(yīng)和氣道重塑，從而治療哮喘。